mRNA差異顯示技術(shù)解讀課件

mRNA差別顯示技術(shù)林寶山120906032595臨床獸醫(yī)學(xué)2012級(jí)mRNA差別顯示技術(shù)林寶山120906032595臨床主要內(nèi)容

一、概述：mRNA差異顯示技術(shù)二、DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎(chǔ)三、mRNA差異顯示技術(shù)的原理：四、DDRT-PCR目前的應(yīng)用領(lǐng)域五、DDRT-PCR一般操作步驟七、DDRT-PCR的技術(shù)改進(jìn)

六、DDRT-PCR的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)主要內(nèi)容一、概述：mRNA差異顯示技術(shù)二、一.概述：mRNA差異顯示技術(shù)

高等生物大約有3~5萬個(gè)不同的基因，在每一個(gè)正常的體細(xì)胞中都含有相同的基因組拷貝，但在不同的組織細(xì)胞中僅有10%~20%的少部分基因被選擇性表達(dá)，這種選擇性表達(dá)是在發(fā)育過程中細(xì)胞分化的根本原因，是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過程的核心機(jī)制。因此，比較不同組織之間，或相同組織在不同生理?xiàng)l件下，或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因表達(dá)差異，可分離并克隆出這些特異性表達(dá)的基因。研究基因差異表達(dá)的主要技術(shù)有差別雜交(differentialhybridization)扣除（消減）雜交(Subtractivehybridization)mRNA差異顯示技術(shù)(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRT-PCR)抑制消減雜交法(suppressialsubstractivehybridization,SSH)代表性差異分析(Representialdisplayanalysis,RDA)交互扣除RNA差別顯示技術(shù)(RSDD)以及基因表達(dá)系列分析和電子消減一.概述：mRNA差異顯示技術(shù)高等生物大約有3~mRNA差異顯示PCR技術(shù)是1992年由美國(guó)波斯頓Dena-Faber癌癥研究所的LiangPeng博士和ArthurPardee博士建立起來的一種用于鑒定和克隆哺乳動(dòng)物正常生理狀態(tài)和異常狀態(tài)細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的方法,是目前篩選差異表達(dá)基因最有效的方法,同時(shí)，研究mRNA差異相對(duì)于研究DNA差異而言。它排出了非編碼區(qū)（內(nèi)含子）的影響，從而使得研究結(jié)果更加接近于真實(shí)。1、mRNA差別顯示技術(shù)：mRNA差異顯示PCR技術(shù)是1992年由美國(guó)波斯頓Dena-二.DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達(dá)基因強(qiáng)有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術(shù)方面做了大量改進(jìn)，使技術(shù)更適用、更簡(jiǎn)便基于RT-PCR理論，依賴于3種技術(shù)1）RT-PCR技術(shù)2）以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)3）DNA電泳技術(shù)二.DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年三、mRNA差異顯示技術(shù)的原理：

mRNA差異顯示技術(shù)的主要原理是利用cDNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù),PCR擴(kuò)增和高分辨率聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，來顯示PCR產(chǎn)物的差異。其中，反轉(zhuǎn)錄技術(shù)中使用了一系列能與mRNA的Poly（A）尾巴相結(jié)合的錨定寡聚脫氧核苷酸引物OligoT12MN。錨定引物與mRNA的Poly（A）+的兩個(gè)堿基，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下可以啟動(dòng)mRNA群體反轉(zhuǎn)錄。三、mRNA差異顯示技術(shù)的原理：mRNA差異顯示技術(shù)5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機(jī)引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長(zhǎng)dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動(dòng)cDNA第一鏈合成不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴(kuò)增，克隆測(cè)序，同源比對(duì)隨機(jī)結(jié)合到cDNA鏈上5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly四.DDRT-PCR目前的應(yīng)用領(lǐng)域主要用于醫(yī)學(xué)研究的癌癥、神經(jīng)、骨科、病理、生殖等領(lǐng)域動(dòng)植物遺傳、育種，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)及微生物等領(lǐng)域四.DDRT-PCR目前的應(yīng)用領(lǐng)域主要用于醫(yī)學(xué)研究的癌癥、神五.DDRT-PCR一般操作步驟總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄RT-PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳及差異DNA條帶的回收PCR在擴(kuò)增及其產(chǎn)物的回收測(cè)序和數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析實(shí)時(shí)定量PCR五.DDRT-PCR一般操作步驟總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄mRNA差異顯示技術(shù)簡(jiǎn)略流程圖mRNA差異顯示技術(shù)簡(jiǎn)略流程圖六.DDRT-PCR的優(yōu)點(diǎn)以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)靈敏度高，僅需0.2μg的總RNA可以同時(shí)比較多個(gè)樣品間基因表達(dá)的差異可以同時(shí)檢測(cè)到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)過程中可步步驗(yàn)證比較可進(jìn)行多基因家族的表達(dá)分析六.DDRT-PCR的優(yōu)點(diǎn)以RT-PCR和DNA凝膠電泳為

