細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培訓(xùn)課件

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1

細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)。通過細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。因?yàn)樯锂a(chǎn)品都是從細(xì)胞得來，所以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。什么是細(xì)胞培養(yǎng)？2細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)。什么是細(xì)胞培養(yǎng)？2細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)設(shè)備試劑及耗材清洗及滅菌細(xì)胞培養(yǎng)（細(xì)胞生長過程，細(xì)胞來源，細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存，細(xì)胞計(jì)數(shù)，活力測定，細(xì)胞污染）3細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)設(shè)備3細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)3一實(shí)驗(yàn)設(shè)備超凈工作臺(tái)，生物安全柜CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡離心機(jī)電熱恒溫水槽液氮罐純水儀壓力蒸汽消毒器電熱干燥箱4細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一實(shí)驗(yàn)設(shè)備4細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)4

超凈臺(tái)生物安全柜酒精燈（√），離開要熄滅！酒精燈（×）5細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)超凈臺(tái)5CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。倒置顯微鏡6細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。倒6離心機(jī)電熱恒溫水槽液氮：-196℃液氮罐配平7細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)離心機(jī)電熱恒溫水槽液氮：-196℃液氮罐配平7細(xì)胞培養(yǎng)技7純水儀壓力蒸汽滅菌器電熱干燥箱由工作人員操作，注意安全！8細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)純水儀壓力蒸汽滅菌器電熱干燥箱由工8小結(jié)一實(shí)驗(yàn)設(shè)備及功能超凈工作臺(tái)，生物安全柜------操作平臺(tái)CO2培養(yǎng)箱-------------------------細(xì)胞生長的空間倒置顯微鏡-------------------------觀察細(xì)胞離心機(jī)-------------------------------離心收集細(xì)胞電熱恒溫水槽----------------------加熱

液氮罐-------------------------------凍存細(xì)胞純水儀-------------------------------制備一級水壓力蒸汽消毒器--------------------滅菌電熱干燥箱-------------------------烘干器皿（酒精燈安全）9細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)小結(jié)一實(shí)驗(yàn)設(shè)備及功能（酒精燈安全）9細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)9二試劑及耗材培養(yǎng)基緩沖液消化液血清其他耗材10細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二試劑及耗材培養(yǎng)基耗材10細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)10培養(yǎng)基

供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境。成分及作用：氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位碳水化合物：能量來源無機(jī)鹽：幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡維生素：維持細(xì)胞生長的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用11細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)基供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生11培養(yǎng)基分類

DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：成纖維、上皮細(xì)胞（293），一些實(shí)體瘤（Panc-1），原代神經(jīng)元

DMEM（低糖，葡萄糖1000mg/L）：間充質(zhì)干細(xì)胞，單抗細(xì)胞融合

RPMI1640：血液細(xì)胞（HL60）、一些實(shí)體瘤細(xì)胞（BT474）酚紅：PH指示劑（黃色過酸、紫色過堿）；酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素），涉及到激素和誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)，建議選用無酚紅培養(yǎng)基。ATCC/美國模式培養(yǎng)物集存庫12細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)基分類DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：12緩沖液（洗滌細(xì)胞）

PBS：磷酸緩沖鹽溶液——具有pH緩沖作用的等滲鹽溶液（常規(guī)實(shí)驗(yàn)皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸緩沖液，磷酸鹽含量稍低，含有鈣鎂離子，用于胚胎學(xué)方面的研究。

Hanks：平衡鹽溶液——無機(jī)鹽和葡萄糖濃度接近大部分動(dòng)植物細(xì)胞的水平，可作為動(dòng)植物細(xì)胞短期培養(yǎng)(幾個(gè)小時(shí))。

D-Hank’s：不含鈣離子、鎂離子、葡萄糖（使用消化液時(shí)）。13細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)緩沖液（洗滌細(xì)胞）PBS：磷酸緩沖鹽溶液——具有pH緩沖作13消化液胰蛋白酶溶液

使細(xì)胞間蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞離散。使用濃度0.25%。配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清（對胰酶產(chǎn)生抑制作用）的平衡鹽溶液（如PBS、D-Hank’s）。EDTA溶液

