微生物工程菌種課件2

第二節(jié)菌種來源第二節(jié)菌種來源1微生物工程工業(yè)生產(chǎn)水平的三個(gè)決定要素:

生產(chǎn)菌種的性能發(fā)酵和提取工藝條件生產(chǎn)設(shè)備獲得優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是實(shí)現(xiàn)高水平微生物工程工業(yè)生產(chǎn)的第一環(huán)節(jié).微生物工程工業(yè)生產(chǎn)水平生產(chǎn)菌種的性能獲得優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是實(shí)現(xiàn)2一、菌種分離與篩選工作程序

發(fā)酵工業(yè)上使用的微生物菌種，最初都是從自然界中分離篩選出來的。分離與篩選菌種的具體做法一般分4個(gè)步驟：樣品采集增殖培養(yǎng)純種分離生產(chǎn)性能測(cè)定一、菌種分離與篩選工作程序發(fā)酵工業(yè)上使用的微3

調(diào)查研究（包括資料查閱）試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

采樣第一次增殖培養(yǎng)第一次平板分離第二次增殖培養(yǎng)第二次平板分離增殖條件探索根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行定量或半定量測(cè)定第一次原種斜面第二次原種斜面初篩（1株1瓶）定量或半定量測(cè)定篩選工作程序調(diào)查研究（包括資料查閱）試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)采樣第一次增殖培養(yǎng)4第三次平板分離第三次原種斜面復(fù)篩第四次平板分離不純第四次原種斜面再復(fù)篩種子培養(yǎng)初步工藝條件摸索較優(yōu)菌株1株3-5瓶保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)性能試驗(yàn)或作為育種的出發(fā)菌株某些必要試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)第三次菌種保藏第三次平板分離第三次原種斜面復(fù)篩第四次平板分離不純第四次原種5二、分離與篩選的設(shè)計(jì)要求在篩選所需菌株時(shí)應(yīng)考慮以下一些重要指標(biāo)：1、菌的營(yíng)養(yǎng)特征一般要求采用廉價(jià)的培養(yǎng)基或使用來源豐富的原料2、菌的生長(zhǎng)溫度3、菌的穩(wěn)定性4、菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培養(yǎng)液中的濃度5、菌對(duì)所采用的設(shè)備和生產(chǎn)過程的適應(yīng)性6、容易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物3-6是用來衡量菌種的生產(chǎn)性能，如能滿足這幾條，便有希望成為效益高的生產(chǎn)菌株二、分離與篩選的設(shè)計(jì)要求在篩選所需菌株時(shí)應(yīng)考慮以下一些重要指6三、含微生物樣品的采集較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)分離目的靈活掌握土壤（豐富、5-25cm、土質(zhì)、酸堿度、植被狀況、地理?xiàng)l件、季節(jié)）食品、海水、動(dòng)物、植物、極端環(huán)境

根據(jù)微生物的營(yíng)養(yǎng)類型采樣森林土中有相當(dāng)多枯枝落葉和腐爛的木頭，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng)。肉類加工廠附近、飯店排污溝，易分離到蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌。面粉加工廠等場(chǎng)所易分離到產(chǎn)淀粉酶、糖化酶的菌根據(jù)微生物的生理特性采樣篩選高溫酶產(chǎn)生菌通常從溫泉、火山爆發(fā)處、堆肥等采樣；篩選產(chǎn)低溫酶的微生物，可從冰窖、南極、深海等采樣分離耐高滲透壓酵母菌，可到甜果、蜜餞、甘蔗渣堆積處采樣三、含微生物樣品的采集較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)分離目的靈活掌握土壤（豐7第一章微生物工程菌種課件28第一章微生物工程菌種課件29楊尺蠖楊尺蠖10赤松毛蟲赤松毛蟲11側(cè)柏毛蟲側(cè)柏毛蟲12四、含微生物樣品的富集培養(yǎng)富集(enrichment)培養(yǎng)

