基因選殖的策略

基因選殖的策略原核生物-細(xì)菌萃取chromosomeDNAPartialdigestionDNA(選一種限制酶)Vector(去磷酸根)(降低self-ligation)Ligation,trnasformation藍(lán)白篩選活性篩選真核生物?M-Marker:DNA/HindIII1-StreptomycesPMS502chromosome2-1/BamHI(mgDNA/0.18unit)3-1/BamHI(mgDNA/0.06unit)4-1/BamHI(mgDNA/0.02unit)5-1/BamHI(mgDNA/0.007unit)23.19.46.64.42.32.0M12345ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCLigationTransformationPickingwhitecolonies選殖基因的定序Clone確認(rèn)定序primer的選擇Vector上的forwardreverse序列Ex:pUC18第二次定序自行設(shè)計(jì)primer序列的組合(正股反股)DeterminingDNAsequences1975FrederickSanger–dideoxynucleosidetriphosphates(ddNTPs)定序完成後的工作上網(wǎng)比對(duì)序列blast確認(rèn)所clone的基因預(yù)測(cè)ORF(openreadingframe)DNA-STARVECTORNTI9.0ORF的確認(rèn)Ribosomebindingsite(RBS-6~-12GArich)蛋白的分子量與基因長(zhǎng)度相關(guān)性TATAbox(-35-10)設(shè)計(jì)primerssubclone,expressionExpressionvector的選擇(pET,pQE,pGEX4T…)基因產(chǎn)物的純化設(shè)計(jì)PrimersPCR基因產(chǎn)物前的分析工作解讀限制酶圖譜Primer序列加上限制酶切位選擇哪種限制酶切位Multi-cloningsite有的切位轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯起始位置的考量(與載體有關(guān))primer設(shè)計(jì)時(shí)要注意序列inframe

實(shí)做練習(xí)ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGAGCCGGGGAGCACATTGGCGGCACCGTGAGAGCGCTCTCAAAGGTCCCGCGTCCCCC660GCTCCCCGCTCCCGAGAGGCCACCCATGAGTGATTCCTCCGGCACCCCCAGACCCCGTTC720MSDSSGTPRPRSCCACTCCCGCCCCCGCTCCCGCTCCGTGCGCCGCGCCCTCATGGCGGCCGTCGCGACGTT780HSRPRSRSVRRALMAAVATFCGGCCTCGCCGCGGCCGTCGCCACCGCGGCCACCGGCCCCGCGGACGCCTCCGCCCCGGC840GLAAAVATAATGPADASAPAGCCGCCCTCCGGCTGGTCGCAGGTGTTCCTCGACGACTTCGACGGCGCGGCCGGAAGCAG900PPSGWSQVFLDDFDGAAGSSCGTCAACACCGCCAACTGGCAGTTCGACACCGGCACTTCGTACCCCGGCGGGGCAGGCAA960VNTANWQFDTGTSYPGGAGNCTGGGGCACTGGCGAGGTCGAGTCGATGACGTCGAGCACCAGCAATGTCTCCCTCGACGG1020WGTGEVESMTSSTSNVSLDGCAACGGCGATCTGCTCATCACCCCGCGCCGCGACGCGTCCGGCAACTGGACCTCCGGCCG1080NGDLLITPRRDASGNWTSGRGATCGAGACCACCCGCACCGACTTCCAGCCCCCGGCCGGCGGCAAGCTGCGCGTCGAGGC1140IETTRTDFQPPAGGKLRVEAGCGCCTGCAGATGCCGAACGTGACCGGGGACGCGGCCGCCGGGTACTGGCCCGCGTTCTG1200RLQMPNVTGDAAAGYWPAFWGATGCTGGGCGCGCCCTTCCGCGGCAACTACCAGAACTGGCCCGGCGTCGGCGAGCTGGA1260MLGAPFRGNYQNWPGVGELDCATCATGGAGAACGTCCAGGGCCTGAACAAGACCTGGGCCACCATGCACTGCGGGACCAG1320IMENVQGLNKTWATMHCGTSCCCCGGCGGGCCCTGCAACGAGACCAGCGGCATCGGCAATTTGACCGCCTGCCCGAACAC1380PGGPCNETSGIGNLTACPNTCACCTGCCATTCGGGCTTGCACACCTACACCATGGAGTGGGACCGCTCGGTCAGCCCCGA1440TCHSGLHTYTMEWDRSVSPEGGCGATCCGCTTCTCCGTCGACGGCGTCACCTACCAGACGGTCACGGCGAATCATATGGA1500AIRFSVDGVTYQTVTANHMDCGCGGTCACCTGGACCAACGCCACGAACCACGGTTTCTTCGTTATCCTGAACGTGGCGAT1560AVTWTNATNHGFFVILNVAMGGGCGGCGGCTTCCCGGGTGCCTTCGGCGGCGGCCCGACCGGCGCCACCGAGCCCGGCCA1620GGGFPGAFGGGPTGATEPGHCCCCATGGTCGTCGACTACGTCCAGGTGCTCCAGTCCTCGGGCGGCGGGGGCGGCGGGGG1680PMVVDYVQVLQSSGGGGGGGCGGGGGCACCACTCCCCCGCCGACCGGCGACCGGGACGCGTACGGTCAGATCCAGGCGGA1740GGTTPPPTGDRDAYGQIQAEGTCGTACGACGGCCAGTCCGGTGTCGCCACCGAGACCACCACGGACACCGGCGGCGGACA1800SYDGQSGVATETTTDTGGGQGGACATGGGCTACCTCGCCAATGGCGACTGGGCGCTGTACAAGGGCGTGAACTTCGGCTC1860DMGYLANGDWALYKGVNFGSGACACCGGCCACCCAGTTCTACGGTCGGGTGGCGAGCGGCGCGGGCGGCGGGGTCAGCGG1920TPATQFYGRVASGAGGGVSGCCTGGTGGAGGTGCGGCTGGACAGCCGTACGAACGCGCCGATCGGGAGCTTCGCGGTGGG1980LVEVRLDSRTNAPIGSFAVGCGACACCGGGGGCTGGCAGTCCTGGCGGACGGTTCCGGCCAACATCGGGTCCGTCACCGG2040DTGGWQSWRTVPANIGSVTGCACGCACGATGTGTACCTCACGTTCAGCAGCGGGCAGCCGGCCGACTTCGTGAACGTCAA2100THDVYLTFSSGQPADFVNVNCTGGTTCGACTTCGGGCACTGATCCGCCGCGGGTACCGGGGTAGCGTTCACAGCATGTCG2160WFDFGH*PartialalignmentoftheS.Sioyaensisenzymewithotherb-1,3-glucanaseofglycosylhydrolasesfamily1657WSQVFLDDFDGAAGSSVNTANWQFDTGTSYPGGAGNWG--TGEVESMTSSTSNVSLDGNGDLLITPRRDASGNWTSGRSsio57LLWSDEFDGAAGSAPNPAVWNHETGA------HGWG--NAELQNYTASRANSALDGQGNLVITARRE-------GDOxan46WRLIWHDEFEG---SEVNKEYWTFEKGNGIAYGIPGWG--NGELEYYAE---NNTYIVNGTLVIEARKEIITDPNEGTPfur216WQLVWSQEFDD---GVIDPNVWNFEIGNGHAKGTPGWG--NAELEYYTD---KNAFVENGCLVIEARKEQVSD-EYGTTnea425LIWQDEFN---GTTLDTSKWNYETGYYLNNDPATWGWGNAELQHYTNS-TQNVYVQDGKLNIKAMNDSKSFPQDPNBcir30WELVWSDEFD--YNGLPDPAKWDYDVGG------HGWG--NQELQYYTRARIENARVGGGVLIIEARRE-----SYEGRmar135IETTRTDFQPPAGGKLR------VEARLQMPNVTGDAAAGYWPAFWMLGAPFRGNYQNWPGVGELDIMENV-QGLNKTSsio117--GSYTSARMTTQGKYQPQYGRI-EARIQIPR-----GQGIWPAFWMLGG--SFPGTPWPSSGEIDIMENVGFEPHRVOxan115--FLYTSSRLKTEGKVEFSPPVVVEARIKLPK-----GKGLWPAFWMLGS--NIREVGWPNCGEIDIMEFLGHEPRTIPfur284--YDYTSARITTEGKFEIKYGKI-EIRAKLPK-----GKGIWPALWMLGN--NIGEVGWPTCGEIDIMEMLGHDTRTVTnea496RYAQYSSGKINTKDKLSLKYGR-VDFRAKLPT-----GDGVWPALWMLPKDSVYGT--WAASGEIDVMEARGRLPGSVBcir92R--EYTSARLVTRGKASWTYGRF-EIRARLPS-----GRGTWPAIWMLPDRQTYGSAYWPDNGEIDIMEHVGFNPDVVRmar205WATMHCGTSPGG-PCNETSGIGNLTACPNTTCHSGLHTYTMEWDRSVSPEAIRFSVDGVTYQTVTANH---