七.DDRT-PCR的缺點(diǎn)假陽性高樣品mRNA可能有部分降解有少量的DNA污染單條帶可能由一種以上cDNA片段所構(gòu)成有些特異cDNA片段太短,在Northern雜交時(shí)檢測(cè)不到雜交信號(hào)PCR擴(kuò)增了一些稀有mRNA片段,在雜交時(shí)顯示不出差異表達(dá)的信號(hào)絕大多數(shù)差異條帶僅含有3’-UTR500bp以內(nèi)的一短片段的信息，這些區(qū)域的序列結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，得不到特異的基因?qū)Φ拓S度mRNA檢出率低七.DDRT-PCR的缺點(diǎn)假陽性高八.DDRT-PCR的技術(shù)改進(jìn)針對(duì)以上不足,特別是假陽性率高的缺點(diǎn)，從以下幾個(gè)方面做了大量改進(jìn)：引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件的優(yōu)化顯示方法假陽性鑒定八.DDRT-PCR的技術(shù)改進(jìn)針對(duì)以上不足,特別是假陽性率高引物設(shè)計(jì)mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴(kuò)增效果最好王夏等在T12MN之前加上了一段T7啟動(dòng)子序列，提高了PCR反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性Liang發(fā)現(xiàn)9~10個(gè)mer長(zhǎng)度的隨機(jī)引物比較適宜Liang還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)長(zhǎng)度為13bp，在5’端增加HindⅢ酶切位點(diǎn)，能更有效的擴(kuò)增，并能提高特異性引物設(shè)計(jì)mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴(kuò)增效果反應(yīng)條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時(shí)，能擴(kuò)增出較多的條帶不同條件下dNTP濃度不是固定不變的1.5-2.0mmol/L的Mg2+濃度效果較好40-42℃的退火溫度通常能得到較好的擴(kuò)增效果，周寧新等在PCR的頭兩個(gè)循環(huán)，用低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟?6℃，在隨后的循環(huán)中退火溫度提高到45℃，獲得了很清晰的電泳圖譜反應(yīng)條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時(shí)，能擴(kuò)增出較多的條帶顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進(jìn)行放射自顯影成像Sanguinetti介紹了一個(gè)快速銀染方法，只需15分鐘，而且容易克隆回收Rompf等通過瓊脂糖凝膠電泳分辨差異cDNA片段余桂華等建立了熒光mRNA差異顯示方法，最大限度地降低了假陽性顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進(jìn)行放假陽性的鑒定Northernblot仍是鑒定差異的一個(gè)主要手段；分析較多條帶，反向Northernblot是較為切合實(shí)際的選擇Heinz通過SSCP分析排除了非差異表達(dá)的cDNA污染Callard把純化后的PCR產(chǎn)物分成兩部分:一部分用于克隆，另一部分用作探針雜交以篩選克隆Sompayra設(shè)計(jì)了向5’步移的方法假陽性的鑒定Northernblot仍是鑒定差異的一個(gè)主要mRNA差異顯示技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成功運(yùn)用于動(dòng)物的胚胎發(fā)育、組織分化、生長(zhǎng)因子激活與抑制、細(xì)胞周期控制、癌變及疾病相關(guān)基因的鑒定和克隆，在植物無性繁殖、形態(tài)發(fā)生、次生代謝、抗逆抗病等方面被用來進(jìn)行基因的鑒定、克隆以及功能研究，并取得很好的結(jié)果。概括起來其主要用途可以歸納為以下三點(diǎn)：第一，尋找差異表達(dá)的基因。第二，研究個(gè)體、種群或品種間轉(zhuǎn)錄水平上的遺傳變異。第三，鑒定經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中控制重要數(shù)量經(jīng)濟(jì)性狀位點(diǎn)的基因。九、mRNA差異顯示技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用：mRNA差異顯示技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成功運(yùn)用于動(dòng)物的胚胎發(fā)育、組織分由于人們認(rèn)識(shí)的基因還不夠全面，特別是對(duì)生物發(fā)生、發(fā)育及病理生理過程中某些新的功能基因和調(diào)控作用認(rèn)識(shí)不足，因此差異顯示技術(shù)將在研究生物進(jìn)化、損傷修復(fù)、癌變及治療反應(yīng)過程中具有重要意義。差顯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)為在該領(lǐng)域中尋找新基因提供了有用的工具。相信隨著不斷的應(yīng)用和技術(shù)的不斷改善，差異顯示技術(shù)必越來越多的在生命科學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基因鑒定、克隆等方面起到更大的作用，對(duì)揭示生物界基因表達(dá)調(diào)控的奧秘將起重要作用。經(jīng)過近幾年的研究，在提高重復(fù)性，降低假陽性方面有所改進(jìn)，尤其mRNA差異顯示試劑盒的商品化，為mRNA差異顯示提供了成套試劑，mRNA差異顯示技術(shù)將會(huì)越來越廣泛的應(yīng)用于生命科學(xué)的研究。對(duì)進(jìn)一步揭開基因表達(dá)調(diào)控的奧秘，將發(fā)揮越來越大的作用。對(duì)mRNA差別顯示技術(shù)的展望：由于人們認(rèn)識(shí)的基因還不夠全面，特別是對(duì)生物發(fā)生、