一般用其鈉鹽，可溶性較好。有些組織需要Ca2+

、Mg2+來保持其完整性，EDTA可以螯合這些離子，可使細(xì)胞之間裂解。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%，以無鈣、鎂的平衡鹽溶液配制。膠原酶溶液主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分（用胰蛋白酶效果較差），使用Hanks溶液配置，常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）。14細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)消化液胰蛋白酶溶液14細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)14提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷、對培養(yǎng)中的細(xì)胞的起到某些保護(hù)作用。保存血清最好的方法？建議血清保存在-20℃。解凍后存放于4℃時(shí)，請勿超過一個(gè)月。（分裝）如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議從冷凍箱取出后，置于2～8℃冰箱使之緩慢解凍、融解。使用時(shí)，必須將解凍的血清充分混勻，并且勿將血清置于37℃太久。

血清15細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長因15青霉素-鏈霉素溶液

青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.1mg/ml。分別阻止細(xì)菌細(xì)胞壁合成及細(xì)菌蛋白質(zhì)的組成，達(dá)到抑制細(xì)菌生長的作用，防止污染，對真菌和支原體無效。其他實(shí)驗(yàn)所需的試劑：藥物（如ATRA）、檢測試劑（如MTT）、細(xì)胞因子（如SCF）等16細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)青霉素-鏈霉素溶液青霉素的工作濃度為100U/16試劑標(biāo)注規(guī)范試劑名稱NaCl配制濃度0.5mM配制人張三配制日期2016.10.2117細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)試劑標(biāo)注規(guī)范試劑名稱NaCl17細(xì)胞17耗材培養(yǎng)皿、瓶、孔板離心管、移液管槍尖其他18細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)耗材培養(yǎng)皿、瓶、孔板18細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)18小結(jié)二試劑及耗材的分類及用途培養(yǎng)基（成分、分類）緩沖液（PBS、Hanks等）消化液（分類及應(yīng)用）血清（作用、存儲(chǔ)及解凍方法）試劑標(biāo)簽要規(guī)范耗材（分類、用途）19細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)小結(jié)二試劑及耗材的分類及用途培養(yǎng)基（成分、分類）耗材（19在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。（包括：浸泡（潔消精）、超聲波清洗、沖洗、烘干四個(gè)步驟）三清洗及滅菌20細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響20消毒滅菌方法物理消毒滅菌法Co60輻射（γ射線）：破壞生物大分子（塑料制品）紫外線（200-300nm）：30min，阻止細(xì)菌、病毒核酸合成。（細(xì)胞室：用于空氣，操作臺(tái)表面等）濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min，破壞微生物孢子、蛋白變性。（用于大量液體、玻璃器皿、部分塑料耗材、手術(shù)器械等，由工作人員操作）干熱：160℃,2小時(shí)，高熱作用下的氧化作用破壞微生物（耐高溫的玻璃和金屬制品）過濾：0.22μm濾膜過濾除菌（少量試劑）21細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)消毒滅菌方法物理消毒滅菌法21細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)21消毒滅菌方法化學(xué)消毒滅菌法75%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無菌室內(nèi)的壁面處理（蛋白凝固）（不能擦拭有機(jī)玻璃）1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡，皮膚和操作室壁面的擦試消毒（陽離子表面活性劑，能破壞細(xì)胞膜，改變其通透性而起殺菌作用）22細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)消毒滅菌方法22細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)22需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。清洗的步驟滅菌的方法：

-紫外線（超凈臺(tái)、生物安全柜）

-高壓蒸汽滅菌（準(zhǔn)備好放在準(zhǔn)備室502）

-75%酒精（表面消毒，小心酒精燈明火）小結(jié)三清洗及滅菌23細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)小結(jié)三清洗及滅菌23細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)23四細(xì)胞培養(yǎng)生長類型細(xì)胞來源細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞傳代細(xì)胞凍存細(xì)胞計(jì)數(shù)活力測定污染種類24細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)四細(xì)胞培養(yǎng)生長類型細(xì)胞凍存24細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)24細(xì)胞的生長類型

粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。（絕大多數(shù)正常細(xì)胞及實(shí)體瘤細(xì)胞）

懸浮型細(xì)胞：不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。（主要是白血病細(xì)胞等）小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞25細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的生長類型粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才能生25細(xì)胞貼壁過程26細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞貼壁過程26細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)26每代貼壁細(xì)胞的生長過程游離期（接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞體圓球形）貼壁期（細(xì)胞平均在10分鐘－4小時(shí)貼壁，底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等）潛伏期（有生長活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂，一般為6～24小時(shí)對數(shù)生長期（細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長，活力最佳。

