分子病理基礎(chǔ)綱要課件

DepartmentofPathology

SchoolofBasicMedicalSciences

HuangAimin腫瘤的分子病理學(xué)基礎(chǔ)1DepartmentofPathology腫瘤的分子

基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變

癌基因與抑癌基因腫瘤分子病理學(xué)研究方法2基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變2基因結(jié)構(gòu)分子病理改變的主要類型點(diǎn)突變在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個(gè)堿基基因序列大片斷缺失和插入染色體易位重排基因擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常引起mRNA合成異常轉(zhuǎn)錄后及翻譯調(diào)控異常引起蛋白質(zhì)異常3基因結(jié)構(gòu)分子病理改變的主要類型點(diǎn)突變3

1點(diǎn)突變

單個(gè)堿基被另一種堿基取代

1)鹼基替換致氨基酸改變CTC→CCC

亮→脯氨酸2)終止密碼突變,合成比正常長的肽鏈

TAA→TAC

終止→酪氨酸3)突變形成終止密碼,肽鏈變短TGG→TGA

色氨酸→終止4)密碼子改變,氨基酸無改變TCC→TCG

絲氨酸→絲氨酸

錯(cuò)義突變(missense)

無義突變

(nonsense)41點(diǎn)突變單個(gè)堿基被另一種堿基取代錯(cuò)義突變2在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個(gè)堿基

缺失或插入3n個(gè)堿基,引起n個(gè)氨基酸缺失或插入

TACTCC

ACAGCA→TACGCA 酪絲蘇丙→酪丙插入處往后的氨基酸序列完全改變

(Frameshift,移碼突變) TAC

GCAACA→TACAGCAACA 酪丙蘇→酪絲門冬52在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個(gè)堿基5

插入后產(chǎn)生終止密碼，肽鏈變短

CCAAACGCA→CCATAACGCA 脯門冬丙→脯終止插入后終止密碼改變，肽鏈變長

CTCTAAACA→CTCTACAACA 亮終止→亮酪門冬6插入后產(chǎn)生終止密碼，肽鏈變短63基因序列大片斷缺失和插入使功能蛋白缺失或產(chǎn)生異常蛋白視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤－Rb基因大片斷缺失甲型血友?。璄xon14插入2-4Kb片斷

73基因序列大片斷缺失和插入75基因擴(kuò)增基因序列拷貝數(shù)增多，重復(fù)序列增多轉(zhuǎn)錄成mRNA增多翻譯成的蛋白質(zhì)增多85基因擴(kuò)增8

6轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常引起mRNA合成異常

促進(jìn)子、增強(qiáng)子或其它基因調(diào)控因子異常，引起轉(zhuǎn)錄增多，進(jìn)而引起翻譯成的蛋白質(zhì)量增多乳腺癌Her-2基因促進(jìn)子異常，使Her-2轉(zhuǎn)錄增多，蛋白質(zhì)增多96轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常引起mRNA合成異常97轉(zhuǎn)錄后及翻譯調(diào)控異常引起蛋白質(zhì)異常

轉(zhuǎn)錄后及翻譯調(diào)控異常蛋白修飾改變

蛋白質(zhì)量和質(zhì)的異常功能蛋白或酶的異?？芍录?xì)胞轉(zhuǎn)化107轉(zhuǎn)錄后及翻譯調(diào)控異常引起蛋白質(zhì)異常10

基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變

癌基因與抑癌基因腫瘤分子病理學(xué)研究方法

11基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變11

腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)原癌基因、癌基因、腫瘤抑制基因?qū)?xì)胞生長、分化起正向或反向調(diào)節(jié)發(fā)生異常改變，可致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生腫瘤是細(xì)胞中多種基因突變的結(jié)果

oncogenetumorsuppressorgeneDNArepairgene&apoptosis

regulatorygene12腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)原癌基因、癌基因、腫瘤抑制

癌基因與抑癌基因

腫瘤的發(fā)生與癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相關(guān)多步驟，涉及多種癌基因和抑癌基因一種腫瘤可有多種基因的變化同一種基因的改變可在不同腫瘤的發(fā)生中起作用13癌基因與抑癌基因13原癌基因和癌基因的發(fā)現(xiàn)和定義1989年Varmus和Bishop獲諾貝爾獎(jiǎng)

proto-oncogene存在于正常細(xì)胞內(nèi)，編碼促進(jìn)細(xì)胞生長物質(zhì)的基因序列，以非激活的形式存在原癌基因編碼的蛋白質(zhì)多為對正常細(xì)胞生長十分重要的GF&GFR14原癌基因和癌基因的發(fā)現(xiàn)和定義1989年Varmus和

生長因子及生長因子受體

PDGFFGFEGFR

c-sis基因產(chǎn)物是與PDGF相似的蛋白質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（signal-transducingproteins)

H-ras、K-ras和N-ras，均可產(chǎn)生p21蛋白定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的膜結(jié)合蛋白，接收細(xì)胞外生長信號，在細(xì)胞增殖和分化中起重要作用

原癌基因的產(chǎn)物和正常功能15生長因子及生長因子受體原癌基因的產(chǎn)物和正常功能15細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白

CYCD1---細(xì)胞周期蛋白

CDK4-----細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶核調(diào)節(jié)蛋白(nuclearregulatoryproteins)

轉(zhuǎn)錄活化因子

myc、myb、fos

產(chǎn)物為位于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)啟動(dòng)DNA復(fù)制過程，使靜止期細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期1616

原癌基因產(chǎn)物17原癌基因產(chǎn)物17基因變異方式和原癌基因活化點(diǎn)突變-----癌基因活化的主要方式DNA擴(kuò)增---另一主要方式不明原因復(fù)制成多拷貝(

Myc---神經(jīng)母）染色體易位與基因重排---淋巴瘤和白血病

18基因變異方式和原癌基因活化18癌基因甲基化改變---低甲基化且與點(diǎn)突變、基因缺失、基因表達(dá)異常發(fā)生有密切關(guān)系基因過量表達(dá)不適宜的時(shí)間和場合表達(dá)錯(cuò)誤地開啟在胚胎時(shí)期才有活性的基因細(xì)胞癌變的一個(gè)重要因素19癌基因甲基化改變---低甲基化19

癌基因與人類腫瘤1Ras基因變異與腫瘤H-rasK-rasN-ras全長約30kb，由4個(gè)Exon組成均可產(chǎn)生分子量為21KD的蛋白質(zhì)---p21由189個(gè)氨基酸組成P21具有GTP結(jié)合活性，參與信號傳遞許多癌基因的轉(zhuǎn)化作用可能由ras信號系統(tǒng)介導(dǎo)，故ras異常與腫瘤增殖密切相關(guān)20癌基因與人類腫瘤1Ras基因變異與腫瘤20

腫瘤中ras改變基因突變：第12、13、61致瘤性點(diǎn)突變20％肺癌90％胰腺癌80％大腸癌30％前列腺癌10－50％白血病早期胃癌基因過度表達(dá)乳腺癌、胃癌等均有p21ras蛋白增多21 腫瘤中ras改變21

2)基因擴(kuò)增

基因序列拷貝數(shù)增多神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、胃癌、乳腺癌等與腫瘤進(jìn)展、浸潤、預(yù)后、復(fù)發(fā)有關(guān)22223c-erbB-2基因---Neu、Her-2