是在目的微生物含量較少時(shí)，根據(jù)微生物的生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長(zhǎng)條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長(zhǎng)繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢(shì)種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)種，以利分離到所需的菌株。四、含微生物樣品的富集培養(yǎng)富集(enrichment)培養(yǎng)13其要領(lǐng)是提供一些有利于所需菌株生長(zhǎng)或不利于其他菌型生長(zhǎng)的條件。包括：控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分；控制培養(yǎng)條件；抑制不需要的菌類等?？刂蒲蹩蓪⒑醚跷⑸锖蛥捬跷⑸锓珠_；高溫下培養(yǎng)可將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開；控制pH可分離嗜酸或嗜堿微生物；高糖或高鹽培養(yǎng)基可分離耐高滲透壓微生物；根據(jù)微生物對(duì)環(huán)境因子的耐受范圍具有可塑性的特點(diǎn)，可通過連續(xù)富集培養(yǎng)的方法分離降解高濃度污染物的環(huán)保菌。如降解苯胺的微生物分離?？梢员桨窞槲ㄒ惶荚磳?duì)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，待底物完全降解后，再以一定接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含苯胺的富集培養(yǎng)液中，如此連續(xù)移接培養(yǎng)次數(shù)。同時(shí)將苯胺濃度逐步提高，并可得到降解苯胺占優(yōu)勢(shì)的菌株培養(yǎng)液，采用稀釋涂布法或平板劃線法進(jìn)一步分離，即可得到能降解高濃度苯胺的微生物。其要領(lǐng)是提供一些有利于所需菌株生長(zhǎng)或不利于其他菌型生長(zhǎng)的條件14需注意，所需菌型生長(zhǎng)的結(jié)果有時(shí)會(huì)改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，從而改變選擇壓力。重復(fù)移植幾次后接種少量已富集的培養(yǎng)物到固體培養(yǎng)基上。移植時(shí)間是關(guān)鍵，應(yīng)在所需菌種確已占優(yōu)勢(shì)的情況下進(jìn)行。需注意，所需菌型生長(zhǎng)的結(jié)果有時(shí)會(huì)改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，從而15五、利用固體平板的生化反應(yīng)進(jìn)行分離利用特殊的分離培養(yǎng)對(duì)大量混雜微生物進(jìn)行初步分離的方法。分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計(jì)的?？娠@著提高分離效率透明圈法變色圈法生長(zhǎng)圈法抑菌圈法五、利用固體平板的生化反應(yīng)進(jìn)行分離利用特殊的分離培養(yǎng)對(duì)大16透明圈法

分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；

在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁；

能分解底物的微生物便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)菌株利用底物的能力。透明圈法分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、17土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后鋪在pH8-9的瓊脂培養(yǎng)基（含有均勻的不溶性蛋白質(zhì)）表面；堿性蛋白酶產(chǎn)生菌能消化平板上的不溶性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生一透明圈。例如用此法分離產(chǎn)生堿性蛋白酶的芽孢桿菌土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后鋪在pH8-9的18

分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時(shí)，也通常采用透明圈法初篩在選擇培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板呈混濁狀，產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈聚賴氨酸產(chǎn)生菌（利用產(chǎn)正電分泌物的菌株和美藍(lán)之間的靜電作用而形成獨(dú)特的透明圈,從而靈敏地篩選得到產(chǎn)聚賴氨酸產(chǎn)生菌的菌株)分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時(shí)，也通常采用透明圈法初篩19將待測(cè)菌株接種于蛋黃培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，在菌落周圍產(chǎn)生暈圈（溶脂圈和透明圈）的菌株作為定性篩選解有機(jī)磷細(xì)菌的判斷依據(jù)，以暈圈直徑與菌落直徑比例的大小作為解磷能力大小初篩的判定指標(biāo)

溶脂圈透明圈如何篩選磷細(xì)菌？將待測(cè)菌株接種于蛋黃培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，在菌落周圍產(chǎn)生暈圈（溶20

