分子生物學 分子生物學研究法

一.重組DNA技術概論二.常見的DNA操作技術三.基因克隆技術(狹義)四.基因表達研究技術五.基因芯片及數(shù)據分析六.蛋白質組學及其研究技術第一頁，共九十三頁。一.重組DNA技術概論第二頁，共九十三頁。二.常見的DNA操作技術2.1瓊脂糖凝膠電泳2.2SDS電泳2.3PCR技術2.4測序技術2.5雜交技術2.6ELISA技術2.7細菌轉化2.8cDNA文庫2.9SNP技術及應用2.10基因打靶第三頁，共九十三頁。瓊脂糖凝膠電泳1、原理：2、用途：3、技術要點第四頁，共九十三頁。瓊脂糖凝膠電泳的原理

1.DNA電泳遷移：電荷效應＋分子篩效益（1）DNA帶負電，電場中，向正極移動；（2）決定移動速度三因素：DNA大小，電荷數(shù)，構型；

(3)線性DNA分子移動速度與其分子質量的對數(shù)成反比；（分子量越大，跑得越慢）

2、檢測原理：（1）溴化乙錠（EB）可插入雙鏈DNA分子中，在紫外光照射下，發(fā)射熒光。第五頁，共九十三頁。瓊脂糖凝膠電泳用途1.DNA分子量測定（距離－>分子量）2.基因，克隆的鑒定（通過1完成）3、不同長度的基因片斷的分離4、DNA濃度的測定

（熒光的強度與DNA含量成正比）*也可用于蛋白的分離鑒定第六頁，共九十三頁。加標準分子量DNAMarker,測定分子量加標準濃度的DNA，測定濃度第七頁，共九十三頁。瓊脂糖凝膠電泳技術要點1.不同濃度凝膠分辨DNA片段能力不一樣(p33)(1)低:不利于小片段的分辨(擴散)(2)高:不利于大片段的分辨(遷移不動)(3)一般選1.0%2.凝膠要用緩沖液配(TBE或TAE)3.EB強致癌，帶手套操作；4.agarose(瓊脂糖）－－－電泳

agar(含瓊脂糖和瓊脂膠）－－－平板培養(yǎng)基第八頁，共九十三頁。SDS電泳1、原理2、用途3、技術要點第九頁，共九十三頁。SDS電泳原理1.SDS(帶負電)和還原劑破壞蛋白的高級結構,同時SDS與蛋白定量結合,消除蛋白之間的電荷差異,使得蛋白的遷移率主要依賴分子量(分子小跑得快).2.不連續(xù)電泳:上層為濃縮膠,可將樣品壓縮到同一起跑線,下層為分離膠;可獲得更高的分辨率.3.考馬斯亮藍進行染色.第十頁，共九十三頁。第十一頁，共九十三頁。第十二頁，共九十三頁。SDS電泳用途1.蛋白分子量的測定2.蛋白濃度的測定3.蛋白的鑒定(通過1來實現(xiàn))第十三頁，共九十三頁。SDS技術要點1.濃縮膠一般用5%,

分離膠:次高分子(10萬-20萬)用7%,

低分子(1.4萬－10萬）用12％2、PAGE配制時帶手套，（Acr-Bis液體有積累性神經毒，聚合后無毒)3.SDS－PAGE測定的是單體蛋白分子量；（多亞基不行）4、SDS－PAGE不適于：（1）電荷異常蛋白：組蛋白（＋電多）（2）構象異常的蛋白（3）帶有較大輔基的蛋白－－糖蛋白，脂蛋白。第十四頁，共九十三頁。PCR技術1、原理2、應用3、技術要點第十五頁，共九十三頁。PCR技術原理循環(huán)過程(32次左右）1.解鏈：94℃,30s2.引物結合:？