MDAVTWTSsio184HGTVHGPGYSG----GSGITGMYQHPQGWS-FADTFHTFAVDWK----PGEITWFVDGQQFHRVTRAS-VGANA--W-Oxan183HGTVHGPGYSG----SKGITRAYTLPEGVPDFTEDFHVFGIVWY----PDKIKWYVDGTFYHEVTKEQ-VEAMGYEW-Pfur352LRTAHGPGYSG----GASIGVAYHLPEEVPDFSEDFHVFSIEWD----ENEVEWYVDGQLYHVLSKDE-LAELGLEW-Tnea566SGTIH---FGGQWPVNQSSGGDYHFPEG-QTFANDYHVYSVVWE----EDNIKWYVDGKFFYKVTNQQWYSTAAPNNPBcir162HGTVHTKAYNHL--LGTQRGGSIRVPTARTDF----HVYAIEWT----PEEIRWFVDDSLYYRFPNER-LTNPEADWRRmar378NAT-NHGFFVILNVAMGGSsio249--VFDQPFFLILNVAVGGOxan250--VFDKPFYIILNLAVGGPfur393--VFDHPFFLILNVAMGGTnea636NAPFDEPFYLIMNLAVGGBcir228HWPFDQPFHLIMNIAV--Rmar9、靜夜四無(wú)鄰鄰，荒居舊業(yè)業(yè)貧。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黃葉葉樹，燈下下白頭人。。。06:11:2706:11:2706:1112/23/20226:11:27AM11、以我獨(dú)沈沈久，愧君君相見頻。。。12月-2206:11:2706:11Dec-2223-Dec-2212、故人江海別別，幾度隔山山川。。06:11:2706:11:2706:11Friday,December23,202213、乍乍見見翻翻疑疑夢(mèng)夢(mèng)，，相相悲悲各各問問年年。。。。12月月-2212月月-2206:11:2706:11:27December23,202214、他他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生生白白發(fā)發(fā)，，舊舊國(guó)國(guó)見見青青山山。。。。23十十二二月月20226:11:27上上午午06:11:2712月月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月226:11上上午12月-2206:11December23,202216、行動(dòng)出成成果，工作作出財(cái)富。。。2022/12/236:11:2706:11:2723December202217、做前，能能夠環(huán)視四四周；做時(shí)時(shí)，你只能能或者最好好沿著以腳腳為起點(diǎn)的的射線向前前。。6:11:27上上午6:11上上午06:11:2712月-229、沒有有失敗敗，只只有暫暫時(shí)停停止成成功?。?。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、很多事情情努力了未未必有結(jié)果果，但是不不努力卻什什么改變也也沒有。。。06:11:2806:11:2806:1112/23/20226:11:28AM11、成功就是是日復(fù)一日日那一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小努力力的積累。。。12月-2206:11:2806:11Dec-2223-Dec-2212、世間成成事，不不求其絕絕對(duì)圓滿滿，留一一份不足足，可得得無(wú)限完完美。。。06:11:2806:11:2806:11Friday,December23,202213、不知香香積寺，，數(shù)里入入云峰。。。12月-2212月-2206:11:2806:11:28December23,202214、意志志堅(jiān)強(qiáng)強(qiáng)的人人能把把世界界放在在手中中像泥泥塊一一樣任任意揉揉捏。。23十十二二月20226:11:28上上午06:11:2812月月-2215、楚塞三三湘接，，荊門九九派通。。。。十二月226:11上午午12月-2206:11December23,202216、少年十十五二十十時(shí)，步步行奪得得胡馬騎騎。。2022/12/236:11:2806:11:2823December202217、空山新雨雨后，天氣氣晚來(lái)秋。。。6:11:28上上午6:11上上午06:11:2812月-229、楊柳柳散和和風(fēng)，，青山山澹吾吾慮。。。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、閱讀讀一切切好書書如同同和過過去最最杰出出的人人談話話。06:11:2806:11:2806:1112/23/20226:11:28AM11、越越是是沒沒有有本本領(lǐng)領(lǐng)的的就就越越加加自自命命不