最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究）停止期（平臺(tái)期）（細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性）（懸浮細(xì)胞沒有貼壁過程）27細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)每代貼壁細(xì)胞的生長過程27細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)27國內(nèi)可以買到細(xì)胞株的地方有哪些？ATCC（美國模式培養(yǎng)物集存庫）國內(nèi)代理ECACC（歐洲細(xì)胞株、微生物保藏中心）國內(nèi)代理、sigma中國科學(xué)院細(xì)胞研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院（協(xié)和醫(yī)科大學(xué)）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部武漢大學(xué)冷藏中心等細(xì)胞來源28細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)國內(nèi)可以買到細(xì)胞株的地方有哪些？細(xì)胞來源28細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)28

確定細(xì)胞株的培養(yǎng)信息（ATCC）配制培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗）、胰酶、PBS無菌培養(yǎng)瓶、吸管、離心管的準(zhǔn)備準(zhǔn)備工作29細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)準(zhǔn)備工作29細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)29細(xì)胞復(fù)蘇（快融）（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。（2）用培養(yǎng)液稀釋后低速離心10分鐘。（3）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。（4）隔天換液，但貼壁細(xì)胞若未貼壁則勿需處理。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而損傷細(xì)胞。30細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞復(fù)蘇（快融）（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴30細(xì)胞傳代

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。31細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞傳代31細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)31細(xì)胞傳代1懸浮細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶底時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。

2半貼壁細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。離心新鮮培養(yǎng)基懸浮鋪板32細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞傳代1懸浮細(xì)胞傳代離心新鮮培養(yǎng)基懸32細(xì)胞傳代3貼壁細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的0.25％的胰酶。

吸掉上清，加入PBS緩沖液洗滌，棄掉洗液，加入適量胰酶消化液，37℃消化1分鐘左右，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，并離心去上清，重新稀釋后接種。注意：開放式操作，小心謹(jǐn)慎、謹(jǐn)防污染！33細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞傳代33細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)33細(xì)胞凍存（慢凍）1細(xì)胞凍存液（1ml/管）基礎(chǔ)培養(yǎng)基70％胎牛血清20％DMSO10％（二甲基亞砜，一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶對細(xì)胞的損傷。）2細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1-8x106cells/ml緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。34細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞凍存（慢凍）1細(xì)胞凍存液（1ml/管）緩慢冷凍，可使細(xì)34細(xì)胞凍存3慢凍程序傳統(tǒng)方法：4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時(shí)（或過夜）→液氮長期保存。程序降溫盒：利用異丙醇實(shí)現(xiàn)梯度降溫（易揮發(fā)，并且易吸收空氣中的水分，冷凍過程中可以輔助實(shí)現(xiàn)緩慢降溫，每十分鐘降一度）。35細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞凍存3慢凍程序35細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)35細(xì)胞凍存36細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞凍存36細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)36小結(jié)四細(xì)胞培養(yǎng)過程細(xì)胞生長類型及傳代方法細(xì)胞培養(yǎng)過程注意無菌操作（全程）準(zhǔn)備工作復(fù)蘇（快）傳代（無菌）凍存（慢）實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞信息、方法凍存液成分、培養(yǎng)基、耗材程序37細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)小結(jié)四細(xì)胞培養(yǎng)過程細(xì)胞生長類型及傳代方法準(zhǔn)備工作復(fù)蘇37細(xì)胞計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞38細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞38細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)38細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培訓(xùn)課件39細(xì)胞計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)記上不記下，記左不記右。吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡。鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。40細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)40細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)40培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

細(xì)胞活力測定是體外實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。

任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。41細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

細(xì)胞活力測定是體外實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)41培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

1細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)

單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯?xì)胞的增殖能力。克隆形成率＝（克隆形成數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)）×100%優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠，適于貼壁細(xì)胞42細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

1細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)

單個(gè)細(xì)胞在體外增殖42培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

2臺(tái)盼藍(lán)法（0.4%）細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活性。43細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

43細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)43培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

3四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)。原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值。MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。44細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

