基因工程與基因重組

基因重組與基因工程生物工程定義生物工程是生物技術的總稱，是對生命有機體在分子水平、細胞水平、組織水平、個體水平進行不同層次的創(chuàng)造性設計和改造，使之能定向組建具有特定性狀的新物種或新品系，從而造福人類的現(xiàn)代應用技術學科。生物技術的四大體系基因工程細胞工程酶工程發(fā)酵工程

重組DNA技術（recombinantDNAtechnique），又叫DNA克?。―NAcloning）。在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)——同源的或異源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA與載體DNA結(jié)合成一具有自我復制能力的DNA分子（復制子），繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增，以獲得該DNA分子的大量拷貝。這類克隆是在分子水平上操作，故又稱分子克?。╩olecularcloning）。一、重組DNA技術相關概念（一）DNA克隆

由于DNA克隆研究對象常常是特異的基因片段，所以又稱作基因克?。╣enecloning）。實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關工作統(tǒng)稱為基因工程（geneticengineering）。1997年2月23日英國Wilmut

從復雜的生物有機體基因組中，分離出目的基因片段。用合適的酶切割目的基因和載體，產(chǎn)生匹配的末端在體外，將目的基因片段連接到能自我復制的并且具有選擇標記的載體分子上，形成重組DNA分子。將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞（亦稱宿主細胞），并與之一起增殖。

篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞克隆。從篩選出的陽性克隆中提取出擴增的目的基因片段，供進一步研究使用?；蚩寺〉幕静襟E基因克隆的基本步驟粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端酶切后的目的基因片段接(連接)連接后的重組質(zhì)粒DNA分子重組質(zhì)粒目的基因大腸桿桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化)染色體體真好玩!篩(篩篩選)分解抗抗生素素的酶酶含抗生生素的的培養(yǎng)養(yǎng)基還活著著!玩完啦啦!大腸桿桿菌大腸桿桿菌大量生生長提取大大量質(zhì)粒酶切鑒定您已經(jīng)經(jīng)掌握握基因因克隆隆的主主要步步驟！！分離目的的基因因和載載體DNA。用合適適的酶酶切割上述述兩者者，產(chǎn)產(chǎn)生匹匹配的的末端端。連接酶將目目的基基因裝裝入載載體。。轉(zhuǎn)入細菌菌。篩選具有有抗藥藥性克克隆。。（二））重組組DNA中中的工工具酶酶限制性性核酸酸內(nèi)切切酶連接酶酶聚合酶酶多聚核核苷酸酸激酶酶堿性磷磷酸酶酶1.限限制制性核核酸內(nèi)內(nèi)切酶酶（restrictionendonuclease））定義：：能識別別DNA的特異序序列，并在在識別別位點點或其其周圍圍切割雙雙鏈DNA的一類類核酸酸內(nèi)切切酶。。主要來來源于于原核核生物物，可可將侵侵入宿宿主細細胞的的外源源性DNA迅速速降解解，而而對細細菌自自身的的DNA，，則通通過甲甲基化化酶在在該限限制酶酶切位位點甲甲基化化修飾飾而保保護自自身的的DNA不不被降降解。。限制性內(nèi)內(nèi)切酶和和甲基化化酶共同構(gòu)成成細菌的的限制和修修飾系統(tǒng)。限限制性內(nèi)內(nèi)切酶由由于能限限制外源源DNA的“入入侵”而而得名。。限制酶的的命名限制酶的的命名是是根據(jù)含含有該酶酶的微生生物種屬屬而定。。通常有有三個斜斜體字母母的縮寫寫表示。。第一個大大寫字母母取自細菌屬名名的第一個個字母；；第二、三三個小寫寫字母取自微生生物種名的頭兩個個字母；；第四個字字母代表該微微生物同同種內(nèi)不不同的株系；如果同同一株名名發(fā)現(xiàn)幾幾種限制制酶，則則根據(jù)其其被發(fā)現(xiàn)現(xiàn)和分離離的先后后順序，，用羅馬數(shù)字字表示。例如，從從大腸桿桿菌（EscherichiaColi）RY13株中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)分離的的第一種種限制酶酶，稱為為EcoRI。。限制性內(nèi)內(nèi)切酶的的分類和和特點根據(jù)限制制酶的組組成、輔輔因子及及切割DNA方方式不同同，可分分為I、II、III型。。重組DNA技技術中常常用的是是II型限限制性內(nèi)內(nèi)切酶。II型型酶作用用特點是是有嚴格格的識別別、切割割順序，，以內(nèi)切切方式水水解雙鏈鏈DNA中的磷磷酸二酯酯鍵，產(chǎn)產(chǎn)生的DNA片片段5'端端為磷酸酸基，3'端端為羥基基。識別順順序一般般為4~6個堿堿基，通通常是回文結(jié)構(gòu)構(gòu)（palindrome））?；匚慕Y(jié)構(gòu)構(gòu)II類限限制性核核酸內(nèi)切切酶識別別DNA位點點的核苷苷酸序列列呈二元旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)對稱，通常稱稱這種特特殊的結(jié)結(jié)構(gòu)順序序為回文結(jié)構(gòu)構(gòu)。EcoRI5'……GAATTC…3'3'……CTTAAG…5'II型酶酶切割雙雙鏈DNA產(chǎn)生生3種不同的切切口：在對稱軸中中心同時切割割雙鏈，，產(chǎn)生平末端或稱鈍性性末端（（bluntend），如如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3'3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'在對稱軸兩兩側(cè)相對對位點分別切割割一條鏈鏈。從5’端端切割產(chǎn)生生5'端端突出的的粘性末末端，如EcoRI：：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'從3'端端切割產(chǎn)生生3'端端突出的的粘性末末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…GACGTC…5'表15-2一些常用的限制性內(nèi)切酶位點一些限制制酶雖然然識別序序列不完完全相同同，但能能產(chǎn)生相相同類型型的粘性性末端，，稱為同尾酶，所產(chǎn)生生的末端端稱配伍末端端（compatibleend），可進行行相互連連接。產(chǎn)產(chǎn)生平末末端的酶酶切割DNA后后，也可可彼此連連接。連接酶可催化化DNA分子子中相鄰5'磷酸和3'羥基末端之間形成成磷酸二酯鍵，使DNA切切口封合或使使兩個DNA分子或片段段連接。常用用的有T4（噬菌體）DNA連接酶酶和E.ColiDNA連接酶酶。2.DNA連接酶3.聚合酶酶重組DNA技技術中，聚合合酶（polymerase）的最最重要作用是是以DNA或或RNA為模模板在體外合合成DNA或或RNA?？煽煞譃镈NA聚合酶酶和RNA聚合酶酶兩大類。