產(chǎn)物185KD(P185),與EGFR十分相似腫瘤中---基因擴(kuò)增與過度表達(dá)

引起蛋白增多（免疫組化染色增強(qiáng)）

見于30％以上的人類腫瘤乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌

陽性患者抗腫瘤治療敏感性低，預(yù)后差233c-erbB-2基因---Neu、Her-2 23

4c-abl基因

位于第9號染色體上腫瘤中abl基因改變，主要表現(xiàn)為基因重排，與第22號染色體上的Bcr基因片斷形成BCR-ABL融合基因，為費(fèi)城染色體(ph’)的分子基礎(chǔ)

90％慢性粒細(xì)胞性白血病

20％急性淋巴細(xì)胞性白血病244c-abl基因245Bcl-2基因

位于第18號染色體

凋亡調(diào)節(jié)基因，抑制凋亡

Bcl-2基因活化主要由基因重排引起

80％濾泡性淋巴瘤

20％彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤

50％未分化淋巴瘤255Bcl-2基因位于第18號染色體25

6Fos、sis基因乳腺癌、肺癌7Src、Sas基因神經(jīng)母、軟組織肉瘤

8c-Met基因胃癌腺樣結(jié)構(gòu)

9Kit基因胃腸道間質(zhì)瘤

2626

抑癌基因是指在發(fā)生突變、缺失或失活時(shí)可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的基因

腫瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)其根本作用在于抑制細(xì)胞過度增殖抑制癌基因的活化及表達(dá)，或通過使癌基因表達(dá)產(chǎn)物失活，對細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化負(fù)調(diào)節(jié)

抑癌基因27抑癌基因是指在發(fā)生突變、缺失或失活時(shí)可抑癌基因27

抑癌基因失活突變、缺失等而失活對細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)控作用減弱或消失細(xì)胞過度增生且分化不成熟惡性轉(zhuǎn)化Rb,p53,p16,p15,PTEN,BRCA,nm2328抑癌基因失活突變、缺失等而失活對細(xì)胞生長的判定抑癌基因的3個(gè)基本標(biāo)準(zhǔn)惡性腫瘤的相應(yīng)正常組織中該基因須正常表達(dá)惡性腫瘤中該基因功能失活或結(jié)構(gòu)改變或表達(dá)缺陷將該基因的野生型導(dǎo)入瘤細(xì)胞內(nèi),可部分或全部改變其惡性表型29判定抑癌基因的3個(gè)基本標(biāo)準(zhǔn)惡性腫瘤的相應(yīng)正常組織中該基抑癌基因突變的基本病變PointmutationGenelossesGenetranslocationandrearrangementMethylation/hypermethylationLowerexpressionCombinewithoncogeneprotein30抑癌基因突變的基本病變Pointmutatio1p53基因

人p53基因?yàn)榧s20kb的DNA片段位于17號染色體，共有11個(gè)外顯子,轉(zhuǎn)錄出約為2.5kb的mRNA編碼393個(gè)AA組成的53KD核內(nèi)蛋白質(zhì)具蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合功能被《Science》評為1993年的明星分子

常見的抑癌基因與腫瘤311p53基因常見的抑癌基因與腫瘤31

p53蛋白有5個(gè)高度保守區(qū)AAresiduals13-19AAresiduals117-142AAresiduals171-181AAresiduals234-258AAresiduals270-2863232p53是細(xì)胞生長周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子細(xì)胞周期調(diào)控DNA修復(fù)細(xì)胞分化細(xì)胞凋亡33p53是細(xì)胞生長周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子33

腫瘤細(xì)胞p53基因的改變1)點(diǎn)突變或基因小片斷缺失或插入

人腫瘤中最常見的突變（50％－60％）常發(fā)生在第5－8Exon，突變熱點(diǎn)（hotspots)

E5E6E7E8E9E10E11E4E3E2突變相對頻率P53基因組DNA結(jié)構(gòu)34 腫瘤細(xì)胞p53基因的改變E5E6E7E8E9E10E11Hotspots

codon132-143codon174-179codon236-248codon272-281肺癌(273)結(jié)腸癌(175）肝癌(249）乳腺癌(248-258)

胃癌膀胱癌肺癌與肝癌GT結(jié)腸癌GCAT35Hotspots35

2)蛋白的改變

野生型p53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期僅數(shù)分鐘難以檢出基因突變表達(dá)突變型p53蛋白時(shí)，半衰期增加到數(shù)小時(shí),免疫組化可檢出p53蛋白突變型p53蛋白，無抑癌功能362)蛋白的改變36

2Rb基因第一個(gè)被克隆的抑癌基因，最重要首先在Retinoblastoma中發(fā)現(xiàn)，稱為Rb基因1986年美國3個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別獨(dú)立克隆---200kb27Exon，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為4.7kb的mRNAmRNA編碼由928AA組成MW105-110KD的核內(nèi)蛋白，參與細(xì)胞周期調(diào)控磷酸化與非磷酸化兩種形式

372Rb基因37

Rb基因在腫瘤中的改變主要為大片斷缺失和基因突變

RB抑癌基因的缺失或突變而導(dǎo)致P105失活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤骨肉瘤……….43%小細(xì)胞肺癌….47%乳腺癌……….32%與p53,c-myc,c-fos,TGF相互調(diào)節(jié)38 383MTS1基因又稱p16或p16CDK4I

(Multipletumorsuppressor1)4MTS2基因又稱p15CDK6I5CIP1(WAF1)基因編碼p21WAF1蛋白

CIP1(CDK-interacted-protein1)

WAF1(Wildtypep53activatedfragment1)6BRCA1、BRCA2基因

乳腺卵巢癌易感基因

393MTS1基因又稱p16或p16

7APC、DCC基因---抑制信號傳導(dǎo)adenomatouspolyposiscoli,APCdeletedincolorectalcarcinoma,DCC家族性結(jié)腸多發(fā)性息肉病、結(jié)腸癌、胃癌

8PTEN基因

1997年由三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)分離鑒定

MMAC-1（mutatedinmultipleadvancedcancer1)4040

9p63、p73基因DNA序列上與p53基因有很大同源性

10WT1基因腎細(xì)胞分化有關(guān)Wilms瘤中基因缺失或變異

11NF1基因

神經(jīng)纖維瘤病易感基因

4141

多步癌變的分子基礎(chǔ)分子水平改變正常上皮過度增生

形態(tài)學(xué)改變早期腺瘤

晚期腺瘤

結(jié)腸癌

APC缺失或突變中期腺瘤

DNA甲基化喪失

Ras基因突變

DCC基因缺失

P53基因缺失42多步癌變的分子基礎(chǔ)分子水平改變正常上皮過度增生

腫瘤分子病理診斷的意義

腫瘤易感基因病變的診斷

腫瘤的早期診斷與鑒別診斷

疑難腫瘤的診斷及分類

腫瘤病情監(jiān)測

腫瘤的個(gè)體化和預(yù)見性治療

腫瘤的預(yù)后判斷43腫瘤分子病理診斷的意義43

腫瘤易感基因病變的診斷與遺傳相關(guān)的腫瘤易感基因檢測，篩檢腫瘤高危人群已明確的腫瘤易感基因及其相關(guān)腫瘤

Rb---視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤

WT1---腎母細(xì)胞瘤

APC---家族性腺瘤性息肉病

NF1---神經(jīng)纖維瘤病

BRCA1、2、3---乳腺癌44腫瘤易感基因病變的診斷與遺傳相關(guān)的腫瘤易感基因檢測，篩檢

腫瘤基因標(biāo)志與腫瘤診斷

較普遍表達(dá)