透明圈的大小不能完全作為選擇高產(chǎn)菌的依據(jù)，因?yàn)樵谏顚优囵B(yǎng)中的產(chǎn)酶單位與平板上圈的大小之間并不完全成正比。

但作為初篩的手段是有意義的透明圈的大小不能完全作為選擇高產(chǎn)菌的依據(jù)，因?yàn)樵谏顚优?12、抑菌圈法

常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選據(jù)估計(jì)，篩選1萬個(gè)菌株才能得到1株有用的抗生素產(chǎn)生菌；因此，設(shè)計(jì)一個(gè)準(zhǔn)確、快速的篩選模型十分重要。抑菌圈法是常用的初篩方法

工具菌采用抗生素的敏感菌若被檢菌能分泌某些抑制菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，如抗生素等，便會(huì)在該菌落周圍形成工具菌不能生長(zhǎng)的抑菌圈2、抑菌圈法常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選據(jù)估計(jì)，篩選122第一章微生物工程菌種課件2233、生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的分離

通過觀察分離菌能否促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的生長(zhǎng)，來檢測(cè)生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌。分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)被殺死的菌落周圍有無檢測(cè)菌的生長(zhǎng)圈影印到能支持生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上Uv照射殺死菌落鋪上一層含相應(yīng)生長(zhǎng)因子缺陷型菌株3、生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的分離通過觀察分離菌能否促進(jìn)營(yíng)24第三節(jié)菌種選育第三節(jié)菌種選育25菌種選育

應(yīng)用微生物遺傳和變異理論，用人工方法(或自然)造成變異，再經(jīng)過篩選以得到人們所需菌種的過程。

菌種選育的目的是為了不斷提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，增加新產(chǎn)品和適應(yīng)工藝改革的要求。菌種選育的方向是選育“吃粗糧”、耐高溫、生長(zhǎng)快、代謝旺、產(chǎn)量高、質(zhì)量好、無毒性的優(yōu)良菌株。菌種選育菌種選育的目的是為了不斷提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量和26自然選育誘變育種雜交育種(有性、準(zhǔn)性)原生質(zhì)體融合育種基因工程育種自然選育27一、自然選育

在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程叫自然選育。

自發(fā)突變(spontaneousmutation)，也稱自然突變，指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變，但這決不意味著這種突變是沒有原因的。

一般認(rèn)為引起自然突變有兩個(gè)原因：即多因素低劑量的誘變效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。

多因素低劑量的誘變效應(yīng)是指自然突變實(shí)際上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長(zhǎng)期綜合效應(yīng)，例如充滿宇宙空間的各種短波輻射、自然界中普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)以及微生物自身代謝活動(dòng)中所產(chǎn)生的一些誘變物質(zhì)（如過氧化氫等）一、自然選育在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的28自然突變兩種情況：生產(chǎn)上所不希望的：菌種的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量下降對(duì)生產(chǎn)有益的：生產(chǎn)性能提高自然突變兩種情況：29制備單孢子（單細(xì)胞）懸液適當(dāng)稀釋在固體平板上分離挑取部分單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力測(cè)定經(jīng)反復(fù)篩選以確定生產(chǎn)能力更高的菌株替代原來的菌株自然選育的一般程序：制備單孢子（單細(xì)胞）懸液自然選育的一般程序：30

自然選育簡(jiǎn)單易行，可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量等目的。自然選育的最大缺點(diǎn)是效率低、進(jìn)展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅度提高。自然選育簡(jiǎn)單易行，可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)31二、誘變育種

誘變育種就是人為地利用物理或化學(xué)等因素，使誘變對(duì)象細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，引起突變，并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

誘變育種不僅可以提高菌種的生產(chǎn)能力，且可改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝。