℃，30s3.延伸：72℃，？Min

特點1.引物兩條，以2n指數(shù)擴增（前20-25次），后面擴增效率降低，30次以后，基本進入平臺期。2.引物結合溫度？

℃一般為50-55℃，需要調整；3.延伸時間？Min需要調整，一般1kb/min.第十六頁，共九十三頁。PCR技術應用1.基因檢測；2.基因的制備（包括基因的修飾）第十七頁，共九十三頁。PCR技術操作要點1.靈敏度高，防止污染，出現(xiàn)假陽性(帶手套，設立陰性，陽性對照）；2.需要摸索結合溫度，提高擴增的特異性。第十八頁，共九十三頁。雜交技術1.Southernblot檢測DNA2.Northernblot檢測RNA3.Westernblot檢測蛋白第十九頁，共九十三頁。Southernblot,Northernblot和Westernblot比較名稱檢測對象探針檢測原理處理過程用途SouthernblotDNA標記單鏈核酸核酸復性中堿基配對專一性瓊脂糖電泳后轉膜基因檢測（拷貝數(shù)）NorthernblotRNA標記單鏈核酸核酸復性中堿基配對專一性變性瓊脂糖電泳后轉膜基因表達的檢測（表達量）Westernblot蛋白抗體抗原－抗體特異性結合SDS后轉膜基因表達產物――蛋白的檢測ELISA原理和用途類似于Westernblot,但在酶標板中操作，無需SDS轉膜，操作簡單，可批量檢測，并可半定量測定。第二十頁，共九十三頁。Southernblot第二十一頁，共九十三頁。Northernblot第二十二頁，共九十三頁。Westernblot第二十三頁，共九十三頁。雙脫氧法測序

(Dudeoxysequenceanalyses)雙脫氧法又稱末端終止法，用于單鏈測序1.原理：

Atkinson發(fā)現(xiàn)用DNApol合成DNA時如在反應物中加入一定量的2`,3`ddTTP時，因ddT

的3`碳原子不含－OH,故DNA不能延伸。1982年Sanger利用此原理建立了雙脫氧測序法。原理和加減法相似，但不再是加一種dNTP或減一種dNTP,而是加入某一種雙脫氧核苷，來終止聚合反應。用此法測得G4含5577bp.第二十四頁，共九十三頁。第二十五頁，共九十三頁。第二十六頁，共九十三頁。第二十七頁，共九十三頁。2.1細菌轉化通常情況下，外源基因無法進入細菌細胞內；當用電擊法，或CaCl2，或RuCl等方法處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源基因進入的感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞的活性較低，處理需溫柔。第二十八頁，共九十三頁。2.2PCR(聚合酶鏈式反應)技術PCR的基本原理變性、復性、半保留復制

PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃第二十九頁，共九十三頁。PCR第三十頁，共九十三頁。2.3cDNA文庫cDNA:

(1)將mRNA反轉錄為雙鏈DNA.

(2)特點:

A.穩(wěn)定;

B.無內含子.二.cDNA文庫:

(1)

代表了生物體某一器官或者組織mRNA中所含的全部或絕大部分遺傳信息.(2)特點:

A.不同的生物,同一生物不同組織,同一組織不同發(fā)育時間或不同生理狀態(tài)下,cDNA文庫不同;B.建好的cDNA文庫的具體的信息未知,僅提供吊取相關目的基因的材料.C.每個克隆不一定是全長基因第三十一頁，共九十三頁。cDNA文庫建庫過程1.高質量mRNA的制備;2.反轉錄生成cDNA3.與載體分子連接(噬菌體文庫)4.轉染(噬菌體的包裝)第三十二頁，共九十三頁。第三十三頁，共九十三頁。說明:引物oligodT,隨機引物R6(得到全長cDNA)兩端可加上酶切接頭,便于克隆到載體上.合成時,原料用甲基化的dCTP.防止酶切時損傷內部序列.轉化效率要高,防止少量表達的mRNA未得到克隆.第三十四頁，共九十三頁。2.4SNP技術及應用Singlenucleotidepolymorphism單核苷酸多態(tài)性(標記)是指同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化，主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性。用途:(1)遺傳的分子標記物種鑒定