H-rasK-rasc-mycc-fos

特異性表達(dá)

abl

臨床診斷意義尚不明確

c-mosc-yesc-fpsc-src45腫瘤基因標(biāo)志與腫瘤診斷45

腫瘤的早期診斷分子病理改變早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變可能檢測出浸潤前期的腫瘤K-ras基因突變---12,13,61胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌FNA檢測胰腺癌第12密碼子突變，檢出率100％P53蛋白的核內(nèi)表達(dá)為多種惡性腫瘤的表現(xiàn)46腫瘤的早期診斷分子病理改變早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變46

腫瘤基因標(biāo)志與腫瘤鑒別診斷erbB：上皮源性腫瘤高表達(dá)erbB：肺大細(xì)胞癌高表達(dá)肺小細(xì)胞癌及黑色素瘤低或不表達(dá)Fms：粒細(xì)胞性白血病高表達(dá)淋巴細(xì)胞性白血病不表達(dá)C-myc激活….B細(xì)胞性淋巴瘤L-myc擴(kuò)增….肺小細(xì)胞癌N-myc擴(kuò)增….神經(jīng)母細(xì)胞瘤47腫瘤基因標(biāo)志與腫瘤鑒別診斷47

疑難腫瘤的診斷及分類判斷淋巴細(xì)胞增生與淋巴細(xì)胞性腫瘤及其克隆起源RFLP和PCR分析Ig或T細(xì)胞受體（TCR)基因的重排B細(xì)胞性淋巴瘤---Ig、

、重鏈（H)重排T細(xì)胞性淋巴瘤---TCR基因重排慢性粒細(xì)胞性白血病----Bcr區(qū)基因重排神經(jīng)母細(xì)胞瘤---N-myc擴(kuò)增與過表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞瘤------C-myc擴(kuò)增與過表達(dá)48疑難腫瘤的診斷及分類判斷淋巴細(xì)胞增生與淋巴細(xì)胞性腫瘤及其

腫瘤的病情監(jiān)測N-myc高表達(dá)….神經(jīng)母惡性進(jìn)展L-myc活性高….肺小細(xì)胞癌惡性度高ras高表達(dá)………前列腺癌低分化H-ras高表達(dá)……胃癌已轉(zhuǎn)移neu高表達(dá)……...癌已轉(zhuǎn)移，存活期短

（乳腺癌及卵巢癌）49腫瘤的病情監(jiān)測49

腫瘤的個(gè)體化和預(yù)見性治療反義治療人工合成特異寡核苷酸導(dǎo)入瘤細(xì)胞，封閉致癌基因的表達(dá)

mycmybfoski-rasH-rasabl-bcr50腫瘤的個(gè)體化和預(yù)見性治療50抑癌基因治療將正常的抑癌基因?qū)霅鹤兗?xì)胞內(nèi)代替或補(bǔ)償有缺陷的抑癌基因，抑制腫瘤生長并逆轉(zhuǎn)其表型

已有報(bào)道將

RBP53APCNF1P21P16

分別導(dǎo)入多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)51抑癌基因治療51

腫瘤的預(yù)后判斷P53p16c-erbB-2乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌的預(yù)后相關(guān)nm23---腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因52腫瘤的預(yù)后判斷P53p16c-erbB

基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變

癌基因與抑癌基因

腫瘤分子病理學(xué)研究方法

53基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變53

病理學(xué)發(fā)展的嶄新變革對疾病的認(rèn)識由表型向基因型過渡傳統(tǒng)的以形態(tài)學(xué)為主“舊生物學(xué)”病理診斷主要依從于經(jīng)驗(yàn)

“新生物學(xué)”+循證病理學(xué)

功能基因組學(xué)和蛋白組學(xué)為技術(shù)平臺54病理學(xué)發(fā)展的嶄新變革54

基因多態(tài)性檢測基因表達(dá)譜分析蛋白表達(dá)譜分析生物芯片生物信息學(xué)bioinformatics成千上萬個(gè)數(shù)據(jù)及其相互關(guān)聯(lián)評價(jià)分子生物學(xué)與病理形態(tài)學(xué)的整合55基因多態(tài)性檢測55

腫瘤病理發(fā)生學(xué)分子診斷和分型，新病種疾病的微生物檢測和診斷疾病進(jìn)展和預(yù)后的評估藥物反應(yīng)，指導(dǎo)個(gè)體化治療增加病理學(xué)診斷的準(zhǔn)確性和權(quán)威性實(shí)驗(yàn)室研究逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用階段應(yīng)用56腫瘤病理發(fā)生學(xué)應(yīng)用56

基因芯片技術(shù)（genechip/DNAchip）1995年Standford大學(xué)醫(yī)學(xué)中心生化系Brown教授首先報(bào)道大量靶基因或寡核苷酸片斷有序高密度排列在載體上—硅片、玻片、尼龍膜芯片陣列儀激光掃描儀計(jì)算機(jī)生物信息軟件處理系統(tǒng)1基因表達(dá)譜分析與腫瘤分子分型P52557基因芯片技術(shù)（genechip/DNAchip）1基

表達(dá)譜基因芯片基因功能的研究診斷芯片檢測芯片遺傳病/代謝病/某些腫瘤的診斷病原微生物檢測

58表達(dá)譜基因芯片58

大規(guī)?；虮磉_(dá)譜分析（largescalegeneexpressionprofiling)基因突變檢測、新基因?qū)ふ铱股睾涂鼓[瘤藥物的篩選疾病的診斷

應(yīng)用59大規(guī)模基因表達(dá)譜分析應(yīng)用59

為腫瘤的精確分型帶來希望基因表達(dá)譜作為特征性“分子標(biāo)簽”（molecularsignature)建立全新的腫瘤分子診斷和分型系統(tǒng)淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌分型60為腫瘤的精確分型帶來希望60

實(shí)驗(yàn)材料要求新鮮組織或培養(yǎng)細(xì)胞中提取的mRNA外周血和培養(yǎng)細(xì)胞樣本的研究較容易對實(shí)體瘤的研究受到一定限制61實(shí)驗(yàn)材料要求61

組織微陣列(tissuemicroarray,TMA)1998年Kononen首次提出《NatureMedicine》

數(shù)十至數(shù)百個(gè)小組織排列于載體上形成的微縮組織切片組織篩選和定位陣列蠟塊制作和切片2組織芯片技術(shù)62組織微陣列(tissuemicroarray,TMA體積小，信息量大，可根據(jù)要求進(jìn)行組合高效快速低消耗地進(jìn)行各種原位組織學(xué)觀察研究形態(tài)學(xué)、免疫組化、原位雜交、原位PCR較好的內(nèi)對照及實(shí)驗(yàn)條件可比性和重復(fù)性63體積小，信息量大，可根據(jù)要求進(jìn)行組合63單獨(dú)或與基因芯片配套用于基因及其蛋白產(chǎn)物的分析和基因功能的研究基因探針的篩選及生物制劑的鑒定組織學(xué)、病理學(xué)實(shí)習(xí)教材外科病理縮微圖譜64單獨(dú)或與基因芯片配套用于基因及其64