目前發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的生產(chǎn)菌株大部分是誘變育種得來的。以青霉素為例，1943年開始生產(chǎn)時(shí)的效價(jià)僅為20U/ml，通過多次誘變育種現(xiàn)已達(dá)50000-100000U/ml。雖然遺傳工程等新的育種方法迅速發(fā)展，但誘變育種仍是目前廣泛使用的育種手段。二、誘變育種誘變育種就是人為地利用物理或化學(xué)等因素，32誘變育種的一般步驟原始菌株（出發(fā)菌株）細(xì)胞或孢子懸液制備活細(xì)胞計(jì)數(shù)誘變劑處理活細(xì)胞計(jì)數(shù)中間培養(yǎng)突變株分離初篩復(fù)篩生產(chǎn)性能試驗(yàn)誘變預(yù)備處理誘變育種的工作程序誘變育種的一般步驟原始菌株（出發(fā)菌株）細(xì)胞或孢子懸液制備活細(xì)33一）細(xì)菌雜交育種轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化接合

三、雜交育種一）細(xì)菌雜交育種轉(zhuǎn)導(dǎo)三、雜交育種34二）放線菌雜交育種

放線菌和細(xì)菌一樣屬于原核微生物，但卻像霉菌那樣以菌絲形態(tài)生長(zhǎng)，且形成分生孢子，所以就本質(zhì)來說，放線菌的基因重組過程近似于細(xì)菌，但就育種方法來說，卻有許多與霉菌相似的方面。二）放線菌雜交育種放線菌和細(xì)菌一樣屬于35放線菌雜交技術(shù)混合培養(yǎng)法玻璃紙法平板雜交法放線菌雜交技術(shù)混合培養(yǎng)法36三）酵母菌雜交育種釀酒酵母生活史

三）酵母菌雜交育種釀酒酵母生活史37酵母菌可采用有性雜交育種制備子囊孢子雜交選擇重組子酵母菌可采用有性雜交育種制備子囊孢子38四)霉菌雜交育種有性雜交(如根霉)準(zhǔn)性雜交(如構(gòu)巢曲霉、青霉等)

四)霉菌雜交育種有性雜交(如根霉)39四、原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）育種是雜交育種（基因重組）育種的一種特殊方式四、原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合（protoplastfu40

通過基因重組可以使基因組成發(fā)生較大的改變，隨之使生物的性狀發(fā)生變化。

但對(duì)微生物育種來說，有性重組的局限性很大。因?yàn)槠癜l(fā)現(xiàn)有性雜交現(xiàn)象的微生物為數(shù)不多，在有工業(yè)價(jià)值的微生物中則更少；而且即使發(fā)生雜交，遺傳重組的頻率也不高，這就妨礙了基因重組在微生物育種中作用；另外，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等現(xiàn)象在微生物中亦不普遍。

原生質(zhì)體融合技術(shù)打破了這種不能充分利用遺傳重組的局面通過基因重組可以使基因組成發(fā)生較大的改變，隨之使生物41一）原生質(zhì)體融合的概念——就是把兩個(gè)親本的細(xì)胞分別去掉細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體，將兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，由聚乙二醇（PEG）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞質(zhì)融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實(shí)現(xiàn)遺傳重組。一）原生質(zhì)體融合的概念——就是把兩個(gè)親本的細(xì)胞分別去421、大幅度提高親本之間重組頻率。原生質(zhì)體剝離了細(xì)胞壁，去除了細(xì)胞間物質(zhì)交換的主要障礙，也避免了修復(fù)系統(tǒng)的制約；再加上促融劑的誘導(dǎo)作用，重組頻率顯著提高。2、擴(kuò)大重組的親本范圍。二）原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)點(diǎn)如天藍(lán)色鏈霉菌的種內(nèi)重組頻率可達(dá)20%去除了細(xì)胞壁的障礙，親株基因組直接融合、交換，實(shí)現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳系統(tǒng)。3、原生質(zhì)體融合時(shí)親本整套染色體參與交換，遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和重組性狀較多，集中雙親優(yōu)良性狀機(jī)會(huì)更大。4、可以和其它育種方法相結(jié)合，把由其他方法得到的優(yōu)良形狀通過原生質(zhì)體融合再組合到一個(gè)單株中。1、大幅度提高親本之間重組頻率。原生質(zhì)體剝離了細(xì)胞壁，去除43一、菌種保藏原理主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分在最低水平、缺氧狀態(tài)、干燥和低溫，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。第四節(jié)菌種保藏一、菌種保藏原理主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，人工44二、保藏方法1、斜面冰箱保藏法4C；3-6個(gè)月2、沙土管保藏法產(chǎn)孢子或芽孢微生物，1年3、菌絲速凍法甘油或二甲基亞砜作為保護(hù)劑，-20C

