-第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件

第十四章

細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞第一節(jié)

細(xì)胞增殖調(diào)控第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞第一節(jié)細(xì)胞增殖調(diào)控本節(jié)內(nèi)容一二三

五

MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系周期蛋白

CDK和CDK抑制因子細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控

四

六其他因素在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用本節(jié)內(nèi)容一二三五MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用p34cdc2激酶一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用12科學(xué)家通過三個(gè)實(shí)驗(yàn)找到并證實(shí)了MPFMPF的功能一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用12科學(xué)家通過三個(gè)實(shí)驗(yàn)找到MPF的功時(shí)間研究者步驟1970Rao和Johnso將HeLa細(xì)胞同步于不同階段，然后將M期細(xì)胞與其他間期細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)一M期細(xì)胞可以誘導(dǎo)PCC結(jié)果在M期細(xì)胞中可能存在一種誘導(dǎo)染色體凝集的因子，稱為細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)因子。結(jié)論HeLa細(xì)胞G1期S期G2期仙臺病毒介導(dǎo)早熟染色體凝縮（PCC）同步化M期細(xì)胞時(shí)間研究者步1970Rao和Johnso將HeLa細(xì)胞同步于A：G1期DNA未復(fù)制，超前染色體為單線性；B：S期DNA正在復(fù)制，超前染色體為點(diǎn)狀，很多復(fù)制起始點(diǎn)；C：G2期DNA復(fù)制完畢，超前染色體為雙線性。A：G1期DNA未復(fù)制，超前染色體為單線性；時(shí)間步驟1971Masui和Markert實(shí)驗(yàn)二孕酮誘導(dǎo)成熟的卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)能誘導(dǎo)其他卵母細(xì)胞的成熟結(jié)果在成熟的卵母細(xì)胞中，必定有一種物質(zhì)，能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，這種物質(zhì)稱為成熟促進(jìn)因子（MPF）結(jié)論用解剖的方法分離非洲爪蟾第IV期卵母細(xì)胞，孕酮誘導(dǎo)成熟后進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)移植實(shí)驗(yàn)研究者時(shí)間步驟1971Masui和Markert實(shí)驗(yàn)二孕酮誘導(dǎo)--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)移植實(shí)驗(yàn)成熟卵母細(xì)胞中的物質(zhì)能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)移植實(shí)驗(yàn)成熟卵母細(xì)胞中的物質(zhì)能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟以爪蟾卵為材料，純化MPF工作時(shí)間步驟1988Malleretal實(shí)驗(yàn)三MPF組成：p32和p45兩種蛋白。p32和p45結(jié)合后，表現(xiàn)出蛋白激酶活性，能使多種蛋白質(zhì)底物磷酸化結(jié)果MPF（又稱細(xì)胞促分裂因子或M期促進(jìn)因子），是由細(xì)胞周期蛋白與周期蛋白依賴性蛋白激酶組成的復(fù)合物，能啟動細(xì)胞進(jìn)入M期。結(jié)論研究者以爪蟾卵為材料，純化MPF工作時(shí)間步驟1988Maller二、p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系12酵母中cdc基因的發(fā)現(xiàn)cdc激酶與MPF的關(guān)系二、p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系12酵母中cd以裂殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建溫度敏感型突變株，分析突變株基因改變情況時(shí)間步驟1970Nurse等實(shí)驗(yàn)一找到cdc基因，如cdc2,表達(dá)蛋白為34kDa,稱為p34cdc2結(jié)果第一個(gè)被分離出來的cdc基因，表達(dá)蛋白為34kDa，稱為p34cdc2。特點(diǎn)：突變后芽殖酵母細(xì)胞停留在G2/M期

結(jié)論研究者以裂殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建溫度敏感型突變株，分析突變株基因改以芽殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建溫度敏感型突變株，分析突變株基因改變情況時(shí)間步驟1960Hartwell實(shí)驗(yàn)二找到cdc基因，如cdc28,表達(dá)蛋白為34kDa,稱為p34cdc28結(jié)果第二個(gè)被分離出來的cdc基因；突變后細(xì)胞停留在G1/S或G2/M期。結(jié)論研究者以芽殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建溫度敏感型突變株，分析突變株基因改cdc28:第二個(gè)被分離出來的cdc基因，表達(dá)蛋白為p34cdc28特點(diǎn)：突變后芽殖酵母細(xì)胞停留在G1/S或G2/M期cdc2:第一個(gè)被分離出來的cdc基因，表達(dá)蛋白為p34cdc2特點(diǎn)：突變后裂殖酵母細(xì)胞停留在G2/M期

