第十講豬鏈球菌病診斷優(yōu)質(zhì)課件

第十講豬鏈球菌病診斷第十講豬鏈球菌病診斷1優(yōu)選第十講豬鏈球菌病診斷優(yōu)選第十講豬鏈球菌病診斷2一、病原分離1采樣活豬：采樣用滅菌棉拭子擦拭扁桃體病死豬：扁桃體、肺、肝、血液，有腦炎癥狀取腦組織，關(guān)節(jié)炎可取關(guān)節(jié)囊液一、病原分離1采樣32分離培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基：THB培養(yǎng)基、綿羊血或馬血平板（2）培養(yǎng)條件：需氧兼性厭氧、37℃、pH7.2

豬鏈球菌2性營養(yǎng)要求比馬鏈球菌獸疫亞種低，后者需加3-5%的犢牛血清2分離培養(yǎng)4二、臨床診斷

主要表現(xiàn)為敗血癥、化膿性淋巴結(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎等。但不同鏈球菌病原引起的癥狀類似，故該診斷不能用于確診。二、臨床診斷主要表現(xiàn)為敗血癥、化膿性淋巴結(jié)炎、腦5關(guān)節(jié)炎癥狀關(guān)節(jié)炎癥狀6敗血癥敗血癥71染色鏡檢豬鏈球菌2型：革蘭氏染色陽性、菌體呈圓形或橢圓形，直徑小于2.0μm，一般呈短鏈或成雙排列，革蘭氏染色陽性，菌體表面能形成莢膜。

二、微生物學診斷1染色鏡檢二、微生物學診斷8ef，mrp，gdh，orf2ZY05719(cps2)馬鏈球菌獸疫亞種：用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察gdh(688bp)mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進行檢測圖2豬鏈球菌2型(ZY05719)5~1um，液體培養(yǎng)基中呈長鏈，菌體表面能形成莢膜。HA9801(cps2)原理：不同種或亞種鏈球菌基因不同，因而用限制性內(nèi)切酶酶切后，其電泳圖譜不同。用多對隨機引物進行PCR擴增，可得到不同的產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多態(tài)性。mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進行檢測馬鏈球菌獸疫亞種豬鏈球菌2型菌（α溶血）圖2豬鏈球菌2型(ZY05719)馬鏈球菌獸疫亞種只能用于定群gdh(688bp)0μm，一般呈短鏈或成雙排列，革蘭氏染色陽性，菌體表面能形成莢膜。V-P試驗陰性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不還原硝酸鹽，不液化明膠。革蘭氏陽性球菌，直徑0.馬鏈球菌獸疫亞種：

革蘭氏陽性球菌，直徑0.5~1um，液體培養(yǎng)基中呈長鏈，菌體表面能形成莢膜。營養(yǎng)要求較高，在5%犢牛血清生長良好。根據(jù)類M蛋白抗原性的差異，該菌至少有15個血清型。ef，mrp，gdh，orf2馬鏈球菌獸疫亞種：9馬鏈球菌獸疫亞種豬鏈球菌2型菌（α溶血）馬鏈球菌獸疫亞種10圖2豬鏈球菌2型

(ZY05719)

第十講豬鏈球菌病診斷優(yōu)質(zhì)課件11ATCC35246株ATCC35246株122培養(yǎng)特性豬鏈球菌2型：

菌落形態(tài)血平板上呈灰白色小菌落，粘稠，2型在綿羊血平板上呈α溶血，馬血平板則呈β溶血。2培養(yǎng)特性13馬鏈球菌獸疫亞種：在血清肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌，開始時有輕度混濁，繼而變清，于管底形成沉淀。于5％綿羊血瓊脂（THA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，大部分菌株形成3～4mm的粘液樣大菌落，產(chǎn)生明顯的β溶血。小部分呈非粘液樣菌落，大小約1mm左右。馬鏈球菌獸疫亞種：143生化鑒定豬鏈球菌2型：

