香蕉種植中印楝渣生物藥肥的應用效果分析,植物保護論文

香蕉種植中印楝渣生物藥肥的應用效果分析,植物保護論文內容摘要：【目的】有效利用印楝渣廢棄資源研制印楝渣生物藥肥，并討論其對香蕉生長和香蕉枯萎病的影響?！痉绞椒椒ā繉⒛退幧谰步獾矸垩挎邨U菌HN11〕與印楝渣混合發(fā)酵，制備印楝渣生物藥肥；通過抑菌和盆栽試驗，測定印楝渣生物藥肥對香蕉生長的影響以及對香蕉枯萎病的防治效果；采用掃描電鏡觀察其對病原菌菌絲形態(tài)構造的影響?！窘Y果】生防菌解淀粉芽孢桿菌HN11對香蕉枯萎病菌Foc4有明顯的抑制作用，抑菌率為721%.生防菌株HN11與印楝渣具有良好相容性，制備的印楝渣生物藥肥施用量為5%和10%時，處理組香蕉的長勢好于對照，鮮質量、干質量、株高和莖粗均有不同程度的提高，與對照差異顯著；施用印楝渣生物藥肥組香蕉的病情指數分別為20和25,對香蕉枯萎病的防病率分別到達722%和778%;生防菌HN11能降低土壤中病原菌Foc4孢子數，毀壞菌絲形態(tài)構造。【結論】印楝渣與生防菌HN11發(fā)酵腐熟施用可避免對香蕉產生藥害，制成的印楝渣生物藥肥對香蕉的生長具有明顯促進作用，能有效控制香蕉枯萎病的發(fā)生。本文關鍵詞語：印楝渣；生物藥肥；解淀粉芽孢桿菌；香蕉枯萎?。环乐涡Ч?。香蕉枯萎病又稱巴拿馬病，是由尖孢鐮刀菌古巴?；虵usariumoxysporumf.sp.cubense侵染香蕉所引起的毀壞滅亡性土菌病害，是全球香蕉生產中危害最嚴重的病害[12].當前防治香蕉枯萎病的措施主要有輪作、選育抗病品種、化學防治和生物防治等。但是，香蕉抗病品種育種周期長，短期內難以見效；至今也未研發(fā)出特效或高效的化學藥劑，常規(guī)殺菌劑防治效果不理想，長期使用還將引起農藥殘留、環(huán)境污染、病原菌抗藥性等問題[34].生物防治作為一種生態(tài)安全的防治措施，在香蕉枯萎病防治中越來越遭到重視。施肥防病是最新發(fā)展起來的前沿技術，它改變了傳統的生物防治方式方法，為香蕉枯萎病的防治提供了一種新的途徑[46].生物藥肥具有肥料和殺蟲或殺菌雙重成效，不僅能夠有效減輕病蟲害、大幅減少化學農藥的使用，還能解決一些化學農藥難以解決的問題，對有效利用資源、保衛(wèi)生態(tài)環(huán)境、發(fā)展可持續(xù)農業(yè)具有重要的現實意義。已有報道將生物有機肥與生防菌〔如木霉菌、枯草芽胞桿菌、膠質芽胞桿菌和宏大芽胞桿菌等〕混合使用能夠有效降低香蕉枯萎病的發(fā)病率[4,711].但大多數研究只是將腐熟的有機肥和生防菌簡單混合使用，鮮見以植物有機物為生防菌培養(yǎng)基質和吸附載體制備生物藥肥的報道。印楝渣是殺蟲植物印楝Azadirachtaindica的種仁提取印楝素后的副產品，因其利用率低而被丟棄但印楝渣仍含有少量具有殺蟲、抑菌作用的活性成分，而且還含有大量有機質和微量元素等營養(yǎng)成分以及纖維，可用作生防菌的培養(yǎng)基原料和吸附載體。本研究將耐藥生防菌與印楝渣混合發(fā)酵，制備印楝渣生物藥肥，應用到接種香蕉枯萎病菌的土壤中，討論其對香蕉生長和香蕉枯萎病防治的影響，旨在為印楝渣資源化利用以及印楝渣生物藥肥在香蕉枯萎病生物防治的田間應用提供技術支撐和實踐根據。1材料與方式方法1.1材料解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensHN11從印楝根際土壤中分離并鑒定，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心〔保藏號CGMCCNO:8421〕。