醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)：免疫細(xì)胞的檢測(cè)

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)：免疫細(xì)胞的檢測(cè)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離與純化試驗(yàn)、E玫瑰花結(jié)試驗(yàn)試驗(yàn)、溶血空斑試驗(yàn)試驗(yàn)、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離與純化—密度梯度離心法（isolationandpurificationofperipheralbloodmononuclearcell）（主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞1.091.075~1.091.03。1.077±0.002g/L，與單個(gè)核細(xì)胞比重相近。通過(guò)離心后，各種血液成分將按其密度梯度重新分布聚集，從而將單個(gè)核細(xì)胞與其他血細(xì)胞分離。[材料]（1.070.002g/（200U/m、Ca2+、Mg2+Hank’s的臺(tái)盼藍(lán)染液。離心管、毛細(xì)吸管、水平離心機(jī)、注射器等。[方法]無(wú)菌采集人靜脈血2m，用肝素溶液抗凝（每1ml全血加20U肝素，加液2ml作等倍稀釋。用毛細(xì)吸管將稀釋的抗凝血沿管壁輕緩地加入盛有2~3ml管中，使血液重疊于分層液上，兩者間保持界面清晰。將加好血液的離心管置水平離心機(jī)離心20min后小心取出離心后血液成分分布如圖 。圖 密度梯度離心法分離前后血細(xì)胞分層示意圖釋液及血小板后，再用另一支毛細(xì)吸管仔細(xì)吸出單個(gè)核細(xì)胞層，用5倍體積的Hank’s液洗31500rpm。0.5mlRPMI-1640培養(yǎng)基（10%滅活的小牛血清）0.1ml細(xì)胞懸液與4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)：細(xì)胞數(shù)（/ml）=4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)×104×稀釋倍數(shù)421察，活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，計(jì)算活細(xì)胞百分率。[注意事項(xiàng)]操作應(yīng)輕柔，細(xì)胞懸液應(yīng)充分混勻，避免損傷細(xì)胞活性及細(xì)胞丟失。以免影響分離效果。此法分離所得的細(xì)胞懸液中含有少數(shù)單核細(xì)胞特點(diǎn)，可用以下粘附去除法去除：玻璃平皿吸附法：將單個(gè)核細(xì)胞懸液倒入玻璃平皿中，置37℃溫育單核細(xì)胞便粘附在平皿上。吸出未粘附細(xì)胞，即可獲得大于95%的淋巴細(xì)胞。玻璃纖維柱法：將單個(gè)核細(xì)胞懸液倒入裝有玻璃纖維的柱層中，置3745min37Hank’s液沖洗，收集洗脫細(xì)胞，即主要為淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)、E玫瑰花結(jié)試驗(yàn)（erythrocyte rosette test）人體T淋巴細(xì)胞表面具有綿羊紅細(xì)胞redbloodcell，SRBC）T細(xì)胞的特異性標(biāo)志。在體外一定條件下，將TSRBC混合，SRBC能結(jié)合于T細(xì)胞周圍，形成以TSRBC的玫瑰花樣的花結(jié)，稱為E驗(yàn)可用于計(jì)數(shù)T細(xì)胞，了解機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)；也可將SRBC用溴化二氨基異硫氫化物（AET）處理后與T細(xì)胞形成大花結(jié)，再經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液離心花結(jié)形成細(xì)胞，并經(jīng)低滲溶液溶解其中的SRBC而分離T淋巴細(xì)胞。