發(fā)酵乳糖、海藻糖、水揚苷，部分菌株發(fā)酵棉實糖、菊糖；不發(fā)酵甘露醇、山梨醇3生化鑒定15ATCC35246株orf2(858bp).在血清肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌，開始時有輕度混濁，繼而變清，于管底形成沉淀。ATCC35246株隨機擴增多態(tài)DNA分析（RAPD）1:HA9801;mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進行檢測革蘭氏陽性球菌，直徑0.用多對隨機引物進行PCR擴增，可得到不同的產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多態(tài)性。革蘭氏染色陽性、菌體呈圓形或橢圓形，直徑小于2.狀取腦組織，關(guān)節(jié)炎可取關(guān)節(jié)囊液小部分呈非粘液樣菌落，大小約1mm左右。HA9801(cps2)M1234用于豬鏈球菌2型快速定型，但要求抗體效價高；馬鏈球菌獸疫亞種：用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察gdh(688bp)原理：不同種或亞種鏈球菌基因不同，因而用限制性內(nèi)切酶酶切后，其電泳圖譜不同。HA9801(cps2)用于豬鏈球菌2型快速定型，但要求抗體效價高；馬鏈球菌獸疫亞種：能水解精氨酸，發(fā)酵乳糖、水揚苷、山梨醇產(chǎn)酸。不能發(fā)酵菊糖、甘露醇、棉子糖和海藻糖。V-P試驗陰性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不還原硝酸鹽，不液化明膠。ATCC35246株馬鏈球菌獸疫亞種：16三、免疫學診斷1玻板凝集實驗用于豬鏈球菌2型快速定型，但要求抗體效價高；馬鏈球菌獸疫亞種只能用于定群

2乳膠凝集實驗敏感性較高，結(jié)果容易判斷，但有非特異性三、免疫學診斷1玻板凝集實驗173免疫熒光豬鏈球菌2型：用MRP特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察，但需用激光共聚焦顯微鏡。馬鏈球菌獸疫亞種：用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察3免疫熒光18MRP單抗介導FITC標記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像

MRP單抗介導FITC標記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像MRP單抗介導FITC標記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像19

SS2多抗介導FITC標記的SS2的激光共聚焦圖像

SS2多抗介導FITC標記的SS2的激光共聚焦圖像20ELISA

常用鏈球菌多克隆抗體包被，以MRP或類M蛋白的單克隆抗體夾心，敏感性高，特異性較強。ELISA21四、分子診斷1多酶電泳法：原理：不同型豬鏈球菌，胞內(nèi)酶分子的氨基酸有差異，因而電荷有差異，在電場中，其遷移率有差異。用于不同型鏈球菌的分析四、分子診斷1多酶電泳法：222限制性酶切圖譜分析

原理：不同種或亞種鏈球菌基因不同，因而用限制性內(nèi)切酶酶切后，其電泳圖譜不同。用于分離株變異分析，亦可用于不同種或型的鑒定2限制性酶切圖譜分析23隨機擴增多態(tài)DNA分析（RAPD）用多對隨機引物進行PCR擴增，可得到不同的產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多態(tài)性?？捎糜诜N或型的鑒定或分離株變異分析隨機擴增多態(tài)DNA分析（RAPD）24PCR豬鏈球菌2型：

mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進行檢測

cps2具有型特異性PCR25bp970744622557mrp,ef,sly,CPS2123451:HA9801;2:ZY05719;3:Marker;4,5:陰性對照bp970744622557mrp,ef,sly26250bp500bp750bpM122000bp1000bpMaker1.HA9801(cps2)2.ZY05719(cps2)cps2250bp500bp750bpM127250bp500bp750bp2000bpM1234ef，mrp，gdh，orf2Maker1.ef(626bp)2.mrp(316bp)3.gdh(688bp)4.orf2(858bp).250bp500bp750bp2000bpM128馬鏈球菌獸疫亞種：用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察原理：不同型豬鏈球菌，胞內(nèi)酶分子的氨基酸有差異，因而電荷有差異，在電場中，其遷移率有差異。隨機擴增多態(tài)DNA分析（RAPD）革蘭氏染色陽性、菌體呈圓形或橢圓形，直徑小于2.0μm，一般呈短鏈或成雙排列，革蘭氏染色陽性，菌體表面能形成莢膜。ef(626bp)發(fā)酵乳糖、海藻糖、水揚苷，部分菌株發(fā)酵mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進行檢測orf2(858bp).原理：不同種或亞種鏈球菌基因不同，因而用限制性內(nèi)切酶酶切后，其電泳圖譜不同。3:Marker;用多對隨機引物進行PCR擴增，可得到不同的產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多態(tài)性。V-P試驗陰性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不還原硝酸鹽，不液化明膠。圖2豬鏈球菌2型(ZY05719)ATCC35246株用多對隨機引物進行PCR擴增，可得到不同的產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多態(tài)性。隨機擴增多態(tài)DNA分析（RAPD）1:HA9801;敏感性較高，結(jié)果容易判斷，但有非特異性圖2豬鏈球菌2型(ZY05719)gdh(688bp)cps2具有型特異性原理：不同種或亞種鏈球菌基因不同，因而用限制性內(nèi)切酶酶切后，其電泳圖譜不同。ATCC35246株V-P試驗陰性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不還原硝酸鹽，不液化明膠。革蘭氏染色陽性、菌體呈圓形或橢圓形，直徑小于2.用于分離株變異分析，亦可用于不同種或型的鑒定V-P試驗陰性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不還原硝酸鹽，不液化明膠。革蘭氏陽性球菌，直徑0.ATCC35246株用于豬鏈球菌2型快速定型，但要求抗體效價高；mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進行檢測原理：不同型豬鏈球菌，胞內(nèi)酶分子的氨基酸有差異，因而電荷有差異，在電場中，其遷移率有差異。用于豬鏈球菌2型快速定型，但要求抗體效價高；隨機擴增多態(tài)DNA分析（RAPD）在血清肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌，開始時有輕度混濁，繼而變清，于管底形成沉淀。用多對隨機引物進行PCR擴增，可得到不同的產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多態(tài)性。0μm，一般呈短鏈或成雙排列，革蘭氏染色陽性，菌體表面能形成莢膜。HA9801(cps2)250bp500bp750bp1000bp2000bp250bp500bp750bp1000bp2000bp1099bp1310bpM1M1slyfbpsMaker1.slyMaker1.fbps馬鏈球菌獸疫亞種：用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀29第十講豬鏈球菌病診斷第十講豬鏈球菌病診斷30優(yōu)選第十講豬鏈球菌病診斷優(yōu)選第十講豬鏈球菌病診斷31一、病原分離1采樣活豬：采樣用滅菌棉拭子擦拭扁桃體病死豬：扁桃體、肺、肝、血液，有腦炎癥狀取腦組織，關(guān)節(jié)炎可取關(guān)節(jié)囊液一、病原分離1采樣322分離培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基：THB培養(yǎng)基、綿羊血或馬血平板（2）培養(yǎng)條件：需氧兼性厭氧、37℃、pH7.2

