植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件

第四章植物基因工程天津大學(xué)楊少輝第四章植物基因工程天津大學(xué)楊少輝1植物基因工程是近20年來(lái)隨著DNA重組技術(shù)、植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代生物技術(shù)。通過(guò)植物基因工程獲得轉(zhuǎn)基因植物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展及植物分子生物學(xué)研究中有十分重要的意義。目前，已獲得很多有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物。植物基因工程是近20年來(lái)隨著DNA重組技術(shù)、植物遺傳2基因工程的基本步驟目的基因的獲取基因載體的選擇與構(gòu)建目的基因與載體的拼接重組子導(dǎo)入受體分子外源基因的表達(dá)和產(chǎn)物的分離重組子的檢測(cè)基因工程的基本步驟目的基因的獲取基因載體的選擇與構(gòu)建目的基因3植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件4本節(jié)主要內(nèi)容根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因槍介導(dǎo)法其它轉(zhuǎn)化方法第一節(jié)植物遺傳轉(zhuǎn)化方法本節(jié)主要內(nèi)容根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因槍介導(dǎo)法其它轉(zhuǎn)化方法第一節(jié)5常用的植物轉(zhuǎn)基因方法：到目前為止,已確立了11種植物轉(zhuǎn)基因方法。根據(jù)其轉(zhuǎn)化原理，可分為三大類，即利用載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，不用任何載體，采用物理、化學(xué)方法直接將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以及利用植物生殖細(xì)胞等種質(zhì)媒介的種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。現(xiàn)將這三大類系統(tǒng)的載體、轉(zhuǎn)化原理、轉(zhuǎn)化方法和受體細(xì)胞等歸納如圖4-1。常用的植物轉(zhuǎn)基因方法：到目前為止,已確立了11種植物轉(zhuǎn)基因6植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件7一、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的分子機(jī)制農(nóng)桿菌介導(dǎo)法需要具備的條件農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本流程一、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的分子機(jī)制81、植物冠癭瘤——植物的一種癌癥（1）冠癭瘤的起因：由根癌農(nóng)桿菌對(duì)植物的侵染而引起。（2）冠癭瘤的侵染過(guò)程：細(xì)菌通過(guò)傷口進(jìn)入植物，在基因水平上轉(zhuǎn)化植物。細(xì)菌DNA中的編碼基因在植物細(xì)胞中表達(dá)，刺激植物細(xì)胞不受控制的分裂，形成瘤。（一）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的分子機(jī)制1、植物冠癭瘤——植物的一種癌癥（一）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的分子92、Ti質(zhì)粒根瘤農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA分子。2、Ti質(zhì)粒10為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力；參與寄主細(xì)胞合成激素的能力；誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤；賦予寄主分解冠癭堿的能力；決定寄主范圍。（1）Ti質(zhì)粒的功能為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力；（1）Ti質(zhì)粒的功能11（2）Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域T-DNA區(qū)Vir區(qū)Con區(qū)Ori區(qū)200kb（2）Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域T-DNA區(qū)200kb12①T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：

核心區(qū)左邊界右邊界T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，故稱之為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。①T-DNA區(qū)（transferred-DNAregio13Vir區(qū)是一段長(zhǎng)度為35KB操縱子；包含六個(gè)基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG。該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，合起來(lái)約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。②Vir區(qū)操縱子基因的結(jié)構(gòu)與功能LBRBT-DNAVirVir區(qū)是一段長(zhǎng)度為35KB操縱子；②Vir區(qū)操縱子基因的14③Con區(qū)（regionsencodingconjugations）該區(qū)段上存在著與細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。④Ori區(qū)（originofreplication）該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。③Con區(qū)（regionsencodingconjug15定向轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞內(nèi)T-DNA鏈整合植物基因組受傷植物產(chǎn)生酚類物質(zhì)，誘導(dǎo)Vir基因的表達(dá)編碼核酸內(nèi)切酶依次在RB、LB序列中產(chǎn)生缺口單鏈T-DNA被釋放3、T-DNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制植物細(xì)胞酶體系合成雙鏈T-DNA鏈分子VirE2蛋白的核定位作用定向轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞內(nèi)T-DNA鏈整合植物基因組受傷植物產(chǎn)164、植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)一元載體（順勢(shì)載體）雙元載體（反式載體）4、植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)一元載體（順勢(shì)載體）雙元載體（反式17①Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大，一般在160～240kb；②分布各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)；③T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生；④Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制,即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增；⑤Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。野生型Ti質(zhì)粒不能直接作為植物基因工程載體：①Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大，一般在160～240kb；野生型Ti185、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建PG2TNOSAmprPG1T目的基因報(bào)告基因，選擇標(biāo)記基因目的基因報(bào)告基因，選擇標(biāo)記基因LBRB5、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建P19啟動(dòng)子的選擇35S,cauliflowermosaicvirus35Spromoter

CaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.

啟動(dòng)子的選擇35S,cauliflowermosaic20（二）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法需要具備的條件高效的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)受體植物細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌要有很高的親和力。具有有效的選擇系統(tǒng)。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因表達(dá)。（二）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法需要具備的條件高效的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)211、高效的植物基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。受體系統(tǒng)：用于轉(zhuǎn)化的外植體通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其它非組織培養(yǎng)途徑（如發(fā)苗產(chǎn)生子葉、胚軸等），能高效、穩(wěn)定地再生無(wú)性系，并能接受外源DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。1、高效的植物基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好22A.植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件（1）高效穩(wěn)定的再生能力（2）較高的遺傳穩(wěn)定性（3）具有穩(wěn)定的外植體來(lái)源（4）對(duì)選擇性抗生素敏感（5）對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性（6）具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值或理論研究意義。A.植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件（1）高效穩(wěn)定的再生能力23B.植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類型1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過(guò)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（含目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點(diǎn)：外植體來(lái)源廣，繁殖快，易接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率高。缺點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)B.植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類型1.愈傷組織再生系統(tǒng)242.直接分化再生系統(tǒng)

外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點(diǎn)：周期短、操作簡(jiǎn)單，體細(xì)胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點(diǎn)：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。2.直接分化再生系統(tǒng)253.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點(diǎn)：高效、廣泛地?cái)z取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得基因型一致的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點(diǎn)：不易制備、再生困難和變異程度高。3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)264.胚狀體再生系統(tǒng)是指具有胚胎性質(zhì)的個(gè)體。優(yōu)點(diǎn)：個(gè)體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強(qiáng)，嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點(diǎn)：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。4.胚狀體再生系統(tǒng)275.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等受體細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)282、選擇系統(tǒng)選擇是為了將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在構(gòu)建載體時(shí)，往往在目的基因上連上一個(gè)選擇標(biāo)記基因。主要是編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因。最常用的有：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTⅡ)、新霉素抗性基因（neo）、慶大霉素抗性基因（gent）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）,以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）等。2、選擇系統(tǒng)選擇是為了將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開，使轉(zhuǎn)化細(xì)29新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離的，其對(duì)應(yīng)失活的選擇試劑為卡那霉素、新霉素和G418。對(duì)茄科植物（煙草、馬鈴薯、番茄）轉(zhuǎn)化特別有效，對(duì)豆科和單子葉植物效果不佳。A、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Npt-II）新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離的，其對(duì)應(yīng)失活的30B、慶大霉素抗性基因（gent）該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬抗生素標(biāo)記基因，它通過(guò)對(duì)慶大霉素的乙?；蛊涫Щ睢Ｔ撨x擇系統(tǒng)目前也有一定的應(yīng)用，例如矮牛、煙草和番茄。B、慶大霉素抗性基因（gent）該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬31潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞抑制劑，對(duì)許多植物都有很強(qiáng)的毒性。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可通過(guò)對(duì)潮霉素磷酸化而使其失活。C、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞抑制劑，對(duì)許多植物都有很強(qiáng)的毒性。32D、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）該基因是從吸水鏈霉菌中克隆的一種基因，其對(duì)應(yīng)的選擇試劑為膦絲菌素（basta），膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，從而導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生氨的致死性累積。