4、石蠟油封存法1年左右5、真空冷凍干燥保藏法任何微生物；一般5年以上6、液氮超低溫保藏法-196C；保護(hù)劑；保存期長(zhǎng)二、保藏方法1、斜面冰箱保藏法4C；3-6個(gè)45第一章微生物工程菌種課件246三、國內(nèi)外重要菌種保藏機(jī)構(gòu)1、ATCC(AmericanTypeCultureCollection)

美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所，馬里蘭州，羅克維爾市2、CSH(ColdSpringHarborLaboratory)

冷泉港研究室，美國3、IAM(InstituteofAppliedMicrobiology,UniversityofTokyo)

日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所，日本東京4、IFO(InstituteforFermentation,Osaka)

發(fā)酵研究所，日本大阪三、國內(nèi)外重要菌種保藏機(jī)構(gòu)1、ATCC(American475、普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）

中科院微生物所，北京6、工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)

輕工部食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所，北京7、中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）武漢大學(xué)，武漢5、普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）48第二節(jié)菌種來源第二節(jié)菌種來源49微生物工程工業(yè)生產(chǎn)水平的三個(gè)決定要素:

生產(chǎn)菌種的性能發(fā)酵和提取工藝條件生產(chǎn)設(shè)備獲得優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是實(shí)現(xiàn)高水平微生物工程工業(yè)生產(chǎn)的第一環(huán)節(jié).微生物工程工業(yè)生產(chǎn)水平生產(chǎn)菌種的性能獲得優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是實(shí)現(xiàn)50一、菌種分離與篩選工作程序

發(fā)酵工業(yè)上使用的微生物菌種，最初都是從自然界中分離篩選出來的。分離與篩選菌種的具體做法一般分4個(gè)步驟：樣品采集增殖培養(yǎng)純種分離生產(chǎn)性能測(cè)定一、菌種分離與篩選工作程序發(fā)酵工業(yè)上使用的微51

調(diào)查研究（包括資料查閱）試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

采樣第一次增殖培養(yǎng)第一次平板分離第二次增殖培養(yǎng)第二次平板分離增殖條件探索根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行定量或半定量測(cè)定第一次原種斜面第二次原種斜面初篩（1株1瓶）定量或半定量測(cè)定篩選工作程序調(diào)查研究（包括資料查閱）試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)采樣第一次增殖培養(yǎng)52第三次平板分離第三次原種斜面復(fù)篩第四次平板分離不純第四次原種斜面再復(fù)篩種子培養(yǎng)初步工藝條件摸索較優(yōu)菌株1株3-5瓶保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)性能試驗(yàn)或作為育種的出發(fā)菌株某些必要試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)第三次菌種保藏第三次平板分離第三次原種斜面復(fù)篩第四次平板分離不純第四次原種53二、分離與篩選的設(shè)計(jì)要求在篩選所需菌株時(shí)應(yīng)考慮以下一些重要指標(biāo)：1、菌的營(yíng)養(yǎng)特征一般要求采用廉價(jià)的培養(yǎng)基或使用來源豐富的原料2、菌的生長(zhǎng)溫度3、菌的穩(wěn)定性4、菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培養(yǎng)液中的濃度5、菌對(duì)所采用的設(shè)備和生產(chǎn)過程的適應(yīng)性6、容易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物3-6是用來衡量菌種的生產(chǎn)性能，如能滿足這幾條，便有希望成為效益高的生產(chǎn)菌株二、分離與篩選的設(shè)計(jì)要求在篩選所需菌株時(shí)應(yīng)考慮以下一些重要指54三、含微生物樣品的采集較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)分離目的靈活掌握土壤（豐富、5-25cm、土質(zhì)、酸堿度、植被狀況、地理?xiàng)l件、季節(jié)）食品、海水、動(dòng)物、植物、極端環(huán)境