直接法---熒光素直接標(biāo)記已知的DNA探針間接法---非熒光標(biāo)記物標(biāo)記已知探針橋連一個(gè)熒光標(biāo)記的抗體DNA-DNA雜交DNA-RNA雜交間期細(xì)胞分裂中期染色體冷凍切片石蠟切片

3熒光原位雜交---FluorescenceISH,FISH653熒光原位雜交---FluorescenceISH,

重復(fù)序列探針位點(diǎn)特異性探針全染色體探針大量商品化的熒光標(biāo)記探針FISH廣泛應(yīng)用成為可能66重復(fù)序列探針66

FDA批準(zhǔn)FISH檢測HER2/c-erbB2實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

評價(jià)預(yù)后基于阿霉素的化療選擇

幫助評價(jià)是否采取曲妥珠單抗(Herceptin,赫賽?。┲委烮HC2+/3+患者，僅FISH陽性者對藥物有反應(yīng)67FDA批準(zhǔn)FISH檢測HER2/c-erbB267

FISH的應(yīng)用

乳腺癌HER2基因診斷肺癌EGFR和HER2基因診斷膀胱癌無創(chuàng)性早期診斷和復(fù)發(fā)的早期檢測胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病等腫瘤基因的分析研究68FISH的應(yīng)用682001年12月31日,美國FDA批準(zhǔn)FISH檢測HER2基因狀態(tài)用于乳腺癌診斷,以指導(dǎo)臨床治療HER2基因?yàn)榧t色熒光，正常HER2拷貝數(shù)(1~5)CEP17為17號染色體著絲粒,為綠色熒光692001年12月31日,美國FDA批準(zhǔn)FISH檢測HER2

常規(guī)PCR是基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)基因突變檢測、測序的前期和基礎(chǔ)易受污染妨礙其臨床應(yīng)用4即時(shí)熒光定量PCR---Real-timePCR70常規(guī)PCR是基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)4即時(shí)熒光定量PCR---R

Real-timePCR

靈敏、定量、特異、封閉無污染提供了對PCR產(chǎn)物積累過程實(shí)時(shí)監(jiān)測微生物病原檢測、腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物臨床應(yīng)用前景寬廣將逐漸成為病理學(xué)必備技術(shù)之一71Real-timePCR71

comparativegenomichybridization,CGH分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)單一的一次雜交檢測某一腫瘤整個(gè)基因組的染色體拷貝數(shù)量的變化

5比較基因組雜交72comparativegenomichybridiza

CGH的優(yōu)點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)所需樣本DNA量較少外周血、培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮組織、存檔組織全基因組范圍內(nèi)分析腫瘤染色體不平衡發(fā)現(xiàn)癌基因和抑癌基因所在區(qū)域腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制研究73CGH的優(yōu)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)所需樣本DNA量較少73

CGH的局限性

所能檢測到的最小的DNA擴(kuò)增或丟失在3-5Mb，對于低水平的DNA擴(kuò)增和小片斷丟失可能漏檢相關(guān)染色體拷貝數(shù)無變化時(shí)，不能檢測出平行染色體的易位74CGH的局限性所能檢測到的最小的DNA擴(kuò)增或丟失在3

lasercapturemicrodissection，LCM從組織切片或細(xì)胞涂片上的任一區(qū)域切割數(shù)百、數(shù)十、單個(gè)細(xì)胞再進(jìn)行PCR、PCR-SSCP、CGH等冷凍切片、石蠟切片、細(xì)胞涂片先常規(guī)或免疫組化染色進(jìn)行定位

6激光捕獲顯微切割術(shù)75lasercapturemicrodi

局限性

手工操作技術(shù)難度大LCM操作簡便，耗時(shí)少，取材準(zhǔn)確需特殊設(shè)備，激光器造價(jià)高76局限性手工操作技術(shù)難度大76

Laserscanningconfocalmicroscope

---LSCM

光學(xué)顯微鏡＋激光掃描＋計(jì)算機(jī)圖像處理細(xì)胞CT，顯微CT，三維圖像重建活細(xì)胞長時(shí)間無損傷動(dòng)態(tài)觀察……

原位---動(dòng)態(tài)---定量

7激光掃描共聚焦顯微術(shù)77Laserscanningconfocalmicro

細(xì)胞間通訊，膜流動(dòng)性測定細(xì)胞骨架的構(gòu)成培養(yǎng)細(xì)胞樣本，冷凍切片石蠟包埋標(biāo)本不合適免疫熒光染色或FISH78細(xì)胞間通訊，膜流動(dòng)性測定78精密、準(zhǔn)確、快速、分辨高

快速準(zhǔn)確測定細(xì)胞內(nèi)DNA含量和倍體數(shù)快速進(jìn)行細(xì)胞分選和細(xì)胞收集測定生長分?jǐn)?shù)，診斷惡性腫瘤的參考反映惡性程度和生物學(xué)行為8流式細(xì)胞術(shù)---Flowcytometry，F(xiàn)CM79精密、準(zhǔn)確、快速、分辨高8流式細(xì)胞術(shù)---Flow

在基礎(chǔ)研究和臨床中的應(yīng)用

外周血細(xì)胞的免疫表型測定和定量分析某一特定細(xì)胞群的篩選和收集細(xì)胞MDR基因的檢測細(xì)胞凋亡的定量研究癌基因和抑癌基因的檢測細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)與核酸的定量分析80在基礎(chǔ)研究和臨床中的應(yīng)用外周血細(xì)胞的免疫表型測定和定

定量核形態(tài)參數(shù)的測定

直徑/周長/面積/體積

區(qū)別良惡性腫瘤、癌前病變與癌腫瘤的組織病理分級、預(yù)后判斷DNA倍體分析和顯色反應(yīng)的定量

免疫組化原位雜交

9圖像分析技術(shù)---Imageanalysis

，IA81定量81

雜合性缺失（LOH）檢測

單核苷酸多態(tài)性（SNP)分析

RNA干擾

8282核酸雜交Southern雜交---檢測DNA

Northern雜交---檢測RNADot/Slot雜交---檢測DNA或RNA

原位雜交(Insituhybridization,ISH)應(yīng)用范圍廣DNA和mRNA定性、定位、定量、分布雜交電鏡的亞細(xì)胞定位

10其他常用技術(shù)83核酸雜交10其他常用技術(shù)83

restrictionfragmentlengthpolymorphism,

RFLP

分析

限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性分析GenomicDNA酶切電泳轉(zhuǎn)膜雜交放射自顯影分析基因的變化結(jié)合PCR--PCR-RFLP簡便快速樣本用量少8484

限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)EcoRI

GAATTC

BamH1

GGATCC

CTTAAG

CCTAGG

GTTAGAATTCGAATCCGAGGTTGGATCCCGG

CAATCTTAAGCTTAGGCTCCAACCTAGGGCC8585

WesternBlot

PCR技術(shù)

PCR-RFLP分析

PCR-SSCPDNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

PCR-DNAsequencing

凋亡的檢測

計(jì)算機(jī)重構(gòu)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)86WesternBlot86PCR….酶切….電泳

