項(xiàng)目模塊5：高效液相色譜法簡(jiǎn)介.中職課件電子教案

項(xiàng)目模塊5：高效液相色譜法簡(jiǎn)介專題項(xiàng)目1：高效液相色譜法基本原理一、高效液相色譜法概述1、高效液相色譜法簡(jiǎn)介高效液相色譜（HPLC）是指流動(dòng)相為液體的技術(shù)。早期的液相色譜（經(jīng)典液相色譜）是將小體積的試液注入色譜柱上部，然后用洗脫液（流動(dòng)相）洗脫。高效液相色譜法，成為一種高效、快速的分離技術(shù)。高效液相色譜法在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送;色譜柱是以特殊的方法填料填充，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。2、高效液相色譜發(fā)展歷史二、高效液相色譜法的特點(diǎn)1、高壓；2、高速；3、高效；4、高靈敏度；5、適應(yīng)范圍寬。氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析；高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣虼瞬皇茉嚇訐]發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大的有機(jī)物原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來進(jìn)行分離、分析。三、高效液相色譜法的主要類型通常所說的液相色譜法僅指所用固定相為柱型的柱液相色譜法。通常將液相色譜法按分離機(jī)理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。1、液-固吸附色譜法流動(dòng)相為液體，固定相為劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行分離的。液-固吸附色譜法適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油性試樣，對(duì)具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高的選擇性。2、液-液分配色譜法及化學(xué)鍵合相色譜流動(dòng)相和固定相都是液體。從理論上說，流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶，有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。在液-液色譜法中，對(duì)于親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性，這種情況稱為正相液-液色譜法。反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液-液色譜法。液-液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失導(dǎo)致保留行為的變化，柱效和分離選擇性變壞等不良后果?；瘜W(xué)鍵合固定相，不僅用于反相色譜法、正相色譜法，還用于離子色譜法、離子對(duì)色譜法等色譜技術(shù)上。其中特別是反相化學(xué)鍵合相色譜法，由于操作系統(tǒng)簡(jiǎn)單，色譜分離過程穩(wěn)定，加之分離技術(shù)靈活多變，已經(jīng)成為高效液相色譜法中應(yīng)用最廣泛的一個(gè)分支。四、液相色譜法固定相、流動(dòng)液1、液—液色譜法及離子對(duì)色譜法固定相這類固定相是在擔(dān)體上涂漬一層固定液構(gòu)成，或使用化學(xué)鍵合相。（1）擔(dān)體①全多孔型擔(dān)體；

②表層多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）。這種擔(dān)體目前應(yīng)用較為普遍。（2）固定液液-液色譜固定相采用機(jī)械涂制的方法，將固定液涂附在上述擔(dān)體上，以組成固定相。

（3）化學(xué)鍵合固定相硅膠表面十八烷基鍵合相硅氧硅碳鍵型(≡Si－O－Si－C)，它的化學(xué)鍵穩(wěn)定，耐水、耐熱、耐有機(jī)溶劑，是液相色譜應(yīng)用廣泛的固定相?；瘜W(xué)鍵合固定相的分離機(jī)制不是全部吸附過程，亦不是典型的液-液分配過程，而是雙重機(jī)制兼而有之。2、液－固吸附色譜法固定相采用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等，仍可分為全多孔性和薄殼型兩種，其特點(diǎn)如前所述。目前較常使用的是5～10μm的硅膠微粒（全多孔型）。3、液相色譜法流動(dòng)相選擇流動(dòng)相（又稱為：淋洗液，洗脫劑）時(shí)應(yīng)注意下列幾個(gè)因素。（1）流動(dòng)相純度。一般采用色譜純?cè)噭匾獣r(shí)需要進(jìn)一步純化，以除去有干擾的雜質(zhì)。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用，使柱效下降或損壞柱子。（3）對(duì)試樣要有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）溶劑的粘度小些為好。（5）應(yīng)與檢測(cè)器相匹配。在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。除此之外有時(shí)還需要采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相，以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。專題項(xiàng)目2：高效液相色譜儀典型的高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)和流程可用如下圖所示。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、脫氣器、高壓輸液泵、梯度洗提裝置、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、工作站等主要部件。一、貯液器貯液器用于存放溶劑。貯液器應(yīng)配有溶劑過濾器，以防止流動(dòng)相中的顆粒進(jìn)入泵內(nèi)。二、脫氣裝置為了消除氣泡對(duì)液相色譜分析結(jié)果的影響，在線脫氣機(jī)接于HPLC的流動(dòng)相貯液器與高壓譜泵之間。三、高壓輸液泵高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。1、對(duì)輸液泵的基本要求（1）流量準(zhǔn)確可調(diào)。（2）耐高壓。（3）液流穩(wěn)定。（4）泵的死體積小，泵的結(jié)構(gòu)材料應(yīng)耐化學(xué)腐蝕。2、高壓輸液泵的分類輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。其中恒流泵的應(yīng)用更廣泛。輸液泵按工作方式分為氣動(dòng)泵和機(jī)械泵兩大類。（1）活塞型往復(fù)泵