共同特點(diǎn)：1.大小相等，是同源物，并且與MPF中的P32是同源物2．本身都不具激酶活性，只有與特定蛋白結(jié)合后（p56cdc13

）才有激酶活性cdc28:第二個(gè)被分離出來的cdc基因，表達(dá)蛋白為p34以海膽卵為對象，對細(xì)胞周期的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行深入研究時(shí)間步驟1983以TimHunt為代表，由Evans于1983年報(bào)道實(shí)驗(yàn)三發(fā)現(xiàn)2種特殊蛋白質(zhì)，隨細(xì)胞周期變化而變化，一般在間期積累，分裂期消失，命名為周期蛋白（CyclinA,CyclinB）結(jié)果周期蛋白是進(jìn)入M期所必須，從酵母到人類各種生物中均存在，可能參與MPF的調(diào)控結(jié)論證明了周期蛋白B是MPF的另一個(gè)成分與Maller實(shí)驗(yàn)室合作研究者以海膽卵為對象，時(shí)間步驟1983以TimHunt為代表，由MPF=p34cdc2(p34cdc28)+p56cdc13(cyclinB)

MPF=p34cdc2(p34cdc28)+p56cdc1LelandH.HartwellR.Timothy(Tim)HuntSirPaulM.Nurse2001年10月8日美國人Leland

Hartwell、英國人PaulNurse、Timothy

Hunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。cdc28周期蛋白cdc2LelandH.HartwellR.Timothy三、細(xì)胞周期蛋白特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。含有一段約100個(gè)氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導(dǎo)與CDK結(jié)合。作用：激活和引導(dǎo)CDK作用于不同底物。已知30余種，分為4類：G1型、G1/S型、S型、M型。三、細(xì)胞周期蛋白特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。含有一段約1--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件PEST序列與G1期周期蛋白更新有關(guān)9aa:RXXLGXIXNM期周期蛋白40aa:Lys富集，參與泛素介導(dǎo)降解G1期周期蛋白介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合周期蛋白框：介導(dǎo)與不同CDK結(jié)合破壞框：將泛素（遍在蛋白）連接到破壞框上PEST序列與G1期周期蛋白更新有關(guān)9aa:RXXLGXIXG1期周期蛋白：只在G1期表達(dá)，只在G1期和S期轉(zhuǎn)化過程中執(zhí)行調(diào)節(jié)功能。種類：

cyclinC、D、E、Cln1、Cln2、Cln3舉例：在生長因子的刺激下，cyclinD表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。G1期周期蛋白：只在G1期表達(dá)，只在G1期和S期轉(zhuǎn)化過程中執(zhí)M期周期蛋白：在間期表達(dá)和積累，到M期時(shí)才表現(xiàn)出調(diào)節(jié)功能。種類：cyclinA、cyclinB舉例：

cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1引起染色體凝縮、核膜解體等。M期周期蛋白：在間期表達(dá)和積累，到M期時(shí)才表現(xiàn)出調(diào)節(jié)功能。不同的周期蛋白與不同的CDK結(jié)合，調(diào)節(jié)不同的CDK激酶的活性。不同的周期蛋白與不同的CDK結(jié)合，CDK（