根據(jù)微生物的營(yíng)養(yǎng)類型采樣森林土中有相當(dāng)多枯枝落葉和腐爛的木頭，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng)。肉類加工廠附近、飯店排污溝，易分離到蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌。面粉加工廠等場(chǎng)所易分離到產(chǎn)淀粉酶、糖化酶的菌根據(jù)微生物的生理特性采樣篩選高溫酶產(chǎn)生菌通常從溫泉、火山爆發(fā)處、堆肥等采樣；篩選產(chǎn)低溫酶的微生物，可從冰窖、南極、深海等采樣分離耐高滲透壓酵母菌，可到甜果、蜜餞、甘蔗渣堆積處采樣三、含微生物樣品的采集較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)分離目的靈活掌握土壤（豐55第一章微生物工程菌種課件256第一章微生物工程菌種課件257楊尺蠖楊尺蠖58赤松毛蟲赤松毛蟲59側(cè)柏毛蟲側(cè)柏毛蟲60四、含微生物樣品的富集培養(yǎng)富集(enrichment)培養(yǎng)

是在目的微生物含量較少時(shí)，根據(jù)微生物的生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長(zhǎng)條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長(zhǎng)繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢(shì)種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)種，以利分離到所需的菌株。四、含微生物樣品的富集培養(yǎng)富集(enrichment)培養(yǎng)61其要領(lǐng)是提供一些有利于所需菌株生長(zhǎng)或不利于其他菌型生長(zhǎng)的條件。包括：控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分；控制培養(yǎng)條件；抑制不需要的菌類等?？刂蒲蹩蓪⒑醚跷⑸锖蛥捬跷⑸锓珠_；高溫下培養(yǎng)可將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開；控制pH可分離嗜酸或嗜堿微生物；高糖或高鹽培養(yǎng)基可分離耐高滲透壓微生物；根據(jù)微生物對(duì)環(huán)境因子的耐受范圍具有可塑性的特點(diǎn)，可通過連續(xù)富集培養(yǎng)的方法分離降解高濃度污染物的環(huán)保菌。如降解苯胺的微生物分離。可以苯胺為唯一碳源對(duì)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，待底物完全降解后，再以一定接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含苯胺的富集培養(yǎng)液中，如此連續(xù)移接培養(yǎng)次數(shù)。同時(shí)將苯胺濃度逐步提高，并可得到降解苯胺占優(yōu)勢(shì)的菌株培養(yǎng)液，采用稀釋涂布法或平板劃線法進(jìn)一步分離，即可得到能降解高濃度苯胺的微生物。其要領(lǐng)是提供一些有利于所需菌株生長(zhǎng)或不利于其他菌型生長(zhǎng)的條件62需注意，所需菌型生長(zhǎng)的結(jié)果有時(shí)會(huì)改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，從而改變選擇壓力。重復(fù)移植幾次后接種少量已富集的培養(yǎng)物到固體培養(yǎng)基上。移植時(shí)間是關(guān)鍵，應(yīng)在所需菌種確已占優(yōu)勢(shì)的情況下進(jìn)行。需注意，所需菌型生長(zhǎng)的結(jié)果有時(shí)會(huì)改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，從而63五、利用固體平板的生化反應(yīng)進(jìn)行分離利用特殊的分離培養(yǎng)對(duì)大量混雜微生物進(jìn)行初步分離的方法。分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計(jì)的。可顯著提高分離效率透明圈法變色圈法生長(zhǎng)圈法抑菌圈法五、利用固體平板的生化反應(yīng)進(jìn)行分離利用特殊的分離培養(yǎng)對(duì)大64透明圈法