D、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）該基因是從吸水鏈霉菌中克33（三）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本流程（三）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本流程34大豆子葉節(jié)法為例：大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化大豆農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化大豆子葉節(jié)法為例：35大豆無(wú)菌苗的獲得外植體的制備（類型、生理狀態(tài)）高分化率基因型的選擇叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的確定叢生芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的確定生根培養(yǎng)基的確定移栽大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化大豆無(wú)菌苗的獲得大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化36植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件37選擇壓的確定農(nóng)桿菌侵染液的制備外植體苗齡預(yù)培養(yǎng)（時(shí)間）農(nóng)桿菌的侵染（濃度、時(shí)間）共培養(yǎng)（時(shí)間）選擇培養(yǎng)抗性芽的伸長(zhǎng)生根培養(yǎng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化選擇壓的確定農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化38F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈傷5.胚萌發(fā)成苗6.轉(zhuǎn)基因植株移栽大田4.抗性愈傷分化成胚狀體棉花F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈39(a)Embryogeniccalligeneratedfromthescutellaofmatureseeds.ArrowheadsshowactivelygrowingcalliappropriateforAgrobacteriuminoculation.(b)InoculationofcalliwithA.tumefaciens.(c)Proliferationofhygromycin-resistantcallionN6D-Smedium3weeksaftertransfer.Leftcalliareresistanttohygromycinandrightcalliaresensitive.(d)ShootregenerationfromcalliresistanttohygromycinonMS-NKmedium3weeksaftertransfer.(e)Rootingandgrowthoftransgenicriceplants.(a)Embryogeniccalligenerate40二、基因槍法（微彈轟擊法）1、工作原理：將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細(xì)胞或組織，微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上并得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。二、基因槍法（微彈轟擊法）1、工作原理：將外源DNA包被在微41步驟簡(jiǎn)單易行：適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。步驟簡(jiǎn)單易行：適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，克服了受體材料的限制，422、操作步驟：（1）制備DNA微彈；（2）準(zhǔn)備靶外植體材料；（3）DNA微彈轟擊；（4）培養(yǎng)轟擊后的外植體．immatureembryoshighosmoticmediapreparecalli2、操作步驟：（1）制備DNA微彈；immature43植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件44植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件453、轉(zhuǎn)化率影響因素：金屬微粒：金粉顆粒較鎢粒性質(zhì)優(yōu)良,但是價(jià)格昂貴.DNA沉淀輔助劑：這些化合物對(duì)DNA在微粒上的黏附有重要作用,但對(duì)植物受體細(xì)胞也產(chǎn)生一定的傷害.DNA純度及濃度微彈速度植物材料內(nèi)在因素3、轉(zhuǎn)化率影響因素：金屬微粒：金粉顆粒較鎢粒性質(zhì)優(yōu)良,但是價(jià)46基因槍法的優(yōu)點(diǎn)：無(wú)宿主限制；靶受體類型廣泛；可控度高；操作簡(jiǎn)便。問(wèn)題：轉(zhuǎn)化效率低；嵌合體多；穩(wěn)定性差，瞬時(shí)表達(dá)；外源基因沉默；整合機(jī)理不詳。4、基因槍轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)：基因槍法的優(yōu)點(diǎn)：?jiǎn)栴}：4、基因槍轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)：47花粉管通道法在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過(guò)程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個(gè)體。該方法于80年代初期由我國(guó)學(xué)者周光宇提出，我國(guó)目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來(lái)的。該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握?；ǚ酃芡ǖ婪ㄔ谑诜酆笙蜃臃孔⑸浜夏康幕虻腄NA溶液，利用48植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件49花粉粒的內(nèi)壁通過(guò)花粉外壁上的萌發(fā)孔（或溝）向外伸出的細(xì)管。一般每個(gè)花粉粒萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生一個(gè)花粉管，具多萌發(fā)孔的花粉粒開始可以同時(shí)長(zhǎng)出數(shù)個(gè)花粉管，但最終只有一個(gè)繼續(xù)生長(zhǎng)。花粉管是靠其末端生長(zhǎng)的，在高倍顯微鏡下可見(jiàn)花粉管末端有一個(gè)透明的半球形區(qū)域稱帽區(qū)。帽區(qū)之后的細(xì)胞質(zhì)中含有多種細(xì)胞器，這與花粉管的生長(zhǎng)有關(guān)。花粉管長(zhǎng)到一定長(zhǎng)度后，原來(lái)花粉粒中的內(nèi)含物全部集中到花粉管的前端，花粉管從柱頭經(jīng)花柱到子房，再進(jìn)入胚珠及胚囊，將花粉管中的兩個(gè)精子及全部?jī)?nèi)含物釋放到胚囊中，以便受精作用的進(jìn)行?；ǚ酃苁切叟渥芋w的一部分?；ǚ哿５膬?nèi)壁通過(guò)花粉外壁上的萌發(fā)孔（或溝）向外伸出的細(xì)管。一50植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件51將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞－花粉管通道法轉(zhuǎn)基因抗蟲棉將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞－花粉管通道法轉(zhuǎn)基因抗蟲棉52三、PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：利用化學(xué)試劑，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(細(xì)胞促融劑)等，誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子，進(jìn)入原生質(zhì)體的外源DNA分子就有可能通過(guò)某種機(jī)制整合到基因組中，完成遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程。