E玫瑰花結(jié)試驗(yàn)分為總E（Et）花結(jié)試驗(yàn)和活性E（Ea）花結(jié)試驗(yàn)。前者檢測(cè)的是標(biāo)本中T淋巴細(xì)胞的總數(shù)，而后者檢測(cè)的是對(duì)SRBC具有高度親和力的那部分T淋巴細(xì)胞。Ea花結(jié)試驗(yàn)更能敏感反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。根據(jù)所需血量的多少，E玫瑰花結(jié)試驗(yàn)分為常量法和微量法。以下介紹常量法。[材料]淋巴細(xì)胞分層液（比重為1.07±0.002g/、（無(wú)a2+g2+溶液。SRBC10ml5mlAlsever4℃冰箱備用。5630min21374℃冰箱備用。0.8%戊二醛。離心機(jī)、毛細(xì)吸管、載玻片等。[方法]無(wú)菌采集人靜脈血1ml，肝素溶液抗凝，用Hank’s液等倍稀釋，經(jīng)密度梯度離心20%Hank＇s2×106/ml的濃度。AlseverSRBC0.02mlHank’s液31500rpm10minSRBCHank’s8×107個(gè)/ml的1%SRBC懸液。按以下流程圖進(jìn)行操作：Et、Ea試驗(yàn)流程圖EtEa淋巴細(xì)胞懸液0.1ml+淋巴細(xì)胞懸液0.1ml+1%SRBC0.1ml1%SRBC0.1ml置37℃水浴10min低速離心500rpm/5min低速離心500rpm/5min置4℃冰箱2h或過(guò)夜取出后吸去部分上清液，輕輕搖勻，加0.8%2151滴液體涂片，自然干燥后作瑞氏染色，油鏡或高倍鏡下觀察結(jié)果。[結(jié)果]133SRBCE200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算Et和Ea花結(jié)形成細(xì)胞的百分率。E玫瑰花結(jié)形成率（%）=形成E花結(jié)細(xì)胞數(shù)×10020060%~80%，Ea25%~40%[]AlseverSRBC2周以內(nèi)可以使用。檢測(cè)的血液標(biāo)本要新鮮，放置時(shí)間不超過(guò)3~4h95%。會(huì)減少或消失。實(shí)驗(yàn)、溶血空斑試驗(yàn)—瓊脂溶血空斑技術(shù)（hemolysisplaquetest）溶血空斑試驗(yàn)是體外檢測(cè)抗體產(chǎn)生細(xì)胞細(xì)胞）的一種方法。其基本原理是將綿羊紅SRBCSRBC溶解，從而在每一個(gè)抗體產(chǎn)生細(xì)胞周圍形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的溶血空斑。本試驗(yàn)主要分為瓊脂溶血空斑技術(shù)和液相單層溶血空斑技術(shù)，每一類又可分為直接法和SRBCSRBC免疫過(guò)的小鼠脾細(xì)胞懸液在45℃下混勻，傾注平皿，然后加入一定量的補(bǔ)體，經(jīng)37℃溫育后，在瓊脂平皿中觀察溶血空斑。[材料]玻璃平皿5.×1.5c、剪刀、鑷子、青霉素小瓶、水浴箱等。1８～2５g小白鼠。pH7.2Ca2+Mg2+SRBC1%DEAE-（1∶3。4．１.4%瓊脂5ml、0.7%瓊脂1.5ml。［方法］（１）免疫小白鼠：每只小白鼠經(jīng)尾靜脈注入2×109/ml的SRBC懸液0.2ml，或腹腔注射4×108/ml的SRBC懸液1ml。（２）制備脾細(xì)胞懸液：將免疫4天后的小白鼠斷頸處死，解剖取出脾臟，放入冷液，用毛細(xì)吸管吹打，使細(xì)胞分散成懸液，靜置3min中，1500rpm5min3mlHank＇s1×107/ml，放4℃冰箱備用。的瓊脂5ml371h后使用。0.7%1.5ml45℃水浴箱中，依次加入1%DEA右旋糖酐0.05m2109l的C懸液0.1m×17l的脾細(xì)胞懸液0.1m，1h。1∶301.5ml371h4℃冰箱過(guò)夜，次日倒去補(bǔ)體，進(jìn)行空斑計(jì)數(shù)。[結(jié)果]將平皿劃分小方格，用