M

正常

突變GAATTCGCATT失去酶切位點(diǎn)野生型突變型PCR產(chǎn)物PCR-RFLP87GAATTCGCATT失去酶切位點(diǎn)野生型突變型PCR產(chǎn)生物信息學(xué)技術(shù)---bioinformatics

以基因組DNA序列的信息分析為源頭分析基因組結(jié)構(gòu)，尋找或發(fā)現(xiàn)新基因分析基因調(diào)控信息在此基礎(chǔ)上研究基因的功能88生物信息學(xué)技術(shù)---bioinformatics以基因組D

模擬和預(yù)測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能間的關(guān)系為基于靶分子結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)分子改性設(shè)計(jì)提供依據(jù)已在理論生物學(xué)領(lǐng)域占據(jù)核心地位主要任務(wù)是研究生物分子數(shù)據(jù)的獲取、存儲和查詢，發(fā)展數(shù)據(jù)分析方法89模擬和預(yù)測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)89生物信息的收集、存儲、管理與提供分子生物學(xué)的三大核心數(shù)據(jù)庫GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫PDB生物大分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫已成為全世界分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究人員獲取生物分子序列、結(jié)構(gòu)信息的基本來源發(fā)表自己序列或結(jié)構(gòu)測定結(jié)果的重要媒體90生物信息的收集、存儲、管理與提供分子生物學(xué)的三大核心數(shù)據(jù)庫9基因組序列分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析與處理了解基因與疾病的關(guān)系疾病產(chǎn)生的機(jī)制，為疾病的診療提供依據(jù)確定新藥的作用靶點(diǎn)和作用方式設(shè)計(jì)新的藥物分子生物學(xué)數(shù)據(jù)的處理和分析91基因組序列分析生物學(xué)數(shù)據(jù)的處理和分析91開發(fā)研制管理分析數(shù)據(jù)的新工具和實(shí)用軟件，為生物信息學(xué)的具體應(yīng)用服務(wù)與大規(guī)模基因表達(dá)譜分析相關(guān)算法和軟件基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究與基因組信息相關(guān)的核酸、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測和模擬蛋白質(zhì)功能預(yù)測的研究生物學(xué)數(shù)據(jù)的有效利用92生物學(xué)數(shù)據(jù)的有效利用92現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)展生物芯片技術(shù)蛋白質(zhì)二維凝膠電泳技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定技術(shù)新形式的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的信息挖掘已納入生物信息學(xué)的研究范疇后基因組時(shí)代的生物信息學(xué)技術(shù)將為基因組功能預(yù)測、透視基因相互作用及其機(jī)制、生物學(xué)虛擬實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建等提供強(qiáng)大支撐93現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)展生物芯片技術(shù)93生物分子信息處理流程

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)信息知識基因工程蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)疾病診斷疾病治療新藥開發(fā)94生物分子信息處理流程數(shù)據(jù)信息知識基因工程94

極大豐富了判斷預(yù)后、預(yù)測因素的生物學(xué)標(biāo)志物內(nèi)容不斷涌現(xiàn)新的疾病單位、病理分子分型使感染性疾病的微生物學(xué)檢測和診斷特異、敏感、易行，與組織學(xué)檢查同步增加病理診斷的準(zhǔn)確性和權(quán)威性

分子診斷進(jìn)入病理診斷領(lǐng)域95極大豐富了判斷預(yù)后、預(yù)測因素的生物分子診斷進(jìn)入病理診斷

DepartmentofPathology

SchoolofBasicMedicalSciences

HuangAimin腫瘤的分子病理學(xué)基礎(chǔ)96DepartmentofPathology腫瘤的分子

基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變

癌基因與抑癌基因腫瘤分子病理學(xué)研究方法97基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變2基因結(jié)構(gòu)分子病理改變的主要類型點(diǎn)突變在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個(gè)堿基基因序列大片斷缺失和插入染色體易位重排基因擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常引起mRNA合成異常轉(zhuǎn)錄后及翻譯調(diào)控異常引起蛋白質(zhì)異常98基因結(jié)構(gòu)分子病理改變的主要類型點(diǎn)突變3

1點(diǎn)突變

單個(gè)堿基被另一種堿基取代

1)鹼基替換致氨基酸改變CTC→CCC

亮→脯氨酸2)終止密碼突變,合成比正常長的肽鏈

TAA→TAC

終止→酪氨酸3)突變形成終止密碼,肽鏈變短TGG→TGA

色氨酸→終止4)密碼子改變,氨基酸無改變TCC→TCG

絲氨酸→絲氨酸

錯(cuò)義突變(missense)

無義突變

(nonsense)991點(diǎn)突變單個(gè)堿基被另一種堿基取代錯(cuò)義突變2在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個(gè)堿基

缺失或插入3n個(gè)堿基,引起n個(gè)氨基酸缺失或插入

TACTCC

ACAGCA→TACGCA 酪絲蘇丙→酪丙插入處往后的氨基酸序列完全改變

(Frameshift,移碼突變) TAC

GCAACA→TACAGCAACA 酪丙蘇→酪絲門冬1002在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個(gè)堿基5

插入后產(chǎn)生終止密碼，肽鏈變短

CCAAACGCA→CCATAACGCA 脯門冬丙→脯終止插入后終止密碼改變，肽鏈變長

CTCTAAACA→CTCTACAACA 亮終止→亮酪門冬101插入后產(chǎn)生終止密碼，肽鏈變短63基因序列大片斷缺失和插入使功能蛋白缺失或產(chǎn)生異常蛋白視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤－Rb基因大片斷缺失甲型血友?。璄xon14插入2-4Kb片斷

1023基因序列大片斷缺失和插入75基因擴(kuò)增基因序列拷貝數(shù)增多，重復(fù)序列增多轉(zhuǎn)錄成mRNA增多翻譯成的蛋白質(zhì)增多1035基因擴(kuò)增8

6轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常引起mRNA合成異常

促進(jìn)子、增強(qiáng)子或其它基因調(diào)控因子異常，引起轉(zhuǎn)錄增多，進(jìn)而引起翻譯成的蛋白質(zhì)量增多乳腺癌Her-2基因促進(jìn)子異常，使Her-2轉(zhuǎn)錄增多，蛋白質(zhì)增多1046轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常引起mRNA合成異常97轉(zhuǎn)錄后及翻譯調(diào)控異常引起蛋白質(zhì)異常

轉(zhuǎn)錄后及翻譯調(diào)控異常蛋白修飾改變

蛋白質(zhì)量和質(zhì)的異常功能蛋白或酶的異常可致細(xì)胞轉(zhuǎn)化1057轉(zhuǎn)錄后及翻譯調(diào)控異常引起蛋白質(zhì)異常10

基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變

癌基因與抑癌基因腫瘤分子病理學(xué)研究方法

106基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變11

腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)原癌基因、癌基因、腫瘤抑制基因?qū)?xì)胞生長、分化起正向或反向調(diào)節(jié)發(fā)生異常改變，可致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生腫瘤是細(xì)胞中多種基因突變的結(jié)果

oncogenetumorsuppressorgeneDNArepairgene&apoptosis

regulatorygene107腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)原癌基因、癌基因、腫瘤抑制

