四川大學酶工程酶學概論

第七節(jié)

別構酶及其反應動力學

一．概念：

C:CatalyticsubunitR:Regulatorysubunit

由多個亞基組成的，分子中除結合底物并催化底物轉化的活性部位外，還有結合別構效應物（別構配體）的部位。這兩個部位位于不同亞基上，也可能位于同一亞基的不同部位。別構配體與酶結合后，可改變酶分子亞基間的結合狀態(tài)（疏松或緊密），從而影響酶對底物的結合及酶的催化能力（正或負）。二．分類：1．根據別構效應物（調節(jié)物）的不同①同促效應別構酶（同種協(xié)同效應別構酶）：調節(jié)物為酶催化的底物分子。②異促效應別構酶（異種協(xié)同效應別構酶）：調節(jié)物不為底物分子。③兼有同促-異促效應別構酶：效應物多，別構部位可能不止一個。體內數(shù)量較多，可以受底物、產物或中間代謝物的影響。

2．根據協(xié)同效應效果:①正協(xié)同效應酶：一分子的別構效應物與酶結合后，促進酶對后一個別構效應物的結合；②負協(xié)同效應酶：一分子的別構效應物與酶結合后，抑制酶對后一個別構效應物的結合。三．結構特點：1，有多個亞基，以非共價的方式結合在一起。2，具有四級結構。3，酶除了具有可以結合底物的活性中心外，還有可以結合效應劑的別構中心（或者稱為調節(jié)中心）。這兩個中心可能位于酶蛋白的不同亞基上，也可能位于同一個亞基的不同部位上。4，別構酶的活性中心用于結合底物和催化反應，而別構中心則主要是用于調節(jié)酶促反應的速度。5，有時因物理或者化學的變化（如加熱、冷凍、尿素等處理），酶會失去對效應物的敏感性，但是催化活性并未失去。這種脫敏的酶表現(xiàn)出正常的雙曲線動力學特征。四．動力學特征:(一）米氏作圖：具正、負協(xié)同效應和米氏動力學特征的酶的動力學曲線1．米氏動力學特征酶；2．正協(xié)同效應酶；3．負協(xié)同效應酶（二）雙倒數(shù)作圖：

具正、負協(xié)同效應和米氏動力學特征的酶的雙倒數(shù)圖1．米氏動力學特征酶；2．正協(xié)同效應酶；3．負協(xié)同效應酶

五．別構效應類型的判斷：（1）動力學作圖法：（2）協(xié)同指數(shù)：Rs（3）Hill系數(shù)：n=1,無協(xié)同效應n>1,正協(xié)同效應n<1,負協(xié)同效應

六．別構效應的動力學模型：

前提：1．別構酶的別構效應是由于寡聚酶亞基間的協(xié)同作用產生的；

2．每個亞基都有兩種不同的構象狀態(tài)

T狀態(tài)(Tightstate)：緊密態(tài)，不利于結合底物或調節(jié)物。

R狀態(tài)(Relaxationstate)：松弛態(tài)，有利于結合底物或調節(jié)物。

（一）MWC模型（齊變模型，同構模型，對稱模型）

別構酶齊變模型圖1．主要觀點：2．特點：可以很容易地解釋正負調節(jié)物的作用，但不適用于負協(xié)同效應。

（二）KNF模型（序變模型）別構酶序變模型圖

1．主要觀點：2．特點：該模型認為酶分子有許多中間構象狀態(tài)存在，因此用來解釋別構酶的酶活性調節(jié)作用要比MWC模型更好一些，適用于大多數(shù)酶。特別是在描述異促效應時，一般認為要比MWC模型更好一些?！鶡o論是MWC模型，還是KNF模型，都只是考慮了最簡單的情況，而忽略了其它情況。因此對于試驗結果的解釋，始終存在一定的局限性。4亞基別構酶可能存在的狀態(tài)虛線與實線分別代表MWC與KNF模型中酶分子存在的狀態(tài)七．別構酶的生理調節(jié)功能：

Ingeneral,thekeyregulatorystepsofametabolicpathwayarelocated(i)atthebeginningofametabolicpathwayforchannelingsubstrateintothepathwayandfordefiningthesynthesisrate,(ii)atbranchpointsforcontrollingthedistributionofcommonintermediatemolecules,and(iii)attheformationofendproductstolimitthemetabolicflowbyfeedbackcontrol.

1．正協(xié)同效應

如ATCase：天冬氨酸氨甲酰轉移酶，其活性受CTP抑制，ATP激活。

ATCase

+Asp→氨甲酰天冬氨酸→→UMP→UTP→CTP氨甲酰磷酸

+鳥氨酸→瓜氨酸→精氨酸

正協(xié)同效應可以使得反應底物濃度在一個很窄的范圍內即可快速大量地合成產物，并能調節(jié)參與幾個不同代謝途徑的底物在各個代謝途徑中得到合理的分配。catalytictrimercatalytictrimercatalytictrimerregulatorydimerregulatorydimerregulatorydimerregulatorydimerregulatorydimerregulatorydimerATCase活性抑制劑CTP與酶結合后的酶分子結構CTPCTPATP12?12?5°

5°

15°

15°

CTPCTPATPATPATPATCase活性激活劑ATP與酶結合后的酶分子結構改變，使酶處于松弛態(tài)。構象改變似乎符合MWC模型2．負協(xié)同效應Example:3-磷酸甘油醛脫氫酶：具四個亞基，可結合四個NAD+，催化如下反應

四個亞基與四個NAD+結合的解離常數(shù)如下表所示：

負協(xié)同效應使得酶促反應速度對低的配體濃度相對不敏感，從而得以保證代謝中某條重要途徑在底物濃度較低時能夠較為穩(wěn)定地進行下去。

總之，別構調節(jié)是快速影響酶活力的一種重要方式，受到別構調節(jié)的酶通常處于代謝途徑的起始點或者分叉點，也可能處于代謝途徑中部的關鍵位點或者限速位點上，在體內的代謝調節(jié)中有很重要的作用。第八節(jié)pH和溫度對酶催化反應速度的影響

一．pH值對酶促反應的影響1．影響方式：①酶蛋白失活；②影響酶活性部位的解離狀態(tài)；

③影響底物的解離狀態(tài)。

2．最適pH：

*最適pH并非酶的特征物理常數(shù)，它只能作為一個實驗參數(shù)。3．pH對酶穩(wěn)定性的影響：①強酸強堿：不可逆變性失活；②非強酸強堿：有時引起可逆變性失活，有時不可逆變性失活。

區(qū)別：把酶預先在不同pH下保溫，然后在最適pH下測定其活力。

酶活力不變可逆變性失活

酶活力降低不可逆變性失活4．影響機制：（雙解離模型）二．溫度對酶催化反應的影響

1．影響方式：①影響酶的穩(wěn)定程度，甚至使得酶蛋白變性失活；②影響酶與底物的結合；③影響酶和抑制劑、激活劑或者輔酶的結合；④影響酶蛋白中某些基團的解離等。

酶催化反應速度與溫度的關系2．最適溫度：酶的最適溫度也不是酶的特征常數(shù)。Taq酶在不同溫度下的合成速率（bp/S）：75-80℃，150；70℃，60；55℃，24；37℃，1.5;22℃,0