cyclin-dependentkinase）

（1）CDK的種類

（2）CDK的分子結(jié)構(gòu)CDK抑制因子四、CDK和CDK抑制因子CDK（cyclin-dependentkinase）通過PCR技術(shù)構(gòu)建人類、非洲爪蟾、果蠅cDNA文庫，并對其篩選。分離到10多個(gè)cdc2同類基因，不同物種的cdc2基因編碼的蛋白質(zhì)都含有一段相似序列，并且都能和周期蛋白結(jié)合，將其作為調(diào)節(jié)亞基，進(jìn)而表現(xiàn)出激酶活性。它們被統(tǒng)稱為周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependentkinase)，簡稱CDK。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CDK1-CDK13等CDK激酶。1、CDK通過PCR技術(shù)構(gòu)建人類、非洲爪蟾、果蠅cDN（1）與不同類型的周期蛋白相結(jié)合的CDK激酶復(fù)合體脊椎動物芽殖酵母CyclinCDKCyclinCDKG1-CDKCyclinD*CDK4、6Cln3CDK1(CDC28)G1/S-CDKCyclinECDK2Cln1、2CDK1(CDC28)S-CDKCyclinACDK2Clb5、6CDK1(CDC28)M-CDKCyclinBCDK1(CDC2)Clb1-4CDK1(CDC28)*包括D1-3，各亞型cyclinD在不同細(xì)胞中的表達(dá)量不同，但具有相同的功效。（1）與不同類型的周期蛋白相結(jié)合的CDK激酶復(fù)合體脊椎動物芽(2)不同類型的CDK/cyclin復(fù)合物及其參與的細(xì)胞周期調(diào)控(2)不同類型的CDK/cyclin復(fù)合物及其參與的細(xì)胞周期可能與周期蛋白結(jié)合有關(guān)（2）CDK的分子結(jié)構(gòu)不同物種的cdc2基因編碼的蛋白質(zhì)都含有一段相似序列，并且都能和周期蛋白結(jié)合，將其作為調(diào)節(jié)亞基，進(jìn)而表現(xiàn)出激酶活性，被統(tǒng)稱為CDK?？赡芘c周期蛋白結(jié)合有關(guān)（2）CDK的分子結(jié)構(gòu)不同物種的cdcCDK抑制因子（CDKI）：對細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為：①INK4家族:p16為典型代表，主要抑制CDK4和CDK6活性。②Cip/Kip家族：p21為典型代表，主要對G1期CDK（CDK2、CDK3、CDK4和CDK6）起抑制作用。還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA結(jié)合，直接抑制DNA的合成。2、CDKICDK抑制因子（CDKI）：對細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為：2五、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控五、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控細(xì)胞周期中的檢驗(yàn)點(diǎn)G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)：檢查DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：檢查DNA是否損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？中-后期檢驗(yàn)點(diǎn)（紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)）細(xì)胞周期中的檢驗(yàn)點(diǎn)G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)：cellcycleregulationcellcycleregulation1、CDK1激酶Cdc2蛋白：在細(xì)胞周期中，含量相對穩(wěn)定。周期蛋白B：G1期晚期開始合成，G2期達(dá)最大值。周期蛋白B含量達(dá)到一定程度，CDK1激酶活性始現(xiàn)，到G2晚期，CDK1激酶活性最大。（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用1、CDK1激酶Cdc2蛋白：在細(xì)胞周期中，含量相對穩(wěn)定。（（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用cyclinB在CDK1激酶活性調(diào)節(jié)中的作用（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用cyclCDK1激酶使某些蛋白質(zhì)磷酸化，改變其下游的某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和啟動其功能，實(shí)現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞周期。例如：組蛋白H1磷酸化：導(dǎo)致染色體的凝集；核纖層蛋白A、B、C磷酸化：導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失；核仁蛋白磷酸化：導(dǎo)致核仁解體。CDK1激酶使某些蛋白質(zhì)磷酸化，改變其下游的某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件2、CDK1激酶活性的調(diào)控先決條件：周期蛋白與CDK結(jié)合修飾：對一些重要位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化修飾，對CDK激酶活性起重要調(diào)節(jié)作用。2、CDK1激酶活性的調(diào)控先決條件：周期蛋白與CDK結(jié)合CDK1激酶活性的綜合調(diào)控（教材p305）CDK1激酶活性的綜合調(diào)控（教材p305）（二）M期周期蛋白與分裂中期向后期轉(zhuǎn)化細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)到分裂中期后，M期周期蛋白B/A