香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種〔Fusariumoxysopoyumf.sp.cubenceRace4,Foc4〕由華南農業(yè)大學農學院植物病理系姜子德教授提供；攜帶綠色熒光蛋白GFP標記的尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種〔Foc4GFP〕由廣東省農業(yè)科學院果樹研究所李春雨博士提供。印楝渣為印楝種仁提取印楝素后的副產品，顆粒狀，粒徑為1~2mm.巴西蕉MusaacuminataAAACavendishcv.Brazil營養(yǎng)杯組培苗由廣東省農業(yè)科學院果樹研究所香蕉組培苗中心提供。供試土壤采自華南農業(yè)大學農場，砂壤土，有機質、全氮、全磷、全鉀質量分數分別為2050、112、045和254gkg-1,土壤風干滅菌后備用。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯2000g,蔗糖200g,瓊脂180g,蒸餾水1000mL.NA培養(yǎng)基：蛋白胨100g,牛肉膏30g,氯化鈉50g,瓊脂150g,蒸餾水1000mL.Landy培養(yǎng)基：葡萄糖200g,L-谷氨酸鈉50g,MgSO405g,KCl05g,KH2PO410g,CuSO401610-3g,FeSO401510-3g,MnSO45010-3g,蒸餾水1000mL.CDM培養(yǎng)基：NaNO330g,K2HPO410g,MgSO405g,KCl05g,FeSO4001g,蔗糖300g,瓊脂150g,蒸餾水1000mL.液體基礎培養(yǎng)基：KH2PO410g,〔NH4〕2SO450g,NaCl01g,MgSO47H2O05g,CaCl201g,酵母膏02g,蒸餾水1000mL,pH70.印楝渣固體培養(yǎng)基：印楝渣95%〔w〕，添加麥麩5%〔w〕增加通透性。1.2生防菌對香蕉枯萎病菌的抑制作用1.2.1平板對峙法在PDA培養(yǎng)基平板中心位置一側2cm處接種直徑為5mm的香蕉枯萎病菌菌餅，在另一側對稱處接種一環(huán)經活化的生防菌HN11,以不接種生防菌為對照，28℃倒置黑暗培養(yǎng)5d,觀察生防菌HN11對病原菌菌絲生長的抑制作用。1.2.2抑菌圈法將生防菌HN11在NA培養(yǎng)基上活化，分別挑取一環(huán)接種于含50mLNA培養(yǎng)基、Landy培養(yǎng)基和CDM培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃條件下180rmin-1振蕩培養(yǎng)2d.培養(yǎng)液離心后經022m濾膜過濾，得無菌發(fā)酵液。將香蕉枯萎病菌Foc4在PDA平板上活化，培養(yǎng)7d后，用無菌水沖洗菌絲制得Foc4孢子液；汲取1mL孢子懸浮液〔孢子數為1107cfumL-1〕，參加到融化并冷卻到45℃左右的PDA培養(yǎng)基中，混勻，倒平板。待培養(yǎng)基凝固后，將牛津杯依次放置于培養(yǎng)基上，取100L無菌發(fā)酵液參加牛津杯中，以無菌水作空白對照。置于28℃培養(yǎng)2d,以抑菌圈大小判定生防菌HN11對病原菌Foc4的抑菌活性。1.3生防菌與印楝渣的相容性測定1.3.1印楝渣提取液的抑菌作用取印楝渣10g,分別參加甲醇、乙酸乙酯和蒸餾水各10mL,混勻后置于黑暗中浸提2d,離心取上清液，經022m無菌過濾器過濾除菌后，根據抑菌圈法測定印楝渣的甲醇、乙酸乙酯和水提取液對解淀粉芽孢桿菌HN11生長的影響，以提取溶劑作為對照。以能否產生抑菌圈來判定其對生防菌能否有抑菌活性。1.3.2生防菌的生長測定挑取解淀粉芽孢桿菌HN11單菌落接種至NA液體培養(yǎng)基中，以180rmin-1于28℃搖瓶中培養(yǎng)24h,得種子液。