(2)生物功能異常的基因標記疾病的檢測;第三十五頁，共九十三頁。Singlenucleotidepolymorphism第三十六頁，共九十三頁。SNP的特征SNP是人類可遺傳的變異中最常出現(xiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，在人類基因組中廣泛存在，大約平均1000個堿基對就會出現(xiàn)一個SNP，估計整個人類基因組30億堿基中至少有300萬個SNP。

SNP大都表現(xiàn)為二等位基因（bialletic)多態(tài)性,即在該位置只存在兩種不同的堿基。SNP作為一種堿基的替換，大多數(shù)為轉換（C—T，G—A），也可能是顛換。轉換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，而且在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，多是發(fā)生C—T的轉換，原因是CG中的C是甲基化的，它能自發(fā)的脫氨基而替換為胸腺嘧啶。第三十七頁，共九十三頁。SNP的檢測方法單鏈構象多態(tài)性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)

原理：單鏈DNA的折疊結構是由單核苷酸序列決定的，當某一個堿基發(fā)生突變時，便會直接影響該鏈的構象，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移率會發(fā)生改變。第三十八頁，共九十三頁。變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)

原理:當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性溫度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。第三十九頁，共九十三頁。熒光共振能量傳遞

(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)

供者受者

探針5‘3‘Taqman法分子信標(molecularbeacon)法

第四十頁，共九十三頁。高效液相色譜ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質譜分析法DNA芯片技術（DNAchip）

第四十一頁，共九十三頁。SNP數(shù)據庫美國國立生物技術信息中心德國的HGBAS網站

日本JST的數(shù)據庫

第四十二頁，共九十三頁。2.5基因打靶(genetargeting)通過DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內研究該基因的功能。(反向遺傳學)基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代第四十三頁，共九十三頁?；虼虬械谋貍錀l件胚胎干細胞(ES細胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性打靶載體Neo（新霉素）陽性篩選標志HSV-tk陰性篩選標志：單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)第四十四頁，共九十三頁?；蚯贸幕境绦虼虬休d體的構建打靶載體導入ES細胞：重組置換基因敲除ES細胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種第四十五頁，共九十三頁。第四十六頁，共九十三頁?；蚯贸齂nockout1.完全基因敲除可能會致死.2.條件型基因敲除Cre/LoxP,FLP/FRT第四十七頁，共九十三頁?；蚯贸娜秉c能將基因與表型(生物功能)聯(lián)系起來,但不能提供具體的作用機制;對多基因決定的表型無法將其聯(lián)系全部找出;操作復雜,成本高.第四十八頁，共九十三頁。三.基因克隆技術(狹義)

獲取目的基因的技術1.RACE技術2.cDNA差示顯示法3.基因大規(guī)?？寺〖夹g4.酵母雙雜交法5.酵母單雜交系統(tǒng)6.基因的圖位克隆法第四十九頁，共九十三頁。3.1RACE技術RapidamplificationofcDNAends已知基因一端序列,快速獲取另一端序列.5’RACE(獲取5’序列)3’RACE(獲取3’序列)需要合成引物接頭(單鏈DNA),用RNAligase將基因(RNA)與引物(DNA)連接.第五十頁，共九十三頁。5’RACE第五十一頁，共九十三頁。3’RACE(非mRNA擴增)合成兩條互補的引物,序列任意.及一條序列特異的引物互補引物中一條5’標記Pi,通過RNAligase將其與RNA連接.第五十二頁，共九十三頁。第五十三頁，共九十三頁。3.2cDNA差示顯示法(cDNA-RDA)僅知道生理功能,性狀,對基因序列一無所知.獲得該相關基因的方法.原理:A.樣本(sample)與對照(control)mRNAs被轉錄成cDNA,酶切加可PCR擴增接頭,擴增后除去接頭,只有樣本被加上新接頭(可PCR擴增).B.樣本(ss)與過量對照(cc)雜交后,PCR擴增.sc被線形擴增;ss被指數(shù)擴增;CC不被擴增.第五十四頁，共九十三頁。第五十五頁，共九十三頁。3.3基因大規(guī)?？寺〖夹g(Gateway克隆技術)1.不需要酶切,連接;2.利用TOPO反應,將PCR產物克隆到Entry載體;再通過LR反應,將基因定點,定向重組到表達載體.3.上游引物5’端需要引入CACC序列.第五十六頁，共九十三頁。第五十七頁，共九十三頁。第五十八頁，共九十三頁。第五十九頁，共九十三頁。3.4酵母雙雜交法