與CDK1分離，在APC介導(dǎo)下，通過泛素化途徑而降解。CDK1激酶活性喪失，蛋白質(zhì)（CDK1激酶磷酸化的）去磷酸化，細(xì)胞周期由中期向后期轉(zhuǎn)化。（二）M期周期蛋白與分裂中期向后期轉(zhuǎn)化細(xì)胞周在分裂中期，當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，激活后期促進(jìn)復(fù)合物APC，將泛素連接在cyclinB上，cyclinB被蛋白酶體降解，完成一個(gè)細(xì)胞周期。M期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱破壞框(destructionbox)。泛素由76個(gè)氨基酸組成，高度保守。共價(jià)結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識別和降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。26S蛋白酶體是一個(gè)大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。在分裂中期，當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，激活后期促進(jìn)復(fù)合物APCAPC活性調(diào)節(jié)：兩類正調(diào)控因子：cdc20/Fizzy,cdh1/Fzy等負(fù)調(diào)控因子：Emi1,Emi2,Mad2,BubR1等APC種類：15種，如cdc16,cdc23,cdc27和BimE等APC活性調(diào)節(jié)：兩類APC種類：15種，如cdc16,cd泛素與周期蛋白的降解：多聚泛素化作用(polyubiquitination)●泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzyme,E1)

●泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugatingenzyme,E2)

●泛素連接酶(ubiquitinligase,E3)泛素與周期蛋白的降解：多聚泛素化作用(polyubiquitAPC的活性調(diào)節(jié)控制周期蛋白B的降解◆當(dāng)MPF的活性在有絲分裂中期達(dá)到最高峰時(shí),它被CDK所激活，即APC磷酸化后被激活；◆接著發(fā)生周期蛋白B遍在蛋白多聚化,引起周期蛋白B的降解；◆由于周期蛋白B是MPF的一個(gè)必需亞基,它的降解勢必導(dǎo)致MPF的失活；◆在G1期的后期,APC失活,使得周期蛋白B的濃度升高,同時(shí)提高M(jìn)PF的活性,以便進(jìn)入下一個(gè)有絲分裂期。APC的活性調(diào)節(jié)控制周期蛋白B的降解--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件（三）G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴性CDKG1期，在生長因子的刺激下，cyclinD表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb蛋白（成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白）磷酸化而失活，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。在G1-S期，cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)由G1期向S期轉(zhuǎn)化，并直接參與中心體復(fù)制與調(diào)控。TGFβ抑制cyclinE-CDK2的活性使細(xì)胞抑制在G1期。CyclinE的抗體能使細(xì)胞停滯于G1期。CDK2催化p107磷酸化，釋放E2F。在S期，cyclinA與CDK2結(jié)合為S期的主要激酶，參與DNA復(fù)制，使復(fù)制因子RF-A磷酸化而活性增強(qiáng)。（三）G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴性CDKG1期，在生--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件G1期周期蛋白降解通過SCF（Skp-cullin-F-boxprotein）泛素化途徑實(shí)現(xiàn)。G1期周期蛋白不含破壞框序列，而含PEST序列，對G1期周期蛋白降解起促進(jìn)作用。參與復(fù)制的調(diào)控因子，如p21,p27和p57等通過泛素化途徑降解。SCF具有E3泛素連接酶的功能，由Skp1,Cul1和Rbx1三種亞基構(gòu)成。SCF的底物特異性由F-box蛋白決定。G1期周期蛋白降解通過SCF（Skp-cullin-F-boAPC和SCF在細(xì)胞周期中的活性及其底物APC和SCF在細(xì)胞周期中的活性及其底物SCF泛素化依賴蛋白降解途徑SCF泛素化依賴蛋白降解途徑DNA復(fù)制活動調(diào)控復(fù)制起始點(diǎn)識別復(fù)合物：6個(gè)亞基，ORC1-6cdc6

和cdc45也是復(fù)制所必需的“DNA復(fù)制執(zhí)照因子學(xué)說”：存在于細(xì)胞質(zhì)中，隨細(xì)胞分裂進(jìn)行，“執(zhí)照”信號與減弱直到消失。DNA復(fù)制執(zhí)照因子的本質(zhì)為Mcm蛋白，分為6種DNA復(fù)制活動調(diào)控--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件（四）S/G2/M期轉(zhuǎn)換與DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)包括S期內(nèi)部檢驗(yàn)點(diǎn)和DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)。S期內(nèi)部檢驗(yàn)點(diǎn)通過染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白SMC1磷酸化實(shí)現(xiàn)（ATM-MDC1-MRNC等中介物的系列催化過種實(shí)現(xiàn)），或通過ATM/ATR介導(dǎo)的cdc25A磷酸酶過磷酸化而降解。復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)由ATR/CHK1激活實(shí)現(xiàn)。

ATR/CHK1介導(dǎo)cdc25A降解，抑制cyclinE/A-CDK2通路。（四）S/G2/M期轉(zhuǎn)換與DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)包括S期內(nèi)部檢驗(yàn)--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件DNAdamagecheckpoint:

Cell-cycleprogressionisblockedbyDNAdamageandp53HowDNAdamagearreststhecellcycleinG1.有兩個(gè)這樣的限制點(diǎn):1.一個(gè)在晚G1期:阻止進(jìn)入Ｓ期;2.一個(gè)在晚G2期:阻止進(jìn)入Ｍ期;P53:基因調(diào)控蛋白.DNA破壞通過間接機(jī)制激活p53。Mdm2作為ubiquitinligase起作用，導(dǎo)致p53用于蛋白酶體（proteasomes）引發(fā)的降解.P53磷酸化降低了對Mdm2的連接.P21(CKIprotein)結(jié)合到G1/S-Cdk和S-Cdk，抑制其活性，因而阻斷了期進(jìn)入Ｓ期.DNAdamagecheckpoint:Cell-c生長因子是與細(xì)胞增殖有關(guān)的信號物質(zhì)，已知幾十種，多數(shù)能促進(jìn)細(xì)胞增殖。作用方式：旁分泌。信號通路：ras、cAMP、磷脂酰肌醇途徑。

如通過ras途徑，激活MAPK，MAPK進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活c-myc，myc作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)cyclinD、SCF、E2F等G1-S有關(guān)的基因表達(dá)，細(xì)胞進(jìn)入G1期。生長因子是與細(xì)胞增殖有關(guān)的信號物質(zhì)，已知幾十種，多數(shù)能促進(jìn)細(xì)Currentmodelforregulationoftheeukaryoticcellcycle總結(jié)Currentmodelforregulationo--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件1.簡述p34cdc2/cyclinB蛋白激酶的發(fā)現(xiàn)過程。2.細(xì)胞周期中有哪些主要檢驗(yàn)點(diǎn)？3.舉例說明CDK激酶在細(xì)胞周期中是如何執(zhí)行調(diào)節(jié)功能的。思考題1.簡述p34cdc2/cyclinB蛋白激酶的發(fā)現(xiàn)過程第十四章

細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞第一節(jié)

細(xì)胞增殖調(diào)控第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞第一節(jié)細(xì)胞增殖調(diào)控本節(jié)內(nèi)容一二三

五

MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系周期蛋白

CDK和CDK抑制因子細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控

四

六其他因素在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用本節(jié)內(nèi)容一二三五MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用p34cdc2激酶一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用12科學(xué)家通過三個(gè)實(shí)驗(yàn)找到并證實(shí)了MPFMPF的功能一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用12科學(xué)家通過三個(gè)實(shí)驗(yàn)找到MPF的功時(shí)間研究者步驟1970Rao和Johnso將HeLa細(xì)胞同步于不同階段，然后將M期細(xì)胞與其他間期細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)一M期細(xì)胞可以誘導(dǎo)PCC結(jié)果在M期細(xì)胞中可能存在一種誘導(dǎo)染色體凝集的因子，稱為細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)因子。結(jié)論HeLa細(xì)胞G1期S期G2期仙臺病毒介導(dǎo)早熟染色體凝縮（PCC）同步化M期細(xì)胞時(shí)間研究者步1970Rao和Johnso將HeLa細(xì)胞同步于A：G1期DNA未復(fù)制，超前染色體為單線性；B：S期DNA正在復(fù)制，超前染色體為點(diǎn)狀，很多復(fù)制起始點(diǎn)；C：G2期DNA復(fù)制完畢，超前染色體為雙線性。A：G1期DNA未復(fù)制，超前染色體為單線性；時(shí)間步驟1971Masui和Markert實(shí)驗(yàn)二孕酮誘導(dǎo)成熟的卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)能誘導(dǎo)其他卵母細(xì)胞的成熟結(jié)果在成熟的卵母細(xì)胞中，必定有一種物質(zhì)，能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，這種物質(zhì)稱為成熟促進(jìn)因子（MPF）結(jié)論用解剖的方法分離非洲爪蟾第IV期卵母細(xì)胞，孕酮誘導(dǎo)成熟后進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)移植實(shí)驗(yàn)研究者時(shí)間步驟1971Masui和Markert實(shí)驗(yàn)二孕酮誘導(dǎo)--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)移植實(shí)驗(yàn)成熟卵母細(xì)胞中的物質(zhì)能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)移植實(shí)驗(yàn)成熟卵母細(xì)胞中的物質(zhì)能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟以爪蟾卵為材料，純化MPF工作時(shí)間步驟1988Malleretal實(shí)驗(yàn)三MPF組成：p32和p45兩種蛋白。p32和p45結(jié)合后，表現(xiàn)出蛋白激酶活性，能使多種蛋白質(zhì)底物磷酸化結(jié)果MPF（又稱細(xì)胞促分裂因子或M期促進(jìn)因子），是由細(xì)胞周期蛋白與周期蛋白依賴性蛋白激酶組成的復(fù)合物，能啟動細(xì)胞進(jìn)入M期。結(jié)論研究者以爪蟾卵為材料，純化MPF工作時(shí)間步驟1988Maller二、p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系12酵母中cdc基因的發(fā)現(xiàn)cdc激酶與MPF的關(guān)系二、p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系12酵母中cd以裂殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建溫度敏感型突變株，分析突變株基因改變情況時(shí)間步驟1970Nurse等實(shí)驗(yàn)一找到cdc基因，如cdc2,表達(dá)蛋白為34kDa,稱為p34cdc2結(jié)果第一個(gè)被分離出來的cdc基因，表達(dá)蛋白為34kDa，稱為p34cdc2。特點(diǎn)：突變后芽殖酵母細(xì)胞停留在G2/M期

