多系統(tǒng)萎縮患者TCRα鏈CDR3譜系的熒光定量PCR溶解解讀

TCRa鏈CDR3PCR溶解作者：田丹，孫永萍,湯賢英,馬銳研室，貴州遵義563003

作者單位：1.遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教PCR1例多系統(tǒng)萎縮TCRa鏈CDR311(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA32TCRa鏈胚系可變區(qū)基因家族(TRAV)TCRa(TRAC)設(shè)計下游引物，熒光定量PCR(FQPCR32個TRAVSCDR3譜系，溶解曲線法分析各家族CDR3譜系的單、寡、多克隆增生，挑選單克隆進(jìn)行PCRT增，擴(kuò)增產(chǎn)物行普通瓊脂糖PBMC32個TCRaTRAV家族CDR3FQPCR產(chǎn)物的各家族相對定量表達(dá)不一；正常人的32TCRa鏈TRAV家族CDR3TRAV10TRAV15TRAV29CDR3譜型的溶解曲線表現(xiàn)為單峰的克隆性增生，其他家族為多峰、寡峰TRAV15家族的測序得到的CDR3氨基酸組成為：SAIYFCAEDRDSTLTF結(jié)論：該多系統(tǒng)萎縮患者的PMBC中，存在TCRa鏈CDR3譜系漂移。【關(guān)鍵詞】多系統(tǒng)萎縮，，熒光定量PCR溶解曲線[Abstract]Objective:ToanalyzeCDR3spectratypeofTCRalphageneinperipheralbloodmonouclearcells(PBMC)ofonepatientwithmultiplesystematrophy(MSA)byusingDNAmeltingcurvetechniquewithrealtimefluoresceneequantitativepolymerasechainreaction.Methods:TotalRNAfromPBMCofahealthydonorandaMSApatientweretranscriptedreverselyintocDNArespectively.Theforwardprimersweredesignedaccordingtothe32humanTRAVgenefamilies,andthereverseprimersdesignedaccordingtoTRAC.FQPCRwascarriedouttoamplifyCDR3spectratypingofthe32humanTRAVgenefamilies(HTGF),andthemonoclonal/oligoclonal/polyclonalCDR3wereanalyzedwithDNAmeltingcurves.MonoclonalTcellsofTRAVfamilieswereamplifiedandsequeneed.Results:TheFQ PCRproductsofHTGFoftheMSApatientweredifferentfromthoseofnormalpeople.The32HTGFmeltingcurvesofnormalpeopleshowedGaussiandistributionwithseveralpeaks,whilethoseoftheMSApatientshowedmonopeakcloningincreaseinTRAV10,TRAV15,andTRAV29genefamilies,andmultipeak/oligpeakmultclone/oligeloneincreaseinothergenefamilies.Nodeletionfamilywasfound.TheCDR3aminoacidsequeneeofTRAV15whichshowedmonopeakwastotheDNAsequeneeobtained.inferredasSAIYFCAEDRDSTLTFGaccordingConclusion:TheremightbespectratypingdriftinCDR3onTCRalphachaininPBMCofMSApatient.［Keywords］multiplesystematrophy;complementaritydeterminingregions;realtimefluoresceneequantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction;meltingcurve多系統(tǒng)萎縮(multiplesystematrophy,MSA是一組原因未明成年起病的神經(jīng)系統(tǒng)多個部位相繼進(jìn)行性萎縮的疾病或綜合征。由于該病患病率較低，癥狀與帕金森綜合征、震麻痹癥等神經(jīng)病癥相似，早期明確診斷比較困難，目前也尚無特異性的治療方法，臨床對癥治療為主，患者預(yù)后較差 ［1，2］。目前，多系統(tǒng)萎縮的相關(guān)研究主要集中在分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)病理學(xué)領(lǐng)域，而在免疫學(xué)方面少見研究報道［3］。近年來，TCRCDR譜型的免疫指紋技術(shù)在病毒感染、腫瘤、自身免病的研究中得到了較為廣泛的應(yīng)用 ，但受到較多關(guān)注的是TTCRB鏈CDR3譜系的研究，而TCRa［4］。前期研究中已建立TCRaBCDR3技術(shù)”，并對1MSA患者外周血TCRB鏈CDR3I［5?8］?，F(xiàn)擬通過對該例患者TCRa32CDR3譜系進(jìn)行分析，初步探討TCRaCDR3I系的變化及這種變化在MSA疾病過程中的可能意義，為進(jìn)一步增加病例樣本的研究提供基礎(chǔ)。材料和方法研究樣本及細(xì)胞株1例多系統(tǒng)萎縮患者，按多系統(tǒng)萎縮臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)確診［8］?；颊咄庵苎?，來源于遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；對照樣本為正常志愿者外周血。對照子宮頸癌細(xì)胞株(JEC)遵義醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供。試劑總RNA(TIANGENcDNA合成kit(MBI,Fermentas)，RealtimePCRMasterMix(TOYOBO等。引物設(shè)計與合成參照文獻(xiàn)［5?7］TCRAV3234條(TRAV1和TRAV42個亞家族)TCRAC1GAPDinvitrogen英駿生物技術(shù)有限公司合成。RNA提取和cDNA合成分別采集多系統(tǒng)萎縮患者和正常人外周血5ml,按密度梯度離心法分離PBMC,按總提取試劑盒操作，提取JEC細(xì)胞1例多系統(tǒng)萎縮患者和1例正常人外周血單個核纟田胞(peripheralbloodmononuclearcell ，PBMC)(2<106)RNAcDNAkit條件，用OligodT引物逆轉(zhuǎn)錄制備cDNATRAV家族CDR：cDNAFQPCF擴(kuò)增36個PCF1?34管分別加入TRAV1至TRAV321游弓I11(10mmol/L,TRAV1和TRAV42個亞家族)，1?34管每管加入TRACT1l35管加GAPD36管為無引物的陰性對照管；每個PCR1lMix10l7l20l;標(biāo)準(zhǔn)曲線JECGAPD表達(dá)量為相對量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行PCR反應(yīng)條件：(1)94C3min，1cycles;94C30sec，55C30sec，72C50sec，45cycles;72C10min，1cycles;(2)溶解曲線分析：75?95C0.2C/s讀取熒光值，100cycles;(3)溶解曲線分析后的PCRT(1)45cycles5cyclesPCR8lPCR1.5%-20C保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物序列分析反應(yīng)體系：TRAV15FQPCR^2l，加入TRAV15±2l(10mmol/L)TRACT2l，TaqDNAPolymerase0.25卩l(xiāng)，2mmol/LdNTP5卩l(xiāng)，10倍BufferwithKCL，MgCl25卩l(xiāng)，25mmol/LMgCl23卩l(xiāng)，DDW30.75卩l(xiāng)，總體積50卩l(xiāng)。反應(yīng)條件：95C2min，1cycles;95C30sec，1min，35cycles;72C10min，1cycles2結(jié)果