將種子液按2%體積比接入以印楝渣〔80g〕為唯一碳源的液體基礎培養(yǎng)基中，對照分別以葡萄糖〔80g〕、可溶性淀粉〔80g〕或玉米粉〔80g〕作為唯一碳源；分別置于搖瓶中，180rmin-1,28℃條件下培養(yǎng)。48h后分別取1mL發(fā)酵菌液，測定各組的D600nm,判定HN11菌株生長能否以印楝渣為唯一碳源。1.4抑菌機理1.4.1土壤培養(yǎng)法測定抑菌效果試驗設置3個處理：添加印楝渣〔60g〕，接種香蕉枯萎病菌Foc4GFP〔5mL〕；添加生防菌株HN11〔5mL〕，接種香蕉枯萎病菌Foc4GFP〔5mL〕；對照只接種香蕉枯萎病菌Foc4GFP〔5mL〕，不添加印楝渣和生防菌株HN11.稱取240g滅菌土壤，根據試驗處理分別添加印楝渣或生防菌，然后接種5mL攜帶綠色熒光蛋白GFP標記的香蕉枯萎病菌Foc4GFP〔孢子濃度為4107cfumL-1〕，再參加無菌水4mL,混勻后置于培養(yǎng)皿中28℃條件下黑暗培養(yǎng)2d.每處理分別取10g樣品，參加10mL無菌水，搖勻，汲取10L上清液滴于載玻片上，熒光顯微鏡觀察病原菌孢子的萌發(fā)情況，拍照，并統計一樣放大倍數下3個不同視野中的孢子數。1.4.2生防菌對病原菌菌絲形態(tài)構造的影響處理和對照菌絲取自平板對峙法樣品，挑取離生防菌近期的病原菌菌絲，分別參加為3%的戊二醛溶液固定24h,用01molmL-1磷酸緩沖液〔pH72〕漂洗3次，用w為1%的鋨酸溶液固定15h,磷酸緩沖液再漂洗3次；用為30%、50%、75%和90%的乙醇溶液順序脫水各1次，每次10min;然后以為50%、70%、90%和100%的乙酸異戊酯溶液分別漂洗2min.將菌絲置于銅網上枯燥，離子濺射噴金后，掃描電鏡觀察并采集圖像。1.5印楝渣生物藥肥的制備及對香蕉生長和香蕉枯萎病的影響1.5.1印楝渣生物藥肥的制備將生防菌HN11種子液按體積比1%接種量，接入含2L液體NA培養(yǎng)基的5L三角瓶中，28℃條件下180rmin-1振蕩培養(yǎng)2d.將所得發(fā)酵液按150mLkg-1的量接種到印楝渣固體培養(yǎng)基中，混勻后培成梯形堆體，置于室溫發(fā)酵腐熟。發(fā)酵經過中，根據需要補充水分，保持濕度40%~45%,堆體溫度過高時進行翻堆處理。發(fā)酵至堆體不再產熱結束，適當噴灑HN11發(fā)酵液使印楝渣生物藥肥中生防菌的含量大于2108cfug-1.1.5.2對香蕉生長的影響試驗設置3個處理：添加5%〔w〕生物藥肥；添加10%〔w〕印楝渣生物藥肥；不添加生物藥肥〔對照〕。每處理按土質量比將生物藥肥與風干土〔10kg〕混勻，裝入塑料盆。挑選大小一致香蕉苗〔5~6片葉〕，每盆移栽1株，每5盆1組，每組為1個重復，共重復3次。常規(guī)澆水管理，60d后調查香蕉苗生長情況，分別測量鮮質量、干質量、株高和莖粗。1.5.3對香蕉枯萎病的防治試驗設置4個處理：添加5%〔w〕印楝渣生物藥肥，接種Foc4;添加10%〔w〕印楝渣生物藥肥，接種Foc4;不加生物藥肥，接種Foc4〔陽性對照〕；不加生物藥肥，也不接種Foc4〔空白對照〕。每處理按土質量比將生物藥肥與風干土〔10kg〕混勻，裝入塑料盆。每盆移栽大小一致的香蕉苗〔5~6片葉〕1株，每5盆1組，每組為1個重復，共重復3次。待香蕉移栽定植7d后，除空白對照外，其余處理采用傷根澆入法接種，每盆澆灌Foc4孢子懸浮液〔孢子數為1106cfumL-1〕10mL.常規(guī)澆水管理，病原菌接種30d后調查香蕉苗發(fā)病情況，并拍照。1.6數據處理試驗所得數據經Excel2007和SPSS130軟件進行處理及分析