結(jié)論研究者以裂殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建溫度敏感型突變株，分析突變株基因改以芽殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建溫度敏感型突變株，分析突變株基因改變情況時(shí)間步驟1960Hartwell實(shí)驗(yàn)二找到cdc基因，如cdc28,表達(dá)蛋白為34kDa,稱為p34cdc28結(jié)果第二個(gè)被分離出來的cdc基因；突變后細(xì)胞停留在G1/S或G2/M期。結(jié)論研究者以芽殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建溫度敏感型突變株，分析突變株基因改cdc28:第二個(gè)被分離出來的cdc基因，表達(dá)蛋白為p34cdc28特點(diǎn)：突變后芽殖酵母細(xì)胞停留在G1/S或G2/M期cdc2:第一個(gè)被分離出來的cdc基因，表達(dá)蛋白為p34cdc2特點(diǎn)：突變后裂殖酵母細(xì)胞停留在G2/M期

共同特點(diǎn)：1.大小相等，是同源物，并且與MPF中的P32是同源物2．本身都不具激酶活性，只有與特定蛋白結(jié)合后（p56cdc13

）才有激酶活性cdc28:第二個(gè)被分離出來的cdc基因，表達(dá)蛋白為p34以海膽卵為對象，對細(xì)胞周期的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行深入研究時(shí)間步驟1983以TimHunt為代表，由Evans于1983年報(bào)道實(shí)驗(yàn)三發(fā)現(xiàn)2種特殊蛋白質(zhì)，隨細(xì)胞周期變化而變化，一般在間期積累，分裂期消失，命名為周期蛋白（CyclinA,CyclinB）結(jié)果周期蛋白是進(jìn)入M期所必須，從酵母到人類各種生物中均存在，可能參與MPF的調(diào)控結(jié)論證明了周期蛋白B是MPF的另一個(gè)成分與Maller實(shí)驗(yàn)室合作研究者以海膽卵為對象，時(shí)間步驟1983以TimHunt為代表，由MPF=p34cdc2(p34cdc28)+p56cdc13(cyclinB)

MPF=p34cdc2(p34cdc28)+p56cdc1LelandH.HartwellR.Timothy(Tim)HuntSirPaulM.Nurse2001年10月8日美國人Leland