豬鏈球菌2性營養(yǎng)要求比馬鏈球菌獸疫亞種低，后者需加3-5%的犢牛血清2分離培養(yǎng)33二、臨床診斷

主要表現(xiàn)為敗血癥、化膿性淋巴結(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎等。但不同鏈球菌病原引起的癥狀類似，故該診斷不能用于確診。二、臨床診斷主要表現(xiàn)為敗血癥、化膿性淋巴結(jié)炎、腦34關(guān)節(jié)炎癥狀關(guān)節(jié)炎癥狀35敗血癥敗血癥361染色鏡檢豬鏈球菌2型：革蘭氏染色陽性、菌體呈圓形或橢圓形，直徑小于2.0μm，一般呈短鏈或成雙排列，革蘭氏染色陽性，菌體表面能形成莢膜。

二、微生物學診斷1染色鏡檢二、微生物學診斷37ef，mrp，gdh，orf2ZY05719(cps2)馬鏈球菌獸疫亞種：用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察gdh(688bp)mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進行檢測圖2豬鏈球菌2型(ZY05719)5~1um，液體培養(yǎng)基中呈長鏈，菌體表面能形成莢膜。HA9801(cps2)原理：不同種或亞種鏈球菌基因不同，因而用限制性內(nèi)切酶酶切后，其電泳圖譜不同。用多對隨機引物進行PCR擴增，可得到不同的產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多態(tài)性。mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進行檢測馬鏈球菌獸疫亞種豬鏈球菌2型菌（α溶血）圖2豬鏈球菌2型(ZY05719)馬鏈球菌獸疫亞種只能用于定群gdh(688bp)0μm，一般呈短鏈或成雙排列，革蘭氏染色陽性，菌體表面能形成莢膜。V-P試驗陰性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不還原硝酸鹽，不液化明膠。革蘭氏陽性球菌，直徑0.馬鏈球菌獸疫亞種：

革蘭氏陽性球菌，直徑0.5~1um，液體培養(yǎng)基中呈長鏈，菌體表面能形成莢膜。營養(yǎng)要求較高，在5%犢牛血清生長良好。根據(jù)類M蛋白抗原性的差異，該菌至少有15個血清型。ef，mrp，gdh，orf2馬鏈球菌獸疫亞種：38馬鏈球菌獸疫亞種豬鏈球菌2型菌（α溶血）馬鏈球菌獸疫亞種39圖2豬鏈球菌2型

(ZY05719)

第十講豬鏈球菌病診斷優(yōu)質(zhì)課件40ATCC35246株ATCC35246株412培養(yǎng)特性豬鏈球菌2型：

菌落形態(tài)血平板上呈灰白色小菌落，粘稠，2型在綿羊血平板上呈α溶血，馬血平板則呈β溶血。2培養(yǎng)特性42馬鏈球菌獸疫亞種：在血清肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌，開始時有輕度混濁，繼而變清，于管底形成沉淀。于5％綿羊血瓊脂（THA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，大部分菌株形成3～4mm的粘液樣大菌落，產(chǎn)生明顯的β溶血。小部分呈非粘液樣菌落，大小約1mm左右。馬鏈球菌獸疫亞種：433生化鑒定豬鏈球菌2型：