3四唑鹽（MTT）比色法44細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)44細(xì)胞培養(yǎng)的污染類型細(xì)菌污染真菌污染支原體污染病毒污染非同種細(xì)胞污染化學(xué)污染45細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的污染類型細(xì)菌污染45細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)45細(xì)菌污染小鼠胃癌細(xì)胞的球菌感染46細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)菌污染小鼠胃癌細(xì)胞的球菌感染46細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)46念珠菌污染真菌污染絲狀菌污染47細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)念珠菌污染真菌污染絲狀菌污染47細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)47真菌污染典型的霉菌污染，肉眼看到白色的團(tuán)塊或白點(diǎn)，鏡下呈絲狀。400倍圖片48細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)真菌污染典型的霉菌污染，肉眼看到白色的團(tuán)塊或白點(diǎn)，鏡下呈絲狀48支原體污染支原體污染電鏡照片(X30k)，煎蛋狀和其他形狀

49細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)支原體污染支原體污染電鏡照片(X30k)，煎蛋狀和其他形狀49

細(xì)菌和真菌污染多發(fā)生在傳代、換液、加樣等開放性操作之后。原代操作尤其注意！因此，細(xì)胞培養(yǎng)切記：“無菌”理念貫穿始終，包括：器皿、器械、耗材、培養(yǎng)基、試劑、操作習(xí)慣。（一旦污染、立即棄用?。?/p>

如何避免污染？細(xì)節(jié)決定成??！50細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)菌和真菌污染多發(fā)生在傳代、換液、加樣等開放性50小結(jié)五實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法細(xì)胞活力測定的方法分類、原理及應(yīng)用注意防止細(xì)胞污染51細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)小結(jié)五實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法51細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)51總結(jié)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備的類型及功能試劑及耗材的分類及各自用途清洗物品的過程及滅菌的方法細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞生長過程，細(xì)胞來源細(xì)胞培養(yǎng)過程（復(fù)蘇、傳代及凍存）細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定方法注意無菌操作，防止細(xì)胞污染

52細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)總結(jié)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備的類型及功能52細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)52實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞培養(yǎng)室規(guī)章制度細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室是進(jìn)行各種細(xì)胞培養(yǎng)的凈化實(shí)驗(yàn)室，研究人員經(jīng)申請準(zhǔn)入、培訓(xùn)合格后方可進(jìn)入細(xì)胞室；所有人員必須遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度，接受工作人員的管理。進(jìn)入細(xì)胞室前必須穿工作服、換鞋，非實(shí)驗(yàn)物品不得帶入室內(nèi)。嚴(yán)禁帶入易燃、易爆及其他有毒、有害或有刺激氣味的物品。注意消防安全，杜絕一切可能導(dǎo)致火災(zāi)的行為。不得在細(xì)胞室內(nèi)進(jìn)行病原性微生物等易傳染物的操作；進(jìn)行病毒感染細(xì)胞的操作須報(bào)管理人員備案，在指定的生物安全柜內(nèi)（8室）進(jìn)行，使用一次性耗材，并遵守生物安全操作規(guī)范。實(shí)驗(yàn)室公用物品在使用后必須放回原處，不得外借或帶到其它實(shí)驗(yàn)室；不得擅自更改儀器程序；儀器發(fā)生異常時(shí)，應(yīng)立即向管理人員報(bào)告。若因不按操作規(guī)程使用造成儀器損壞，使用者應(yīng)酌情賠償。配制試劑應(yīng)數(shù)量適當(dāng)，標(biāo)注規(guī)范，按規(guī)定妥善存放。無菌試劑專人專用，防止交叉污染。未經(jīng)允許，不得使用他人物品及翻看他人細(xì)胞。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被污染，應(yīng)立即棄用，禁止繼續(xù)培養(yǎng)和凍存。進(jìn)入細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室的所有新細(xì)胞株，由管理人員建立細(xì)胞株庫。其他細(xì)胞的凍存，由實(shí)驗(yàn)者標(biāo)記明確后存入指定位置。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)清理桌面和地面，整理實(shí)驗(yàn)器材。觀察培養(yǎng)箱，待溫度及CO2濃度正常后方可離開。廢棄物品應(yīng)及時(shí)帶出操作間，進(jìn)行相應(yīng)處理。遵守生物垃圾、利器和生活垃圾分類存放規(guī)定，禁止向水槽內(nèi)倒入雜物、腐蝕性液體和有毒試劑等。53細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞培養(yǎng)室規(guī)章制度53細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)53THANKS!54細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)THANKS!54細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)54細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)55