Hartwell、英國人PaulNurse、Timothy

Hunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。cdc28周期蛋白cdc2LelandH.HartwellR.Timothy三、細(xì)胞周期蛋白特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。含有一段約100個(gè)氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導(dǎo)與CDK結(jié)合。作用：激活和引導(dǎo)CDK作用于不同底物。已知30余種，分為4類：G1型、G1/S型、S型、M型。三、細(xì)胞周期蛋白特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。含有一段約1--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件PEST序列與G1期周期蛋白更新有關(guān)9aa:RXXLGXIXNM期周期蛋白40aa:Lys富集，參與泛素介導(dǎo)降解G1期周期蛋白介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合周期蛋白框：介導(dǎo)與不同CDK結(jié)合破壞框：將泛素（遍在蛋白）連接到破壞框上PEST序列與G1期周期蛋白更新有關(guān)9aa:RXXLGXIXG1期周期蛋白：只在G1期表達(dá)，只在G1期和S期轉(zhuǎn)化過程中執(zhí)行調(diào)節(jié)功能。種類：

cyclinC、D、E、Cln1、Cln2、Cln3舉例：在生長因子的刺激下，cyclinD表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。G1期周期蛋白：只在G1期表達(dá)，只在G1期和S期轉(zhuǎn)化過程中執(zhí)M期周期蛋白：在間期表達(dá)和積累，到M期時(shí)才表現(xiàn)出調(diào)節(jié)功能。種類：cyclinA、cyclinB舉例：

cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1引起染色體凝縮、核膜解體等。M期周期蛋白：在間期表達(dá)和積累，到M期時(shí)才表現(xiàn)出調(diào)節(jié)功能。不同的周期蛋白與不同的CDK結(jié)合，調(diào)節(jié)不同的CDK激酶的活性。不同的周期蛋白與不同的CDK結(jié)合，CDK（

cyclin-dependentkinase）

（1）CDK的種類

（2）CDK的分子結(jié)構(gòu)CDK抑制因子四、CDK和CDK抑制因子CDK（cyclin-dependentkinase）通過PCR技術(shù)構(gòu)建人類、非洲爪蟾、果蠅cDNA文庫，并對其篩選。分離到10多個(gè)cdc2同類基因，不同物種的cdc2基因編碼的蛋白質(zhì)都含有一段相似序列，并且都能和周期蛋白結(jié)合，將其作為調(diào)節(jié)亞基，進(jìn)而表現(xiàn)出激酶活性。它們被統(tǒng)稱為周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependentkinase)，簡稱CDK。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CDK1-CDK13等CDK激酶。1、CDK通過PCR技術(shù)構(gòu)建人類、非洲爪蟾、果蠅cDN（1）與不同類型的周期蛋白相結(jié)合的CDK激酶復(fù)合體脊椎動物芽殖酵母CyclinCDKCyclinCDKG1-CDKCyclinD*CDK4、6Cln3CDK1(CDC28)G1/S-CDKCyclinECDK2Cln1、2CDK1(CDC28)S-CDKCyclinACDK2Clb5、6CDK1(CDC28)M-CDKCyclinBCDK1(CDC2)Clb1-4CDK1(CDC28)*包括D1-3，各亞型cyclinD在不同細(xì)胞中的表達(dá)量不同，但具有相同的功效。（1）與不同類型的周期蛋白相結(jié)合的CDK激酶復(fù)合體脊椎動物芽(2)不同類型的CDK/cyclin復(fù)合物及其參與的細(xì)胞周期調(diào)控(2)不同類型的CDK/cyclin復(fù)合物及其參與的細(xì)胞周期可能與周期蛋白結(jié)合有關(guān)（2）CDK的分子結(jié)構(gòu)不同物種的cdc2基因編碼的蛋白質(zhì)都含有一段相似序列，并且都能和周期蛋白結(jié)合，將其作為調(diào)節(jié)亞基，進(jìn)而表現(xiàn)出激酶活性，被統(tǒng)稱為CDK?？赡芘c周期蛋白結(jié)合有關(guān)（2）CDK的分子結(jié)構(gòu)不同物種的cdcCDK抑制因子（CDKI）：對細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為：①INK4家族:p16為典型代表，主要抑制CDK4和CDK6活性。②Cip/Kip家族：p21為典型代表，主要對G1期CDK（CDK2、CDK3、CDK4和CDK6）起抑制作用。還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA結(jié)合，直接抑制DNA的合成。2、CDKICDK抑制因子（CDKI）：對細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為：2五、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控五、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控細(xì)胞周期中的檢驗(yàn)點(diǎn)G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)：檢查DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：檢查DNA是否損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？中-后期檢驗(yàn)點(diǎn)（紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)）細(xì)胞周期中的檢驗(yàn)點(diǎn)G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)：cellcycleregulationcellcycleregulation1、CDK1激酶Cdc2蛋白：在細(xì)胞周期中，含量相對穩(wěn)定。周期蛋白B：G1期晚期開始合成，G2期達(dá)最大值。周期蛋白B含量達(dá)到一定程度，CDK1激酶活性始現(xiàn)，到G2晚期，CDK1激酶活性最大。（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用1、CDK1激酶Cdc2蛋白：在細(xì)胞周期中，含量相對穩(wěn)定。（（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用cyclinB在CDK1激酶活性調(diào)節(jié)中的作用（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用cyclCDK1激酶使某些蛋白質(zhì)磷酸化，改變其下游的某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和啟動其功能，實(shí)現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞周期。例如：組蛋白H1磷酸化：導(dǎo)致染色體的凝集；核纖層蛋白A、B、C磷酸化：導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失；核仁蛋白磷酸化：導(dǎo)致核仁解體。CDK1激酶使某些蛋白質(zhì)磷酸化，改變其下游的某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件2、CDK1激酶活性的調(diào)控先決條件：周期蛋白與CDK結(jié)合修飾：對一些重要位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化修飾，對CDK激酶活性起重要調(diào)節(jié)作用。2、CDK1激酶活性的調(diào)控先決條件：周期蛋白與CDK結(jié)合CDK1激酶活性的綜合調(diào)控（教材p305）CDK1激酶活性的綜合調(diào)控（教材p305）（二）M期周期蛋白與分裂中期向后期轉(zhuǎn)化細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)到分裂中期后，M期周期蛋白B/A