案例：轉(zhuǎn)基因煙草三、PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：利用化學(xué)試劑，如聚乙二醇53步驟：共保溫；稀釋PEG；非選擇培養(yǎng)；選擇培養(yǎng)。步驟：54

優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)化順利，對(duì)細(xì)胞傷害?。槐苊馇逗象w的生成；易于選擇；便于進(jìn)行理論研究；受體廣泛。優(yōu)點(diǎn)：55植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件56第四章植物基因工程天津大學(xué)楊少輝第四章植物基因工程天津大學(xué)楊少輝57植物基因工程是近20年來(lái)隨著DNA重組技術(shù)、植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代生物技術(shù)。通過(guò)植物基因工程獲得轉(zhuǎn)基因植物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展及植物分子生物學(xué)研究中有十分重要的意義。目前，已獲得很多有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物。植物基因工程是近20年來(lái)隨著DNA重組技術(shù)、植物遺傳58基因工程的基本步驟目的基因的獲取基因載體的選擇與構(gòu)建目的基因與載體的拼接重組子導(dǎo)入受體分子外源基因的表達(dá)和產(chǎn)物的分離重組子的檢測(cè)基因工程的基本步驟目的基因的獲取基因載體的選擇與構(gòu)建目的基因59植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件60本節(jié)主要內(nèi)容根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因槍介導(dǎo)法其它轉(zhuǎn)化方法第一節(jié)植物遺傳轉(zhuǎn)化方法本節(jié)主要內(nèi)容根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因槍介導(dǎo)法其它轉(zhuǎn)化方法第一節(jié)61常用的植物轉(zhuǎn)基因方法：到目前為止,已確立了11種植物轉(zhuǎn)基因方法。根據(jù)其轉(zhuǎn)化原理，可分為三大類，即利用載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，不用任何載體，采用物理、化學(xué)方法直接將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以及利用植物生殖細(xì)胞等種質(zhì)媒介的種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。現(xiàn)將這三大類系統(tǒng)的載體、轉(zhuǎn)化原理、轉(zhuǎn)化方法和受體細(xì)胞等歸納如圖4-1。常用的植物轉(zhuǎn)基因方法：到目前為止,已確立了11種植物轉(zhuǎn)基因62植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件63一、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的分子機(jī)制農(nóng)桿菌介導(dǎo)法需要具備的條件農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本流程一、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的分子機(jī)制641、植物冠癭瘤——植物的一種癌癥（1）冠癭瘤的起因：由根癌農(nóng)桿菌對(duì)植物的侵染而引起。（2）冠癭瘤的侵染過(guò)程：細(xì)菌通過(guò)傷口進(jìn)入植物，在基因水平上轉(zhuǎn)化植物。細(xì)菌DNA中的編碼基因在植物細(xì)胞中表達(dá)，刺激植物細(xì)胞不受控制的分裂，形成瘤。（一）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的分子機(jī)制1、植物冠癭瘤——植物的一種癌癥（一）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的分子652、Ti質(zhì)粒根瘤農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA分子。2、Ti質(zhì)粒66為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力；參與寄主細(xì)胞合成激素的能力；誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤；賦予寄主分解冠癭堿的能力；決定寄主范圍。（1）Ti質(zhì)粒的功能為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力；（1）Ti質(zhì)粒的功能67（2）Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域T-DNA區(qū)Vir區(qū)Con區(qū)Ori區(qū)200kb（2）Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域T-DNA區(qū)200kb68①T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：