細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)。通過細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。因?yàn)樯锂a(chǎn)品都是從細(xì)胞得來，所以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。什么是細(xì)胞培養(yǎng)？56細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)。什么是細(xì)胞培養(yǎng)？2細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)56主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)設(shè)備試劑及耗材清洗及滅菌細(xì)胞培養(yǎng)（細(xì)胞生長過程，細(xì)胞來源，細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存，細(xì)胞計(jì)數(shù)，活力測定，細(xì)胞污染）57細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)設(shè)備3細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)57一實(shí)驗(yàn)設(shè)備超凈工作臺(tái)，生物安全柜CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡離心機(jī)電熱恒溫水槽液氮罐純水儀壓力蒸汽消毒器電熱干燥箱58細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一實(shí)驗(yàn)設(shè)備4細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)58

超凈臺(tái)生物安全柜酒精燈（√），離開要熄滅！酒精燈（×）59細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)超凈臺(tái)59CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。倒置顯微鏡60細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。倒60離心機(jī)電熱恒溫水槽液氮：-196℃液氮罐配平61細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)離心機(jī)電熱恒溫水槽液氮：-196℃液氮罐配平7細(xì)胞培養(yǎng)技61純水儀壓力蒸汽滅菌器電熱干燥箱由工作人員操作，注意安全！62細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)純水儀壓力蒸汽滅菌器電熱干燥箱由工62小結(jié)一實(shí)驗(yàn)設(shè)備及功能超凈工作臺(tái)，生物安全柜------操作平臺(tái)CO2培養(yǎng)箱-------------------------細(xì)胞生長的空間倒置顯微鏡-------------------------觀察細(xì)胞離心機(jī)-------------------------------離心收集細(xì)胞電熱恒溫水槽----------------------加熱

液氮罐-------------------------------凍存細(xì)胞純水儀-------------------------------制備一級水壓力蒸汽消毒器--------------------滅菌電熱干燥箱-------------------------烘干器皿（酒精燈安全）63細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)小結(jié)一實(shí)驗(yàn)設(shè)備及功能（酒精燈安全）9細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)63二試劑及耗材培養(yǎng)基緩沖液消化液血清其他耗材64細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二試劑及耗材培養(yǎng)基耗材10細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)64培養(yǎng)基

供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境。成分及作用：氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位碳水化合物：能量來源無機(jī)鹽：幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡維生素：維持細(xì)胞生長的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用65細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)基供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生65培養(yǎng)基分類

DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：成纖維、上皮細(xì)胞（293），一些實(shí)體瘤（Panc-1），原代神經(jīng)元

DMEM（低糖，葡萄糖1000mg/L）：間充質(zhì)干細(xì)胞，單抗細(xì)胞融合

RPMI1640：血液細(xì)胞（HL60）、一些實(shí)體瘤細(xì)胞（BT474）酚紅：PH指示劑（黃色過酸、紫色過堿）；酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素），涉及到激素和誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)，建議選用無酚紅培養(yǎng)基。ATCC/美國模式培養(yǎng)物集存庫66細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)基分類DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：66緩沖液（洗滌細(xì)胞）

PBS：磷酸緩沖鹽溶液——具有pH緩沖作用的等滲鹽溶液（常規(guī)實(shí)驗(yàn)皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸緩沖液，磷酸鹽含量稍低，含有鈣鎂離子，用于胚胎學(xué)方面的研究。

Hanks：平衡鹽溶液——無機(jī)鹽和葡萄糖濃度接近大部分動(dòng)植物細(xì)胞的水平，可作為動(dòng)植物細(xì)胞短期培養(yǎng)(幾個(gè)小時(shí))。

D-Hank’s：不含鈣離子、鎂離子、葡萄糖（使用消化液時(shí)）。67細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)緩沖液（洗滌細(xì)胞）PBS：磷酸緩沖鹽溶液——具有pH緩沖作67消化液胰蛋白酶溶液

使細(xì)胞間蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞離散。使用濃度0.25%。配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清（對胰酶產(chǎn)生抑制作用）的平衡鹽溶液（如PBS、D-Hank’s）。EDTA溶液