分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；

在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁；

能分解底物的微生物便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)菌株利用底物的能力。透明圈法分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、65土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后鋪在pH8-9的瓊脂培養(yǎng)基（含有均勻的不溶性蛋白質(zhì)）表面；堿性蛋白酶產(chǎn)生菌能消化平板上的不溶性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生一透明圈。例如用此法分離產(chǎn)生堿性蛋白酶的芽孢桿菌土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后鋪在pH8-9的66

分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時(shí)，也通常采用透明圈法初篩在選擇培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板呈混濁狀，產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈聚賴氨酸產(chǎn)生菌（利用產(chǎn)正電分泌物的菌株和美藍(lán)之間的靜電作用而形成獨(dú)特的透明圈,從而靈敏地篩選得到產(chǎn)聚賴氨酸產(chǎn)生菌的菌株)分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時(shí)，也通常采用透明圈法初篩67將待測(cè)菌株接種于蛋黃培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，在菌落周圍產(chǎn)生暈圈（溶脂圈和透明圈）的菌株作為定性篩選解有機(jī)磷細(xì)菌的判斷依據(jù)，以暈圈直徑與菌落直徑比例的大小作為解磷能力大小初篩的判定指標(biāo)

溶脂圈透明圈如何篩選磷細(xì)菌？將待測(cè)菌株接種于蛋黃培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，在菌落周圍產(chǎn)生暈圈（溶68

透明圈的大小不能完全作為選擇高產(chǎn)菌的依據(jù)，因?yàn)樵谏顚优囵B(yǎng)中的產(chǎn)酶單位與平板上圈的大小之間并不完全成正比。

但作為初篩的手段是有意義的透明圈的大小不能完全作為選擇高產(chǎn)菌的依據(jù)，因?yàn)樵谏顚优?92、抑菌圈法

常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選據(jù)估計(jì)，篩選1萬個(gè)菌株才能得到1株有用的抗生素產(chǎn)生菌；因此，設(shè)計(jì)一個(gè)準(zhǔn)確、快速的篩選模型十分重要。抑菌圈法是常用的初篩方法

工具菌采用抗生素的敏感菌若被檢菌能分泌某些抑制菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，如抗生素等，便會(huì)在該菌落周圍形成工具菌不能生長(zhǎng)的抑菌圈2、抑菌圈法常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選據(jù)估計(jì)，篩選170第一章微生物工程菌種課件2713、生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的分離

通過觀察分離菌能否促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的生長(zhǎng)，來檢測(cè)生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌。分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)被殺死的菌落周圍有無檢測(cè)菌的生長(zhǎng)圈影印到能支持生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上Uv照射殺死菌落鋪上一層含相應(yīng)生長(zhǎng)因子缺陷型菌株3、生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的分離通過觀察分離菌能否促進(jìn)營(yíng)72第三節(jié)菌種選育第三節(jié)菌種選育73菌種選育

應(yīng)用微生物遺傳和變異理論，用人工方法(或自然)造成變異，再經(jīng)過篩選以得到人們所需菌種的過程。

菌種選育的目的是為了不斷提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，增加新產(chǎn)品和適應(yīng)工藝改革的要求。菌種選育的方向是選育“吃粗糧”、耐高溫、生長(zhǎng)快、代謝旺、產(chǎn)量高、質(zhì)量好、無毒性的優(yōu)良菌株。菌種選育菌種選育的目的是為了不斷提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量和74自然選育誘變育種雜交育種(有性、準(zhǔn)性)原生質(zhì)體融合育種基因工程育種自然選育75一、自然選育

在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程叫自然選育。

自發(fā)突變(spontaneousmutation)，也稱自然突變，指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變，但這決不意味著這種突變是沒有原因的。

一般認(rèn)為引起自然突變有兩個(gè)原因：即多因素低劑量的誘變效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。