活塞型往復(fù)泵是液相色譜儀中使用最廣泛的一種恒流泵。(2)隔膜型往復(fù)泵隔膜型往復(fù)泵也是一種恒流泵。單活塞往復(fù)泵示意圖雙活塞往復(fù)泵示意圖隔膜型往復(fù)泵示意圖四、梯度洗脫裝置1、進(jìn)行梯度洗脫的原因類似于氣相色譜中的程序升溫。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。

3、梯度洗脫裝置

線性梯度：在某一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動(dòng)相強(qiáng)度。

階梯梯度：直接從某一低強(qiáng)度的流動(dòng)相改變?yōu)榱硪惠^高強(qiáng)度的流動(dòng)相。梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的輸送就是要將幾種組成的溶液混合后送到分離系統(tǒng)。高壓梯度：一般只用于二元梯度，即用兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀態(tài)下進(jìn)行混合的。低壓梯度：只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。五、進(jìn)樣裝置進(jìn)樣器要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好，進(jìn)樣時(shí)引起色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動(dòng)要很小。現(xiàn)在的液相色譜儀所采用的手動(dòng)進(jìn)樣器幾乎都是耐高壓、重復(fù)性好和操作方便的六通閥進(jìn)樣器。液相色譜進(jìn)樣針類似于氣相色譜進(jìn)樣針，只是其針頭為平頭。

操作時(shí)先將閥柄置于采樣位置（Load），用平頭微量注射器（體積應(yīng)約為定量管體積的3～5倍）注入樣品溶液，樣品停留在定量管中，多余的樣品溶液從流出通道處溢出。將進(jìn)樣器閥柄順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)60度進(jìn)樣位置（Inject）時(shí)，流動(dòng)相與定量管接通，樣品被流動(dòng)相帶到色譜柱中進(jìn)行分離分析。六、色譜柱色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。色譜柱的管外都以箭頭顯著地標(biāo)示了該柱的使用方向，安裝和更換色譜柱時(shí)一定要使流動(dòng)相能按箭頭所指方向流動(dòng)。色譜柱的正確使用和維護(hù)：（1）避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。（2）應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。?）一般說來色譜柱不能反沖，反沖會(huì)迅速降低柱效。（4）選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。（5）避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品直接注入柱內(nèi)。（6）經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。（7）保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。（8）色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。一般在色譜柱前要求安裝保護(hù)柱，可以經(jīng)常而且方便地更換，起到保護(hù)延長(zhǎng)分析柱壽命的作用。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4--5天開機(jī)沖洗15分鐘。七、檢測(cè)器檢測(cè)器是用來連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。HPLC檢測(cè)器應(yīng)滿足下列要求:①具有高靈敏度和可預(yù)測(cè)的響應(yīng)；②對(duì)樣品所有組分都有響應(yīng)，或具有可預(yù)測(cè)的特異性，適用范圍廣；③溫度和流動(dòng)相流速的變化對(duì)響應(yīng)沒有影響；④響應(yīng)與流動(dòng)相的組成無關(guān)，可作梯度洗脫；⑤死體積小，不造成柱外譜帶擴(kuò)展；⑥使用方便、可靠、耐用，易清洗和檢修；⑦響應(yīng)值隨樣品組分量的增加而線性增加，線性范圍寬；⑧不破壞樣品組分；⑨能對(duì)被檢測(cè)的峰提供定性和定量信息；⑩響應(yīng)時(shí)間足夠快。1、紫外-可見光檢測(cè)器紫外-可見光檢測(cè)器的基本結(jié)構(gòu)與一般紫外-可見光分光光度計(jì)是相同的，包括光源、分光系統(tǒng)、試樣室和檢測(cè)系統(tǒng)四大部分。紫外可見吸收檢測(cè)器光路圖2、光電二極管陣列檢測(cè)器以光電二極管陣列作為檢測(cè)元件的紫外可見吸收檢測(cè)器。它可構(gòu)成多通道并行工作，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的