癌基因與抑癌基因

腫瘤的發(fā)生與癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相關(guān)多步驟，涉及多種癌基因和抑癌基因一種腫瘤可有多種基因的變化同一種基因的改變可在不同腫瘤的發(fā)生中起作用108癌基因與抑癌基因13原癌基因和癌基因的發(fā)現(xiàn)和定義1989年Varmus和Bishop獲諾貝爾獎(jiǎng)

proto-oncogene存在于正常細(xì)胞內(nèi)，編碼促進(jìn)細(xì)胞生長物質(zhì)的基因序列，以非激活的形式存在原癌基因編碼的蛋白質(zhì)多為對正常細(xì)胞生長十分重要的GF&GFR109原癌基因和癌基因的發(fā)現(xiàn)和定義1989年Varmus和

生長因子及生長因子受體

PDGFFGFEGFR

c-sis基因產(chǎn)物是與PDGF相似的蛋白質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（signal-transducingproteins)

H-ras、K-ras和N-ras，均可產(chǎn)生p21蛋白定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的膜結(jié)合蛋白，接收細(xì)胞外生長信號，在細(xì)胞增殖和分化中起重要作用

原癌基因的產(chǎn)物和正常功能110生長因子及生長因子受體原癌基因的產(chǎn)物和正常功能15細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白

CYCD1---細(xì)胞周期蛋白

CDK4-----細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶核調(diào)節(jié)蛋白(nuclearregulatoryproteins)

轉(zhuǎn)錄活化因子

myc、myb、fos

產(chǎn)物為位于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)啟動(dòng)DNA復(fù)制過程，使靜止期細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期11116

原癌基因產(chǎn)物112原癌基因產(chǎn)物17基因變異方式和原癌基因活化點(diǎn)突變-----癌基因活化的主要方式DNA擴(kuò)增---另一主要方式不明原因復(fù)制成多拷貝(

Myc---神經(jīng)母）染色體易位與基因重排---淋巴瘤和白血病

113基因變異方式和原癌基因活化18癌基因甲基化改變---低甲基化且與點(diǎn)突變、基因缺失、基因表達(dá)異常發(fā)生有密切關(guān)系基因過量表達(dá)不適宜的時(shí)間和場合表達(dá)錯(cuò)誤地開啟在胚胎時(shí)期才有活性的基因細(xì)胞癌變的一個(gè)重要因素114癌基因甲基化改變---低甲基化19

癌基因與人類腫瘤1Ras基因變異與腫瘤H-rasK-rasN-ras全長約30kb，由4個(gè)Exon組成均可產(chǎn)生分子量為21KD的蛋白質(zhì)---p21由189個(gè)氨基酸組成P21具有GTP結(jié)合活性，參與信號傳遞許多癌基因的轉(zhuǎn)化作用可能由ras信號系統(tǒng)介導(dǎo)，故ras異常與腫瘤增殖密切相關(guān)115癌基因與人類腫瘤1Ras基因變異與腫瘤20

腫瘤中ras改變基因突變：第12、13、61致瘤性點(diǎn)突變20％肺癌90％胰腺癌80％大腸癌30％前列腺癌10－50％白血病早期胃癌基因過度表達(dá)乳腺癌、胃癌等均有p21ras蛋白增多116 腫瘤中ras改變21

2)基因擴(kuò)增

基因序列拷貝數(shù)增多神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、胃癌、乳腺癌等與腫瘤進(jìn)展、浸潤、預(yù)后、復(fù)發(fā)有關(guān)117223c-erbB-2基因---Neu、Her-2

產(chǎn)物185KD(P185),與EGFR十分相似腫瘤中---基因擴(kuò)增與過度表達(dá)

引起蛋白增多（免疫組化染色增強(qiáng)）

見于30％以上的人類腫瘤乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌

陽性患者抗腫瘤治療敏感性低，預(yù)后差1183c-erbB-2基因---Neu、Her-2 23

4c-abl基因

位于第9號染色體上腫瘤中abl基因改變，主要表現(xiàn)為基因重排，與第22號染色體上的Bcr基因片斷形成BCR-ABL融合基因，為費(fèi)城染色體(ph’)的分子基礎(chǔ)

90％慢性粒細(xì)胞性白血病

20％急性淋巴細(xì)胞性白血病1194c-abl基因245Bcl-2基因

位于第18號染色體

凋亡調(diào)節(jié)基因，抑制凋亡

Bcl-2基因活化主要由基因重排引起

80％濾泡性淋巴瘤

20％彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤

50％未分化淋巴瘤1205Bcl-2基因位于第18號染色體25

6Fos、sis基因乳腺癌、肺癌7Src、Sas基因神經(jīng)母、軟組織肉瘤

8c-Met基因胃癌腺樣結(jié)構(gòu)

9Kit基因胃腸道間質(zhì)瘤

12126

抑癌基因是指在發(fā)生突變、缺失或失活時(shí)可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的基因

腫瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)其根本作用在于抑制細(xì)胞過度增殖抑制癌基因的活化及表達(dá)，或通過使癌基因表達(dá)產(chǎn)物失活，對細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化負(fù)調(diào)節(jié)

抑癌基因122抑癌基因是指在發(fā)生突變、缺失或失活時(shí)可抑癌基因27

抑癌基因失活突變、缺失等而失活對細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)控作用減弱或消失細(xì)胞過度增生且分化不成熟惡性轉(zhuǎn)化Rb,p53,p16,p15,PTEN,BRCA,nm23123抑癌基因失活突變、缺失等而失活對細(xì)胞生長的判定抑癌基因的3個(gè)基本標(biāo)準(zhǔn)惡性腫瘤的相應(yīng)正常組織中該基因須正常表達(dá)惡性腫瘤中該基因功能失活或結(jié)構(gòu)改變或表達(dá)缺陷將該基因的野生型導(dǎo)入瘤細(xì)胞內(nèi),可部分或全部改變其惡性表型124判定抑癌基因的3個(gè)基本標(biāo)準(zhǔn)惡性腫瘤的相應(yīng)正常組織中該基抑癌基因突變的基本病變PointmutationGenelossesGenetranslocationandrearrangementMethylation/hypermethylationLowerexpressionCombinewithoncogeneprotein125抑癌基因突變的基本病變Pointmutatio1p53基因

人p53基因?yàn)榧s20kb的DNA片段位于17號染色體，共有11個(gè)外顯子,轉(zhuǎn)錄出約為2.5kb的mRNA編碼393個(gè)AA組成的53KD核內(nèi)蛋白質(zhì)具蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合功能被《Science》評為1993年的明星分子

常見的抑癌基因與腫瘤1261p53基因常見的抑癌基因與腫瘤31

p53蛋白有5個(gè)高度保守區(qū)AAresiduals13-19AAresiduals117-142AAresiduals171-181AAresiduals234-258AAresiduals270-28612732p53是細(xì)胞生長周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子細(xì)胞周期調(diào)控DNA修復(fù)細(xì)胞分化細(xì)胞凋亡128p53是細(xì)胞生長周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子33

腫瘤細(xì)胞p53基因的改變1)點(diǎn)突變或基因小片斷缺失或插入

人腫瘤中最常見的突變（50％－60％）常發(fā)生在第5－8Exon，突變熱點(diǎn)（hotspots)