多因素低劑量的誘變效應(yīng)是指自然突變實(shí)際上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長(zhǎng)期綜合效應(yīng)，例如充滿宇宙空間的各種短波輻射、自然界中普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)以及微生物自身代謝活動(dòng)中所產(chǎn)生的一些誘變物質(zhì)（如過氧化氫等）一、自然選育在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的76自然突變兩種情況：生產(chǎn)上所不希望的：菌種的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量下降對(duì)生產(chǎn)有益的：生產(chǎn)性能提高自然突變兩種情況：77制備單孢子（單細(xì)胞）懸液適當(dāng)稀釋在固體平板上分離挑取部分單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力測(cè)定經(jīng)反復(fù)篩選以確定生產(chǎn)能力更高的菌株替代原來的菌株自然選育的一般程序：制備單孢子（單細(xì)胞）懸液自然選育的一般程序：78

自然選育簡(jiǎn)單易行，可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量等目的。自然選育的最大缺點(diǎn)是效率低、進(jìn)展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅度提高。自然選育簡(jiǎn)單易行，可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)79二、誘變育種

誘變育種就是人為地利用物理或化學(xué)等因素，使誘變對(duì)象細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，引起突變，并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

誘變育種不僅可以提高菌種的生產(chǎn)能力，且可改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝。

目前發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的生產(chǎn)菌株大部分是誘變育種得來的。以青霉素為例，1943年開始生產(chǎn)時(shí)的效價(jià)僅為20U/ml，通過多次誘變育種現(xiàn)已達(dá)50000-100000U/ml。雖然遺傳工程等新的育種方法迅速發(fā)展，但誘變育種仍是目前廣泛使用的育種手段。二、誘變育種誘變育種就是人為地利用物理或化學(xué)等因素，80誘變育種的一般步驟原始菌株（出發(fā)菌株）細(xì)胞或孢子懸液制備活細(xì)胞計(jì)數(shù)誘變劑處理活細(xì)胞計(jì)數(shù)中間培養(yǎng)突變株分離初篩復(fù)篩生產(chǎn)性能試驗(yàn)誘變預(yù)備處理誘變育種的工作程序誘變育種的一般步驟原始菌株（出發(fā)菌株）細(xì)胞或孢子懸液制備活細(xì)81一）細(xì)菌雜交育種轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化接合

三、雜交育種一）細(xì)菌雜交育種轉(zhuǎn)導(dǎo)三、雜交育種82二）放線菌雜交育種

放線菌和細(xì)菌一樣屬于原核微生物，但卻像霉菌那樣以菌絲形態(tài)生長(zhǎng)，且形成分生孢子，所以就本質(zhì)來說，放線菌的基因重組過程近似于細(xì)菌，但就育種方法來說，卻有許多與霉菌相似的方面。二）放線菌雜交育種放線菌和細(xì)菌一樣屬于83放線菌雜交技術(shù)混合培養(yǎng)法玻璃紙法平板雜交法放線菌雜交技術(shù)混合培養(yǎng)法84三）酵母菌雜交育種釀酒酵母生活史

三）酵母菌雜交育種釀酒酵母生活史85酵母菌可采用有性雜交育種制備子囊孢子雜交選擇重組子酵母菌可采用有性雜交育種制備子囊孢子86四)霉菌雜交育種有性雜交(如根霉)準(zhǔn)性雜交(如構(gòu)巢曲霉、青霉等)

四)霉菌雜交育種有性雜交(如根霉)87四、原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）育種是雜交育種（基因重組）育種的一種特殊方式四、原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合（protoplastfu88

通過基因重組可以使基因組成發(fā)生較大的改變，隨之使生物的性狀發(fā)生變化。

但對(duì)微生物育種來說，有性重組的局限性很大。因?yàn)槠癜l(fā)現(xiàn)有性雜交現(xiàn)象的微生物為數(shù)不多，在有工業(yè)價(jià)值的微生物中則更少；而且即使發(fā)生雜交，遺傳重組的頻率也不高，這就妨礙了基因重組在微生物育種中作用；另外，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等現(xiàn)象在微生物中亦不普遍。

原生質(zhì)體融合技術(shù)打破了這種不能充分利用遺傳重組的局面通過基因重組可以使基因組成發(fā)生較大的改變，隨之使生物89一）原生質(zhì)體融合的概念