核心區(qū)左邊界右邊界T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，故稱之為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。①T-DNA區(qū)（transferred-DNAregio69Vir區(qū)是一段長(zhǎng)度為35KB操縱子；包含六個(gè)基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG。該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，合起來(lái)約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。②Vir區(qū)操縱子基因的結(jié)構(gòu)與功能LBRBT-DNAVirVir區(qū)是一段長(zhǎng)度為35KB操縱子；②Vir區(qū)操縱子基因的70③Con區(qū)（regionsencodingconjugations）該區(qū)段上存在著與細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。④Ori區(qū)（originofreplication）該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。③Con區(qū)（regionsencodingconjug71定向轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞內(nèi)T-DNA鏈整合植物基因組受傷植物產(chǎn)生酚類物質(zhì)，誘導(dǎo)Vir基因的表達(dá)編碼核酸內(nèi)切酶依次在RB、LB序列中產(chǎn)生缺口單鏈T-DNA被釋放3、T-DNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制植物細(xì)胞酶體系合成雙鏈T-DNA鏈分子VirE2蛋白的核定位作用定向轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞內(nèi)T-DNA鏈整合植物基因組受傷植物產(chǎn)724、植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)一元載體（順勢(shì)載體）雙元載體（反式載體）4、植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)一元載體（順勢(shì)載體）雙元載體（反式73①Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大，一般在160～240kb；②分布各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)；③T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生；④Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制,即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增；⑤Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。野生型Ti質(zhì)粒不能直接作為植物基因工程載體：①Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大，一般在160～240kb；野生型Ti745、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建PG2TNOSAmprPG1T目的基因報(bào)告基因，選擇標(biāo)記基因目的基因報(bào)告基因，選擇標(biāo)記基因LBRB5、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建P75啟動(dòng)子的選擇35S,cauliflowermosaicvirus35Spromoter

CaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.

啟動(dòng)子的選擇35S,cauliflowermosaic76（二）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法需要具備的條件高效的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)受體植物細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌要有很高的親和力。具有有效的選擇系統(tǒng)。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因表達(dá)。（二）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法需要具備的條件高效的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)771、高效的植物基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。受體系統(tǒng)：用于轉(zhuǎn)化的外植體通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其它非組織培養(yǎng)途徑（如發(fā)苗產(chǎn)生子葉、胚軸等），能高效、穩(wěn)定地再生無(wú)性系，并能接受外源DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。1、高效的植物基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好78A.植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件（1）高效穩(wěn)定的再生能力（2）較高的遺傳穩(wěn)定性（3）具有穩(wěn)定的外植體來(lái)源（4）對(duì)選擇性抗生素敏感（5）對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性（6）具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值或理論研究意義。A.植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件（1）高效穩(wěn)定的再生能力79B.植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類型1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過(guò)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（含目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點(diǎn)：外植體來(lái)源廣，繁殖快，易接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率高。缺點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)B.植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類型1.愈傷組織再生系統(tǒng)802.直接分化再生系統(tǒng)