發(fā)酵乳糖、海藻糖、水揚苷，部分菌株發(fā)酵棉實糖、菊糖；不發(fā)酵甘露醇、山梨醇3生化鑒定44ATCC35246株orf2(858bp).在血清肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌，開始時有輕度混濁，繼而變清，于管底形成沉淀。ATCC35246株隨機擴增多態(tài)DNA分析（RAPD）1:HA9801;mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進行檢測革蘭氏陽性球菌，直徑0.用多對隨機引物進行PCR擴增，可得到不同的產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多態(tài)性。革蘭氏染色陽性、菌體呈圓形或橢圓形，直徑小于2.狀取腦組織，關(guān)節(jié)炎可取關(guān)節(jié)囊液小部分呈非粘液樣菌落，大小約1mm左右。HA9801(cps2)M1234用于豬鏈球菌2型快速定型，但要求抗體效價高；馬鏈球菌獸疫亞種：用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察gdh(688bp)原理：不同種或亞種鏈球菌基因不同，因而用限制性內(nèi)切酶酶切后，其電泳圖譜不同。HA9801(cps2)用于豬鏈球菌2型快速定型，但要求抗體效價高；馬鏈球菌獸疫亞種：能水解精氨酸，發(fā)酵乳糖、水揚苷、山梨醇產(chǎn)酸。不能發(fā)酵菊糖、甘露醇、棉子糖和海藻糖。V-P試驗陰性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不還原硝酸鹽，不液化明膠。ATCC35246株馬鏈球菌獸疫亞種：45三、免疫學診斷1玻板凝集實驗用于豬鏈球菌2型快速定型，但要求抗體效價高；馬鏈球菌獸疫亞種只能用于定群

2乳膠凝集實驗敏感性較高，結(jié)果容易判斷，但有非特異性三、免疫學診斷1玻板凝集實驗463免疫熒光豬鏈球菌2型：用MRP特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察，但需用激光共聚焦顯微鏡。馬鏈球菌獸疫亞種：用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察3免疫熒光47MRP單抗介導FITC標記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像

MRP單抗介導FITC標記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像MRP單抗介導FITC標記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像48

SS2多抗介導FITC標記的SS2的激光共聚焦圖像

SS2多抗介導FITC標記的SS2的激光共聚焦圖像49ELISA

常用鏈球菌多克隆抗體包被，以MRP或類M蛋白的單克隆抗體夾心，敏感性高，特異性較強。ELISA50四、分子診斷1多酶電泳法：原理：不同型豬鏈球菌，胞內(nèi)酶分子的氨基酸有差異，因而電荷有差異，在電場中，其遷移率有差異。用于不同型鏈球菌的分析四、分子診斷1多酶電泳法：512限制性酶切圖譜分析

原理：不同種或亞種鏈球菌基因不同，因而用限制性內(nèi)切酶酶切后，其電泳圖譜不同。用于分離株變異分析，亦可用于不同種或型的鑒定2限制性酶切圖譜分析52隨機擴增多態(tài)DNA分析（RAPD）用多對隨機引物進行PCR擴增，可得到不同的產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多態(tài)性?？捎糜诜N或型的鑒定或分離株變異分析隨機擴增多態(tài)DNA分析（RAPD）53PCR豬鏈球菌2型：

mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進行檢測

cps2具有型特異性PCR54bp970744622557mrp,ef,sly,CPS2123451:HA9801;2:ZY05719;3:Marker;4,5:陰性對照bp970744622557mrp,ef,sly55250bp500bp750bpM122000bp1000bpMaker1.HA9801(cps2)2.ZY05719(cps2)cps2250bp500bp750bpM156250bp500bp750bp2000bpM1234ef，mrp，gdh，orf2Maker1.ef(626bp)2.mrp(316bp)3.gdh(688bp)4.orf2(858bp).250bp500bp750bp2000bpM157馬鏈球菌獸疫亞種：用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察原理：不同型豬鏈球菌，胞內(nèi)酶分子的氨基酸有差異，因而電荷有差異，在電場中，其遷移率有差異。隨機擴增多態(tài)DNA分析（RAPD）革蘭氏染色陽性、菌體呈圓形或橢圓形，直徑小于2.0μm，一般呈短鏈或成雙排列，革蘭氏染色陽性，菌體表面能形成莢膜。ef(626bp)發(fā)酵乳糖、海藻糖、水揚苷，部分菌株發(fā)酵mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均