（蛋白－蛋白相互作用）1.篩選與已知蛋白相互作用的蛋白基因2.真核生物的轉錄激活子基本結構一般有2個功能域（functionaldomain）DNA結合域（DNA-bindingdomain）－－DBD轉錄激活域（transcription-activatingdomain）--AD(許多激活子還有二聚體化域,有的還有受體結合域)第六十頁，共九十三頁。第六十一頁，共九十三頁。第六十二頁，共九十三頁。“獵物”為一個庫；２．將不同的“誘餌”克隆后，捕獲不同的“獵物”第六十三頁，共九十三頁。３.5酵母單雜交

（蛋白核酸相互作用）用于鑒定與特定順式作用元件（DNA序列）作用的轉錄調控因子的DNA結合域．或反之．第六十四頁，共九十三頁。第六十五頁，共九十三頁。３.6基因的圖位克隆法

目的：克隆具有某種表型的未知基因的方法．原理：略第六十六頁，共九十三頁。四.基因表達研究技術１.基因表達系列分析技術（SAGE)2.RNA選擇性剪切機制3.原位雜交技術４.定點突變技術５．RNAi技術第六十七頁，共九十三頁。4.１.基因表達系列分析技術（SAGE)

以測序為基礎的定量分析全基因組表達模式的技術，能夠直接讀出任何一種類型細胞或組織的基因表達信息；理論依據：９－１０堿基的核酸片段可代表一種轉錄產物的特異序列（序列標簽）某序列標簽占總標簽數(shù)的比例對應編碼基因的表達頻率．第六十八頁，共九十三頁。第六十九頁，共九十三頁。4.2.RNA選擇性剪切機制RT-PCR擴增不同組織特異基因電泳分析片段大小是否一致．第七十頁，共九十三頁。４.3.原位雜交技術通過標記的核酸探針,在組織,細胞,間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段.(1)RNA原位雜交組織切片中,該基因的表達產物(mRNA)在細胞水平上作出定性定量分析.-{區(qū)別免疫組化(蛋白)}(2)染色體原位雜交eg.熒光原位雜交(FISH),確定DNA序列染色體上的位置.

第七十一頁，共九十三頁。第七十二頁，共九十三頁。4.3定點突變1.研究某個氨基酸殘基對蛋白質的結構,功能的影響;2.改造DNA調控序列,修飾表達載體,引入新的酶切位點.第七十三頁，共九十三頁。TaKaRamutationkit第七十四頁，共九十三頁。4.4RNAi技術RNAi是指dsRNA誘導產生的細胞內同源基因表達阻斷的生物學現(xiàn)象。在線蟲、昆蟲、哺乳動物、植物和真菌中廣泛存在。是轉錄后基因沉默（PTGS）的重要機制。細胞利用RNAi抵御病毒和其它外源核酸的侵染，阻斷轉座子的作用。第七十五頁，共九十三頁。雙鏈RNA先被切割酶Dicer切割成21－23個堿基對的siRNA中間體，觸發(fā)形成RNA誘導的沉默復合物（RISC）。在ATP的存在下，復合物中雙鏈RNA被螺旋酶解旋，形成單鏈RNA（ssRNA）的活化體。一旦單鏈RNA同目的mRNA配對，核酸酶被活化，在復合物內部降解mRNA。第七十六頁，共九十三頁。RNAi的應用

基因功能的研究：RNAi作為一種反相遺傳工具，可通過抑制特定基因的表達來研究該基因功能?；蛑委煟嚎捎糜谝种茀⑴c病程的開始或發(fā)展的蛋白質的產生，例如參與病毒或寄生蟲與宿主相互作用、病原體的復制、癌癥的發(fā)生及細胞毒性的蛋白質。第七十七頁，共九十三頁。RNAi的缺點