與CDK1分離，在APC介導(dǎo)下，通過泛素化途徑而降解。CDK1激酶活性喪失，蛋白質(zhì)（CDK1激酶磷酸化的）去磷酸化，細(xì)胞周期由中期向后期轉(zhuǎn)化。（二）M期周期蛋白與分裂中期向后期轉(zhuǎn)化細(xì)胞周在分裂中期，當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，激活后期促進(jìn)復(fù)合物APC，將泛素連接在cyclinB上，cyclinB被蛋白酶體降解，完成一個(gè)細(xì)胞周期。M期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱破壞框(destructionbox)。泛素由76個(gè)氨基酸組成，高度保守。共價(jià)結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識別和降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。26S蛋白酶體是一個(gè)大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。在分裂中期，當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，激活后期促進(jìn)復(fù)合物APCAPC活性調(diào)節(jié)：兩類正調(diào)控因子：cdc20/Fizzy,cdh1/Fzy等負(fù)調(diào)控因子：Emi1,Emi2,Mad2,BubR1等APC種類：15種，如cdc16,cdc23,cdc27和BimE等APC活性調(diào)節(jié)：兩類APC種類：15種，如cdc16,cd泛素與周期蛋白的降解：多聚泛素化作用(polyubiquitination)●泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzyme,E1)

●泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugatingenzyme,E2)

●泛素連接酶(ubiquitinligase,E3)泛素與周期蛋白的降解：多聚泛素化作用(polyubiquitAPC的活性調(diào)節(jié)控制周期蛋白B的降解◆當(dāng)MPF的活性在有絲分裂中期達(dá)到最高峰時(shí),它被CDK所激活，即APC磷酸化后被激活；◆接著發(fā)生周期蛋白B遍在蛋白多聚化,引起周期蛋白B的降解；◆由于周期蛋白B是MPF的一個(gè)必需亞基,它的降解勢必導(dǎo)致MPF的失活；◆在G1期的后期,APC失活,使得周期蛋白B的濃度升高,同時(shí)提高M(jìn)PF的活性,以便進(jìn)入下一個(gè)有絲分裂期。APC的活性調(diào)節(jié)控制周期蛋白B的降解--第十四章細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞課件（三）G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴性CDKG1期，在生長因子的刺激下，cyclinD表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb蛋白（成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白）磷酸化而失活，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。在G1-S期，cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)由G1期向S期轉(zhuǎn)化，并直接參與中心體復(fù)制與調(diào)控。TGFβ抑制cyclinE-CDK2的活性使細(xì)胞抑制在G1期。CyclinE的抗體能使細(xì)胞停滯于G1期。CDK2催化p107磷酸化，釋放E2F。在S期，cyclinA與CDK2結(jié)合為S期的主要激酶，參與DNA復(fù)制，使復(fù)制因子RF-A磷酸化而活性增強(qiáng)。（