mRNA差別顯示技術(shù)林寶山120906032595臨床獸醫(yī)學(xué)2012級(jí)mRNA差別顯示技術(shù)林寶山120906032595臨床主要內(nèi)容

一、概述：mRNA差異顯示技術(shù)二、DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎(chǔ)三、mRNA差異顯示技術(shù)的原理：四、DDRT-PCR目前的應(yīng)用領(lǐng)域五、DDRT-PCR一般操作步驟七、DDRT-PCR的技術(shù)改進(jìn)

六、DDRT-PCR的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)主要內(nèi)容一、概述：mRNA差異顯示技術(shù)二、一.概述：mRNA差異顯示技術(shù)

高等生物大約有3~5萬個(gè)不同的基因，在每一個(gè)正常的體細(xì)胞中都含有相同的基因組拷貝，但在不同的組織細(xì)胞中僅有10%~20%的少部分基因被選擇性表達(dá)，這種選擇性表達(dá)是在發(fā)育過程中細(xì)胞分化的根本原因，是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過程的核心機(jī)制。因此，比較不同組織之間，或相同組織在不同生理?xiàng)l件下，或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因表達(dá)差異，可分離并克隆出這些特異性表達(dá)的基因。研究基因差異表達(dá)的主要技術(shù)有差別雜交(differentialhybridization)扣除（消減）雜交(Subtractivehybridization)mRNA差異顯示技術(shù)(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRT-PCR)抑制消減雜交法(suppressialsubstractivehybridization,SSH)代表性差異分析(Representialdisplayanalysis,RDA)交互扣除RNA差別顯示技術(shù)(RSDD)以及基因表達(dá)系列分析和電子消減一.概述：mRNA差異顯示技術(shù)高等生物大約有3~mRNA差異顯示PCR技術(shù)是1992年由美國(guó)波斯頓Dena-Faber癌癥研究所的LiangPeng博士和ArthurPardee博士建立起來的一種用于鑒定和克隆哺乳動(dòng)物正常生理狀態(tài)和異常狀態(tài)細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的方法,是目前篩選差異表達(dá)基因最有效的方法,同時(shí)，研究mRNA差異相對(duì)于研究DNA差異而言。它排出了非編碼區(qū)（內(nèi)含子）的影響，從而使得研究結(jié)果更加接近于真實(shí)。1、mRNA差別顯示技術(shù)：mRNA差異顯示PCR技術(shù)是1992年由美國(guó)波斯頓Dena-二.DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達(dá)基因強(qiáng)有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術(shù)方面做了大量改進(jìn)，使技術(shù)更適用、更簡(jiǎn)便基于RT-PCR理論，依賴于3種技術(shù)1）RT-PCR技術(shù)2）以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)3）DNA電泳技術(shù)二.DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年三、mRNA差異顯示技術(shù)的原理：