一般用其鈉鹽，可溶性較好。有些組織需要Ca2+

、Mg2+來保持其完整性，EDTA可以螯合這些離子，可使細(xì)胞之間裂解。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%，以無鈣、鎂的平衡鹽溶液配制。膠原酶溶液主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分（用胰蛋白酶效果較差），使用Hanks溶液配置，常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）。68細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)消化液胰蛋白酶溶液14細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)68提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷、對培養(yǎng)中的細(xì)胞的起到某些保護(hù)作用。保存血清最好的方法？建議血清保存在-20℃。解凍后存放于4℃時(shí)，請勿超過一個(gè)月。（分裝）如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議從冷凍箱取出后，置于2～8℃冰箱使之緩慢解凍、融解。使用時(shí)，必須將解凍的血清充分混勻，并且勿將血清置于37℃太久。

血清69細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長因69青霉素-鏈霉素溶液

青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.1mg/ml。分別阻止細(xì)菌細(xì)胞壁合成及細(xì)菌蛋白質(zhì)的組成，達(dá)到抑制細(xì)菌生長的作用，防止污染，對真菌和支原體無效。其他實(shí)驗(yàn)所需的試劑：藥物（如ATRA）、檢測試劑（如MTT）、細(xì)胞因子（如SCF）等70細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)青霉素-鏈霉素溶液青霉素的工作濃度為100U/70試劑標(biāo)注規(guī)范試劑名稱NaCl配制濃度0.5mM配制人張三配制日期2016.10.2171細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)試劑標(biāo)注規(guī)范試劑名稱NaCl17細(xì)胞71耗材培養(yǎng)皿、瓶、孔板離心管、移液管槍尖其他72細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)耗材培養(yǎng)皿、瓶、孔板18細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)72小結(jié)二試劑及耗材的分類及用途培養(yǎng)基（成分、分類）緩沖液（PBS、Hanks等）消化液（分類及應(yīng)用）血清（作用、存儲(chǔ)及解凍方法）試劑標(biāo)簽要規(guī)范耗材（分類、用途）73細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)小結(jié)二試劑及耗材的分類及用途培養(yǎng)基（成分、分類）耗材（73在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。（包括：浸泡（潔消精）、超聲波清洗、沖洗、烘干四個(gè)步驟）三清洗及滅菌74細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響74消毒滅菌方法物理消毒滅菌法Co60輻射（γ射線）：破壞生物大分子（塑料制品）紫外線（200-300nm）：30min，阻止細(xì)菌、病毒核酸合成。（細(xì)胞室：用于空氣，操作臺(tái)表面等）濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min，破壞微生物孢子、蛋白變性。（用于大量液體、玻璃器皿、部分塑料耗材、手術(shù)器械等，由工作人員操作）干熱：160℃,2小時(shí)，高熱作用下的氧化作用破壞微生物（耐高溫的玻璃和金屬制品）過濾：0.22μm濾膜過濾除菌（少量試劑）75細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)消毒滅菌方法物理消毒滅菌法21細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)75消毒滅菌方法化學(xué)消毒滅菌法75%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無菌室內(nèi)的壁面處理（蛋白凝固）（不能擦拭有機(jī)玻璃）1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡，皮膚和操作室壁面的擦試消毒（陽離子表面活性劑，能破壞細(xì)胞膜，改變其通透性而起殺菌作用）76細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)消毒滅菌方法22細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)76需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。清洗的步驟滅菌的方法：

-紫外線（超凈臺(tái)、生物安全柜）

-高壓蒸汽滅菌（準(zhǔn)備好放在準(zhǔn)備室502）

-75%酒精（表面消毒，小心酒精燈明火）小結(jié)三清洗及滅菌77細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)小結(jié)三清洗及滅菌23細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)77四細(xì)胞培養(yǎng)生長類型細(xì)胞來源細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞傳代細(xì)胞凍存細(xì)胞計(jì)數(shù)活力測定污染種類78細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)四細(xì)胞培養(yǎng)生長類型細(xì)胞凍存24細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)78細(xì)胞的生長類型

粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。（絕大多數(shù)正常細(xì)胞及實(shí)體瘤細(xì)胞）