A.在哺乳動物中，存在非特異性效應的dsRNA觸發(fā)途徑,如（1）dsRNA依賴的蛋白激酶(PKR)和干擾素途徑，該途徑引起對蛋白合成和凋亡的全身性的抑制；(2)dsRNA誘導的2′–5′多聚腺苷酸的合成，該途徑導致非特異性的RNA酶即RnaseL的活化。但PKR不能被少于30個核苷的dsRNA活化，可以通過實驗設計盡量避免。但非特異性RNAi效應有時還是存在，而且不可預測。對有的高表達的基因，RNAi可能會無效或效果不明顯。質粒轉染的RNAi效果比較短暫（約1周左右）。對一個基因設計的不同片段的RNAi可能效果差異很大，篩選的工作量繁重。有時細胞導入效率低下，也增加了技術實現(xiàn)的難度。第七十八頁，共九十三頁。4.5生物芯片技術

生物芯片是八十年代末在生命科學領域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術，它主要是指通過微加工技術和微電子技術在固格體芯片表面構建的微型生物化學分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質、DNA以及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。第七十九頁，共九十三頁。主要特點

高通量、微型化和自動化。芯片上集成的成千上萬的密集排列的分子微陣列，能夠在短時間內分析大量的生物分子，使人們快速準確地獲取樣品中的生物信息，效率是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍。但目前的成本較高，重復性較差。第八十頁，共九十三頁。生物芯片分類

(1)用途

1.樣品制備芯片2.生化反應芯片（如PCR芯片）3.檢測芯片（如基因芯片，蛋白芯片）4.芯片實驗室（是生物芯片技術發(fā)展的最終目標。它將樣品的制備、生化反應到檢測分析的整個過程集約化形成微型分析系統(tǒng)）。第八十一頁，共九十三頁。生物芯片分類

(2)制造技術微孔板/微陣列芯片DNA微點陣(陣列)芯片此類芯片的共同特點是,將多達成千上萬種ＤＮＡ探針分子按照一定順序排列在固相基片(多數(shù)采用玻片)上組成密集的微點陣(Microarray)或陣列(Array),利用核酸雜交原理對靶核酸進行檢測分析。蛋白質微點陣(陣列)芯片將大量純化的蛋白分子按一定的排列規(guī)律連接于玻片上,形成密集的微點陣(陣列),進行高通量的生物活性檢測、蛋白質靶標分子(蛋白質、抗體、ＤＮＡ、ＲＮＡ)相互作用研究。微流路芯片流過式芯片微流路(Microfluidic)芯片的共同特點是采用半導體微加工技術和(或)微電子工藝在芯片上構建微流路系統(tǒng)(由儲液池、微反應室、微通道、微電極、微電路中的一種或幾種組成),加載生物樣品和反應液后,在壓力泵或電場的作用下形成微流路,于芯片上進行一種或連續(xù)多種的反應,達到對樣品的高通量快速分析的目的。微電子芯片PCR芯片毛細管電泳芯片毛細管層析芯片多功能集成芯片蛋白質分析微流路芯片第八十二頁，共九十三頁。六.蛋白質組學及其研究技術1.雙向電泳2.質譜技術3.蛋白質免疫印跡實驗4.EMSA5.噬菌體展示技術6.免疫共沉淀技術7.蛋白質磷酸化分析第八十三頁，共九十三頁。6.1雙向電泳

雙向電泳是蛋白質組學中對蛋白質組進行研究的主要分離方法，同時能分離成百上千種蛋白質。蛋白質在第一向根據電荷的不同（等電聚焦），第二向根據分子量的不同進行分離（SDS）。分離后對蛋白質進行染色，根據實際分析情況，分別進行考馬斯亮蘭染色、銀染或熒光染色。掃描后用相關軟件（PDQUEST等）進行圖譜分析，分析差別點等。雙向電泳與質譜技術聯(lián)用，還可以進一步分析差別點蛋白的特性。第八十四頁，共九十三頁。第八十五頁，共九十三頁。6.2MS質譜技術

質譜技術的基本原理是樣品分子離子化后，根據不同離子間質荷比(m