mRNA差異顯示技術(shù)的主要原理是利用cDNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù),PCR擴(kuò)增和高分辨率聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，來顯示PCR產(chǎn)物的差異。其中，反轉(zhuǎn)錄技術(shù)中使用了一系列能與mRNA的Poly（A）尾巴相結(jié)合的錨定寡聚脫氧核苷酸引物OligoT12MN。錨定引物與mRNA的Poly（A）+的兩個(gè)堿基，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下可以啟動(dòng)mRNA群體反轉(zhuǎn)錄。三、mRNA差異顯示技術(shù)的原理：mRNA差異顯示技術(shù)5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機(jī)引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長(zhǎng)dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動(dòng)cDNA第一鏈合成不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴(kuò)增，克隆測(cè)序，同源比對(duì)隨機(jī)結(jié)合到cDNA鏈上5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly四.DDRT-PCR目前的應(yīng)用領(lǐng)域主要用于醫(yī)學(xué)研究的癌癥、神經(jīng)、骨科、病理、生殖等領(lǐng)域動(dòng)植物遺傳、育種，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)及微生物等領(lǐng)域四.DDRT-PCR目前的應(yīng)用領(lǐng)域主要用于醫(yī)學(xué)研究的癌癥、神五.DDRT-PCR一般操作步驟總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄RT-PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳及差異DNA條帶的回收PCR在擴(kuò)增及其產(chǎn)物的回收測(cè)序和數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析實(shí)時(shí)定量PCR五.DDRT-PCR一般操作步驟總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄mRNA差異顯示技術(shù)簡(jiǎn)略流程圖mRNA差異顯示技術(shù)簡(jiǎn)略流程圖六.DDRT-PCR的優(yōu)點(diǎn)以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)靈敏度高，僅需0.2μg的總RNA可以同時(shí)比較多個(gè)樣品間基因表達(dá)的差異可以同時(shí)檢測(cè)到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)過程中可步步驗(yàn)證比較可進(jìn)行多基因家族的表達(dá)分析六.DDRT-PCR的優(yōu)點(diǎn)以RT-PCR和DNA凝膠電泳為

七.DDRT-PCR的缺點(diǎn)假陽性高樣品mRNA可能有部分降解有少量的DNA污染單條帶可能由一種以上cDNA片段所構(gòu)成有些特異cDNA片段太短,在Northern雜交時(shí)檢測(cè)不到雜交信號(hào)PCR擴(kuò)增了一些稀有mRNA片段,在雜交時(shí)顯示不出差異表達(dá)的信號(hào)絕大多數(shù)差異條帶僅含有3’-UTR500bp以內(nèi)的一短片段的信息，這些區(qū)域的序列結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，得不到特異的基因?qū)Φ拓S度mRNA檢出率低七.DDRT-PCR的缺點(diǎn)假陽性高八.DDRT-PCR的技術(shù)改進(jìn)針對(duì)以上不足,特別是假陽性率高的缺點(diǎn)，從以下幾個(gè)方面做了大量改進(jìn)：引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件的優(yōu)化顯示方法假陽性鑒定八.DDRT-PCR的技術(shù)改進(jìn)針對(duì)以上不足,特別是假陽性率高引物設(shè)計(jì)mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴(kuò)增效果最好王夏等在T12MN之前加上了一段T7啟動(dòng)子序列，提高了PCR反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性Liang發(fā)現(xiàn)9~10個(gè)mer長(zhǎng)度的隨機(jī)引物比較適宜Liang還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)長(zhǎng)度為13bp，在5’端增加HindⅢ酶切位點(diǎn)，能更有效的擴(kuò)增，并能提高特異性引物設(shè)計(jì)mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴(kuò)增效果反應(yīng)條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時(shí)，能擴(kuò)增出較多的條帶不同條件下dNTP濃度不是固定不變的1.5-2.0mmol/L的Mg2+濃度效果較好40-42℃的退火溫度通常能得到較好的擴(kuò)增效果，周寧新等在PCR的頭兩個(gè)循環(huán)，用低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟?6℃，在隨后的循環(huán)中退火溫度提高到45℃，獲得了很清晰的電泳圖譜反應(yīng)條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時(shí)，能擴(kuò)增出較多的條帶顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進(jìn)行放射自顯影成像Sanguinetti介紹了一個(gè)快速銀染方法，只需15分鐘，而且容易克隆回收Rompf等通過瓊脂糖凝膠電泳分辨差異cDNA片段余桂華等建立了熒光mRNA差異顯示方法，最大限度地降低了假陽性顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進(jìn)行放假陽性的鑒定Northernblot仍是鑒定差異的一個(gè)主要手段；分析較多條帶，反向Northernbl