外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點(diǎn)：周期短、操作簡(jiǎn)單，體細(xì)胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點(diǎn)：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。2.直接分化再生系統(tǒng)813.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點(diǎn)：高效、廣泛地?cái)z取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得基因型一致的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點(diǎn)：不易制備、再生困難和變異程度高。3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)824.胚狀體再生系統(tǒng)是指具有胚胎性質(zhì)的個(gè)體。優(yōu)點(diǎn)：個(gè)體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強(qiáng)，嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點(diǎn)：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。4.胚狀體再生系統(tǒng)835.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等受體細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)842、選擇系統(tǒng)選擇是為了將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在構(gòu)建載體時(shí)，往往在目的基因上連上一個(gè)選擇標(biāo)記基因。主要是編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因。最常用的有：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTⅡ)、新霉素抗性基因（neo）、慶大霉素抗性基因（gent）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）,以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）等。2、選擇系統(tǒng)選擇是為了將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開，使轉(zhuǎn)化細(xì)85新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離的，其對(duì)應(yīng)失活的選擇試劑為卡那霉素、新霉素和G418。對(duì)茄科植物（煙草、馬鈴薯、番茄）轉(zhuǎn)化特別有效，對(duì)豆科和單子葉植物效果不佳。A、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Npt-II）新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離的，其對(duì)應(yīng)失活的86B、慶大霉素抗性基因（gent）該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬抗生素標(biāo)記基因，它通過(guò)對(duì)慶大霉素的乙酰化而使其失活。該選擇系統(tǒng)目前也有一定的應(yīng)用，例如矮牛、煙草和番茄。B、慶大霉素抗性基因（gent）該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬87潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞抑制劑，對(duì)許多植物都有很強(qiáng)的毒性。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可通過(guò)對(duì)潮霉素磷酸化而使其失活。C、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞抑制劑，對(duì)許多植物都有很強(qiáng)的毒性。88D、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）該基因是從吸水鏈霉菌中克隆的一種基因，其對(duì)應(yīng)的選擇試劑為膦絲菌素（basta），膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，從而導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生氨的致死性累積。D、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）該基因是從吸水鏈霉菌中克89（三）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本流程（三）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本流程90大豆子葉節(jié)法為例：大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化大豆農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化大豆子葉節(jié)法為例：91大豆無(wú)菌苗的獲得外植體的制備（類型、生理狀態(tài)）高分化率基因型的選擇叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的確定叢生芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的確定生根培養(yǎng)基的確定移栽大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化大豆無(wú)菌苗的獲得大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化92植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)課件93選擇壓的確定農(nóng)桿菌侵染液的制備外植體苗齡預(yù)培養(yǎng)（時(shí)間）農(nóng)桿菌的侵染（濃度、時(shí)間）共培養(yǎng)（時(shí)間）選擇培養(yǎng)抗性芽的伸長(zhǎng)生根培養(yǎng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化選擇壓的確定農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化94F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈傷5.胚萌發(fā)成苗6.轉(zhuǎn)基因植株移栽大田4.抗性愈傷分化成胚狀體棉花F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈95(a)Embryogeniccalligeneratedfromthescutellaofmatureseeds.ArrowheadsshowactivelygrowingcalliappropriateforAgrobacteriuminoculation.(b)InoculationofcalliwithA.tumefaciens.(c)Proliferationofhygromycin-resistantcallionN6D-Smedium3weeksaftertransfer.Leftcalliareresistanttohygromycinandrightcalliaresensitive.(d)ShootregenerationfromcalliresistanttohygromycinonMS-NKmedium3weeksaftertransfer.(e)Rootingandgrowthoftransgenicriceplants.(a)Embryogeniccalligenerate96二、基因槍法（微彈轟擊法）1、工作原理：將外源DNA包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細(xì)胞或組織，微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上并得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。二、基因槍法（微彈轟擊法）1、工作原理：將外源DNA包被在微97步驟簡(jiǎn)單易行：適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。步驟簡(jiǎn)單易行：適合于大