E5E6E7E8E9E10E11E4E3E2突變相對頻率P53基因組DNA結(jié)構(gòu)129 腫瘤細(xì)胞p53基因的改變E5E6E7E8E9E10E11Hotspots

codon132-143codon174-179codon236-248codon272-281肺癌(273)結(jié)腸癌(175）肝癌(249）乳腺癌(248-258)

胃癌膀胱癌肺癌與肝癌GT結(jié)腸癌GCAT130Hotspots35

2)蛋白的改變

野生型p53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期僅數(shù)分鐘難以檢出基因突變表達(dá)突變型p53蛋白時(shí)，半衰期增加到數(shù)小時(shí),免疫組化可檢出p53蛋白突變型p53蛋白，無抑癌功能1312)蛋白的改變36

2Rb基因第一個(gè)被克隆的抑癌基因，最重要首先在Retinoblastoma中發(fā)現(xiàn)，稱為Rb基因1986年美國3個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別獨(dú)立克隆---200kb27Exon，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為4.7kb的mRNAmRNA編碼由928AA組成MW105-110KD的核內(nèi)蛋白，參與細(xì)胞周期調(diào)控磷酸化與非磷酸化兩種形式

1322Rb基因37

Rb基因在腫瘤中的改變主要為大片斷缺失和基因突變

RB抑癌基因的缺失或突變而導(dǎo)致P105失活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤骨肉瘤……….43%小細(xì)胞肺癌….47%乳腺癌……….32%與p53,c-myc,c-fos,TGF相互調(diào)節(jié)133 383MTS1基因又稱p16或p16CDK4I

(Multipletumorsuppressor1)4MTS2基因又稱p15CDK6I5CIP1(WAF1)基因編碼p21WAF1蛋白

CIP1(CDK-interacted-protein1)

WAF1(Wildtypep53activatedfragment1)6BRCA1、BRCA2基因

乳腺卵巢癌易感基因

1343MTS1基因又稱p16或p16

7APC、DCC基因---抑制信號傳導(dǎo)adenomatouspolyposiscoli,APCdeletedincolorectalcarcinoma,DCC家族性結(jié)腸多發(fā)性息肉病、結(jié)腸癌、胃癌

8PTEN基因

1997年由三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)分離鑒定

MMAC-1（mutatedinmultipleadvancedcancer1)13540

9p63、p73基因DNA序列上與p53基因有很大同源性

10WT1基因腎細(xì)胞分化有關(guān)Wilms瘤中基因缺失或變異

11NF1基因

神經(jīng)纖維瘤病易感基因

13641

多步癌變的分子基礎(chǔ)分子水平改變正常上皮過度增生

形態(tài)學(xué)改變早期腺瘤

晚期腺瘤

結(jié)腸癌

APC缺失或突變中期腺瘤

DNA甲基化喪失

Ras基因突變

DCC基因缺失

P53基因缺失137多步癌變的分子基礎(chǔ)分子水平改變正常上皮過度增生

腫瘤分子病理診斷的意義

腫瘤易感基因病變的診斷

腫瘤的早期診斷與鑒別診斷

疑難腫瘤的診斷及分類

腫瘤病情監(jiān)測

腫瘤的個(gè)體化和預(yù)見性治療

腫瘤的預(yù)后判斷138腫瘤分子病理診斷的意義43

腫瘤易感基因病變的診斷與遺傳相關(guān)的腫瘤易感基因檢測，篩檢腫瘤高危人群已明確的腫瘤易感基因及其相關(guān)腫瘤

Rb---視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤

WT1---腎母細(xì)胞瘤

APC---家族性腺瘤性息肉病

NF1---神經(jīng)纖維瘤病

BRCA1、2、3---乳腺癌139腫瘤易感基因病變的診斷與遺傳相關(guān)的腫瘤易感基因檢測，篩檢

腫瘤基因標(biāo)志與腫瘤診斷

較普遍表達(dá)

H-rasK-rasc-mycc-fos

特異性表達(dá)

abl

臨床診斷意義尚不明確

c-mosc-yesc-fpsc-src140腫瘤基因標(biāo)志與腫瘤診斷45

腫瘤的早期診斷分子病理改變早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變可能檢測出浸潤前期的腫瘤K-ras基因突變---12,13,61胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌FNA檢測胰腺癌第12密碼子突變，檢出率100％P53蛋白的核內(nèi)表達(dá)為多種惡性腫瘤的表現(xiàn)141腫瘤的早期診斷分子病理改變早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變46

腫瘤基因標(biāo)志與腫瘤鑒別診斷erbB：上皮源性腫瘤高表達(dá)erbB：肺大細(xì)胞癌高表達(dá)肺小細(xì)胞癌及黑色素瘤低或不表達(dá)Fms：粒細(xì)胞性白血病高表達(dá)淋巴細(xì)胞性白血病不表達(dá)C-myc激活….B細(xì)胞性淋巴瘤L-myc擴(kuò)增….肺小細(xì)胞癌N-myc擴(kuò)增….神經(jīng)母細(xì)胞瘤142腫瘤基因標(biāo)志與腫瘤鑒別診斷47

疑難腫瘤的診斷及分類判斷淋巴細(xì)胞增生與淋巴細(xì)胞性腫瘤及其克隆起源RFLP和PCR分析Ig或T細(xì)胞受體（TCR)基因的重排B細(xì)胞性淋巴瘤---Ig、

、重鏈（H)重排T細(xì)胞性淋巴瘤---TCR基因重排慢性粒細(xì)胞性白血病----Bcr區(qū)基因重排神經(jīng)母細(xì)胞瘤---N-myc擴(kuò)增與過表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞瘤------C-myc擴(kuò)增與過表達(dá)143疑難腫瘤的診斷及分類判斷淋巴細(xì)胞增生與淋巴細(xì)胞性腫瘤及其

腫瘤的病情監(jiān)測N-myc高表達(dá)….神經(jīng)母惡性進(jìn)展L-myc活性高….肺小細(xì)胞癌惡性度高ras高表達(dá)………前列腺癌低分化H-ras高表達(dá)……胃癌已轉(zhuǎn)移neu高表達(dá)……...癌已轉(zhuǎn)移，存活期短

（乳腺癌及卵巢癌）144腫瘤的病情監(jiān)測49

腫瘤的個(gè)體化和預(yù)見性治療反義治療人工合成特異寡核苷酸導(dǎo)入瘤細(xì)胞，封閉致癌基因的表達(dá)

mycmybfoski-rasH-rasabl-bcr145腫瘤的個(gè)體化和預(yù)見性治療50抑癌基因治療將正常的抑癌基因?qū)霅鹤兗?xì)胞內(nèi)代替或補(bǔ)償有缺陷的抑癌基因，抑制腫瘤生長并逆轉(zhuǎn)其表型

已有報(bào)道將

RBP53APCNF1P21P16

分別導(dǎo)入多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)146抑癌基因治療51

腫瘤的預(yù)后判斷P53p16c-erbB-2乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌的預(yù)后相關(guān)nm23---腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因147腫瘤的預(yù)后判斷P53p16c-erbB

基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變

癌基因與抑癌基因

腫瘤分子病理學(xué)研究方法

148基因結(jié)構(gòu)的分子病理改變53

病理學(xué)發(fā)展的嶄新變革對疾病的認(rèn)識由表型向基因型過渡傳統(tǒng)的以形態(tài)學(xué)為主“舊生物學(xué)”病理診斷主要依從于經(jīng)驗(yàn)