60C1min，72CPBMC32個TCRaTRAV家族CDR3FQPCR產(chǎn)物溶解曲線峰圖均為多克隆的高斯分布(1)?；颊逷BM32個TCRaTRAVCDR3譜型的FQPCR產(chǎn)物的各家族溶解曲線峰圖中的TRAV10TRAV15TRAV29隆和寡克隆增生峰圖，未出現(xiàn)缺失的家族(2)。對患者所出現(xiàn)的TRAV15寡克隆性的PCR，CDR3區(qū)的基因序列：TCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGGATAGAGACAGCACCCTCACCTTTGGGACAGGGGACTAT(3);翻譯后相應(yīng)的CDR區(qū)氨基酸序列：SAIYFCAEDRDSTLT8(1)3討論MSA11969常、慢性病毒感染、神經(jīng)元凋亡、少突膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)包注：呈現(xiàn)單峰的家族為：TRAV10TRAV15TRAV29;對照涵體等導(dǎo)致的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)多系統(tǒng)變性［1?3］。在免疫學(xué)方面的研究，Hiroyuki［9］等認(rèn)為白介素la、白介素8、細(xì)胞黏附因子［MSA勺發(fā)病有相關(guān)性。隨著TCR在獲得性免疫應(yīng)答中的不斷深入研究，目前發(fā)現(xiàn)每個 T細(xì)胞有著TCRCDR分子，不同TCDR3(不同長度)，從CDR3基因譜型，CDRTCR的特異性，或者說，CDR湘當(dāng)于TCDR的頻率變化(譜系漂移)T細(xì)胞克隆擴(kuò)增的程度，從而反映T細(xì)胞功能狀態(tài)。本研究組目前已建立了監(jiān)測人TCRa鏈和B鏈CDR3譜系免疫掃描譜型分析技術(shù)和熒光定量溶解曲線分析技術(shù),對多例白血病、圖3患者TRAV15家族CDR3X測序結(jié)果表1患者TCRAV15家族CDR區(qū)測序結(jié)果翻譯后的氨基酸序列大腸癌等患者進(jìn)行了 TCRCDR3［57］。MSA患者PBMPBMC勺32個TCRa鏈TCRAV家族CDR3f型的 產(chǎn)物的各家族相對定量表達(dá)不一，其中TRAV10TRAV15TRAV29家族表現(xiàn)為單克隆增生，其他家族多克隆和寡克隆，未出現(xiàn)缺失的家族，正常人的 TCRa鏈CDR3I型熒光定量PCR溶解曲線為高斯分布⑹。對單克隆增生的TRAV15V的CDR3區(qū)的基因序列：TCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGGATAGAGACAGCACCCTCACCTTTGG翻CDR宓氨基酸序列：SAIYFCAEDRDSTLTFGRAV1CTRAV292個單克隆增生家族的PCF純度和寡克隆干擾相關(guān)。以上結(jié)果提示該MSAt者TCRa鏈CDR列能存在譜系漂移。由于這種病例較為少見，本研究僅獲得1MSAtTCRaCDR3譜系研究資料，進(jìn)一步研究將擴(kuò)大樣本量，探討漂移家族TCDR3的作用，為該疾病尋找新的輔助診斷指標(biāo)及指導(dǎo)臨床對患者的個性化治療提供依據(jù)【參考文獻(xiàn)】［1］王博，張朝東，李昭，等.多系統(tǒng)萎縮的臨床特征與疾病進(jìn)展的特點(diǎn)［J］.神經(jīng)病學(xué)雜志，2007(6):407-410.［2］趙景禮.多系統(tǒng)萎縮的回顧與進(jìn)展［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2000(6):377-378.［3］莊柏翔.多系統(tǒng)萎縮基礎(chǔ)及臨床研究［J］.中國醫(yī)師進(jìn)修雜志,2006(8);10-12.［4］姚新生.TCRB鏈CDR3I［J］.國際免疫學(xué)雜志，2007⑷：240-243.[5]等.TCRCDR3定[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志，2006(6)571-573.⑹等?PCRaCDR3[J].中國免疫學(xué)雜志，2009(8):