懸浮型細(xì)胞：不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。（主要是白血病細(xì)胞等）小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞79細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的生長類型粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才能生79細(xì)胞貼壁過程80細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞貼壁過程26細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)80每代貼壁細(xì)胞的生長過程游離期（接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞體圓球形）貼壁期（細(xì)胞平均在10分鐘－4小時(shí)貼壁，底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等）潛伏期（有生長活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂，一般為6～24小時(shí)對數(shù)生長期（細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長，活力最佳。

最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究）停止期（平臺(tái)期）（細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性）（懸浮細(xì)胞沒有貼壁過程）81細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)每代貼壁細(xì)胞的生長過程27細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)81國內(nèi)可以買到細(xì)胞株的地方有哪些？ATCC（美國模式培養(yǎng)物集存庫）國內(nèi)代理ECACC（歐洲細(xì)胞株、微生物保藏中心）國內(nèi)代理、sigma中國科學(xué)院細(xì)胞研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院（協(xié)和醫(yī)科大學(xué)）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部武漢大學(xué)冷藏中心等細(xì)胞來源82細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)國內(nèi)可以買到細(xì)胞株的地方有哪些？細(xì)胞來源28細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)82

確定細(xì)胞株的培養(yǎng)信息（ATCC）配制培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗）、胰酶、PBS無菌培養(yǎng)瓶、吸管、離心管的準(zhǔn)備準(zhǔn)備工作83細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)準(zhǔn)備工作29細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)83細(xì)胞復(fù)蘇（快融）（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。（2）用培養(yǎng)液稀釋后低速離心10分鐘。（3）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。（4）隔天換液，但貼壁細(xì)胞若未貼壁則勿需處理。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而損傷細(xì)胞。84細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞復(fù)蘇（快融）（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴84細(xì)胞傳代

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。85細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞傳代31細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)85細(xì)胞傳代1懸浮細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶底時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。

2半貼壁細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。離心新鮮培養(yǎng)基懸浮鋪板86細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞傳代1懸浮細(xì)胞傳代離心新鮮培養(yǎng)基懸86細(xì)胞傳代3貼壁細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的0.25％的胰酶。

吸掉上清，加入PBS緩沖液洗滌，棄掉洗液，加入適量胰酶消化液，37℃消化1分鐘左右，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，并離心去上清，重新稀釋后接種。注意：開放式操作，小心謹(jǐn)慎、謹(jǐn)防污染！87細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞傳代33細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)87細(xì)胞凍存（慢凍）1細(xì)胞凍存液（1ml/管）基礎(chǔ)培養(yǎng)基70％胎牛血清20％DMSO10％（二甲基亞砜，一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶對細(xì)胞的損傷。）2細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1-8x106cells/ml緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。88細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞凍存（慢凍）1細(xì)胞凍存液（1ml/管）緩慢冷凍，可使細(xì)88細(xì)胞凍存3慢凍程序傳統(tǒng)方法：4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時(shí)（或過夜）→液氮長期保存。程序降溫盒：利用異丙醇實(shí)現(xiàn)梯度降溫（易揮發(fā)，并且易吸收空氣中的水分，冷凍過程中可以輔助實(shí)現(xiàn)緩慢降溫，每十分鐘降一度）。89細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞凍存3慢凍程序35細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)89細(xì)胞凍存90細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞凍存36細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)90小結(jié)四細(xì)胞培養(yǎng)過程細(xì)胞生長類型及傳代方法細(xì)胞培養(yǎng)過程注意無菌操作（全程）準(zhǔn)備工作復(fù)蘇（快）傳代（無菌）凍存（慢）實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞信息、方法凍存液成分、培養(yǎng)基、耗材程序91細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)小結(jié)四細(xì)胞培養(yǎng)過程細(xì)胞生長類型及傳代方法準(zhǔn)備工作復(fù)蘇91細(xì)胞計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞92細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞38細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)92細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培訓(xùn)課件93細(xì)胞計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)記上不記下，記左不記右。吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡。鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。94細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)40細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)94培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

細(xì)胞活力測定是體外實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。

任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。95細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

細(xì)胞活力測定是體外實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)95培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

1細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)

單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯?xì)胞的增殖能力。克隆形成率＝（克隆形成數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)）×100%優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠，適于貼壁細(xì)胞96細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

1細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)

單個(gè)細(xì)胞在體外增殖96培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

2臺(tái)盼藍(lán)法（0.4%）細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活性。97細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

43細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)97培養(yǎng)細(xì)胞活力