“新生物學(xué)”+循證病理學(xué)

功能基因組學(xué)和蛋白組學(xué)為技術(shù)平臺149病理學(xué)發(fā)展的嶄新變革54

基因多態(tài)性檢測基因表達(dá)譜分析蛋白表達(dá)譜分析生物芯片生物信息學(xué)bioinformatics成千上萬個(gè)數(shù)據(jù)及其相互關(guān)聯(lián)評價(jià)分子生物學(xué)與病理形態(tài)學(xué)的整合150基因多態(tài)性檢測55

腫瘤病理發(fā)生學(xué)分子診斷和分型，新病種疾病的微生物檢測和診斷疾病進(jìn)展和預(yù)后的評估藥物反應(yīng)，指導(dǎo)個(gè)體化治療增加病理學(xué)診斷的準(zhǔn)確性和權(quán)威性實(shí)驗(yàn)室研究逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用階段應(yīng)用151腫瘤病理發(fā)生學(xué)應(yīng)用56

基因芯片技術(shù)（genechip/DNAchip）1995年Standford大學(xué)醫(yī)學(xué)中心生化系Brown教授首先報(bào)道大量靶基因或寡核苷酸片斷有序高密度排列在載體上—硅片、玻片、尼龍膜芯片陣列儀激光掃描儀計(jì)算機(jī)生物信息軟件處理系統(tǒng)1基因表達(dá)譜分析與腫瘤分子分型P525152基因芯片技術(shù)（genechip/DNAchip）1基

表達(dá)譜基因芯片基因功能的研究診斷芯片檢測芯片遺傳病/代謝病/某些腫瘤的診斷病原微生物檢測

153表達(dá)譜基因芯片58

大規(guī)?；虮磉_(dá)譜分析（largescalegeneexpressionprofiling)基因突變檢測、新基因?qū)ふ铱股睾涂鼓[瘤藥物的篩選疾病的診斷

應(yīng)用154大規(guī)?；虮磉_(dá)譜分析應(yīng)用59

為腫瘤的精確分型帶來希望基因表達(dá)譜作為特征性“分子標(biāo)簽”（molecularsignature)建立全新的腫瘤分子診斷和分型系統(tǒng)淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌分型155為腫瘤的精確分型帶來希望60

實(shí)驗(yàn)材料要求新鮮組織或培養(yǎng)細(xì)胞中提取的mRNA外周血和培養(yǎng)細(xì)胞樣本的研究較容易對實(shí)體瘤的研究受到一定限制156實(shí)驗(yàn)材料要求61

組織微陣列(tissuemicroarray,TMA)1998年Kononen首次提出《NatureMedicine》

數(shù)十至數(shù)百個(gè)小組織排列于載體上形成的微縮組織切片組織篩選和定位陣列蠟塊制作和切片2組織芯片技術(shù)157組織微陣列(tissuemicroarray,TMA體積小，信息量大，可根據(jù)要求進(jìn)行組合高效快速低消耗地進(jìn)行各種原位組織學(xué)觀察研究形態(tài)學(xué)、免疫組化、原位雜交、原位PCR較好的內(nèi)對照及實(shí)驗(yàn)條件可比性和重復(fù)性158體積小，信息量大，可根據(jù)要求進(jìn)行組合63單獨(dú)或與基因芯片配套用于基因及其蛋白產(chǎn)物的分析和基因功能的研究基因探針的篩選及生物制劑的鑒定組織學(xué)、病理學(xué)實(shí)習(xí)教材外科病理縮微圖譜159單獨(dú)或與基因芯片配套用于基因及其64

直接法---熒光素直接標(biāo)記已知的DNA探針間接法---非熒光標(biāo)記物標(biāo)記已知探針橋連一個(gè)熒光標(biāo)記的抗體DNA-DNA雜交DNA-RNA雜交間期細(xì)胞分裂中期染色體冷凍切片石蠟切片

3熒光原位雜交---FluorescenceISH,FISH1603熒光原位雜交---FluorescenceISH,

重復(fù)序列探針位點(diǎn)特異性探針全染色體探針大量商品化的熒光標(biāo)記探針FISH廣泛應(yīng)用成為可能161重復(fù)序列探針66

FDA批準(zhǔn)FISH檢測HER2/c-erbB2實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

評價(jià)預(yù)后基于阿霉素的化療選擇

幫助評價(jià)是否采取曲妥珠單抗(Herceptin,赫賽?。┲委烮HC2+/3+患者，僅FISH陽性者對藥物有反應(yīng)162FDA批準(zhǔn)FISH檢測HER2/c-erbB267

FISH的應(yīng)用

乳腺癌HER2基因診斷肺癌EGFR和HER2基因診斷膀胱癌無創(chuàng)性早期診斷和復(fù)發(fā)的早期檢測胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病等腫瘤基因的分析研究163FISH的應(yīng)用682001年12月31日,美國FDA批準(zhǔn)FISH檢測HER2基因狀態(tài)用于乳腺癌診斷,以指導(dǎo)臨床治療HER2基因?yàn)榧t色熒光，正常HER2拷貝數(shù)(1~5)CEP17為17號染色體著絲粒,為綠色熒光1642001年12月31日,美國FDA批準(zhǔn)FISH檢測HER2

常規(guī)PCR是基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)基因突變檢測、測序的前期和基礎(chǔ)易受污染妨礙其臨床應(yīng)用4即時(shí)熒光定量PCR---Real-timePCR165常規(guī)PCR是基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)4即時(shí)熒光定量PCR---R

Real-timePCR

靈敏、定量、特異、封閉無污染提供了對PCR產(chǎn)物積累過程實(shí)時(shí)監(jiān)測微生物病原檢測、腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物臨床應(yīng)用前景寬廣將逐漸成為病理學(xué)必備技術(shù)之一166Real-timePCR71

comparativegenomichybridization,CGH分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)單一的一次雜交檢測某一腫瘤整個(gè)基因組的染色體拷貝數(shù)量的變化

5比較基因組雜交167comparativegenomichybridiza

CGH的優(yōu)點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)所需樣本DNA量較少外周血、培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮組織、存檔組織全基因組范圍內(nèi)分析腫瘤染色體不平衡發(fā)現(xiàn)癌基因和抑癌基因所在區(qū)域腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制研究168CGH的優(yōu)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)所需樣本DNA量較少73

CGH的局限性

所能檢測到的最小的DNA擴(kuò)增或丟失在3-5Mb，對于低水平的DNA擴(kuò)增和小片斷丟失可能漏檢相關(guān)染色體拷貝數(shù)無變化時(shí)，不能檢測出平行染色體的易位169CGH的局限性所能檢測到的最小的DNA擴(kuò)增或丟失在3

lasercapturemicrodissection，LCM從組織切片或細(xì)胞涂片上的任一區(qū)域切割數(shù)百、數(shù)十、單個(gè)細(xì)胞再進(jìn)行PCR、PCR-SSCP、CGH等冷凍切片、石蠟切片、細(xì)胞涂片先常規(guī)或免疫組化染色進(jìn)行定位

6激光捕獲顯微切割術(shù)170lasercapturemicrodi