名稱 功能及應用 大腸桿菌DNA聚合酶I以DNA為模板，催化5’→3’核酸鏈的延長，另有3’→5’的外切酶

大片段（klenow）活性。常用于DNA3’末端的標記和填充、cDNA第二鏈的合成、DNA測序。TaqDNA聚合酶以DNA為模板，催化5’→3’核酸鏈的延長，另有弱的5’→3’的外切酶活性，耐高溫。常用于PCR及DNA測序。末端轉(zhuǎn)移酶催化NTP中的NMP通過其磷酸基與DNA3’-OH連接而使DNA鏈延長，無需模板。常用于3'端標記或形成DNA共聚尾巴。逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，合成cDNA鏈（5’→3’），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一、二鏈的合成及反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA。常用于離體條件下，合成單鏈RNA作為雜交探針。T4多核苷酸激酶酶（polynucleotidekinase）催化化ATP的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的的5'末端羥羥基上。常用于單單鏈或雙鏈DNA和RNA探針的5'端標記記。4.多聚核核苷酸激酶5.堿性磷磷酸酶牛小腸堿性磷磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase,CIP）），催化DNA或RNA的5'磷酸基基水解。常用于去除除線狀載體DNA兩端的的5'磷酸酸基團，防止載體自身身連接環(huán)化；也用于用32P標記DNA的5'末末端之前除去去原來的5'磷酸基。。應用重組DNA技術有時時是為分離、、獲得某一感興趣的基因因或DNA片片段，或是獲得感感興趣的表達達產(chǎn)物———蛋白質(zhì)。這些感興趣趣的基因或DNA序列就就是目的基因因。目的基因因有兩種類型型，即cDNA和基因組DNA。（三）目的基基因（targetgene）（四）基因因工程載體基因載體：或稱克隆載體（cloningvector）,是在基因工工程中為“攜攜帶”感興趣趣的外源DNA（目的基因、外外源基因）、實現(xiàn)外源源DNA的無無性繁殖或表表達有意義的的蛋白質(zhì)所采采用的一些DNA分子，，具有自我復復制和表達功功能。其中，，為使插入的的外源DNA序列可轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄、進而翻翻譯成多肽鏈鏈而特異設計計的克隆載體體又稱表達載體。能自主復制并能帶動插入的的目的基因因一起復制制。具有一個以以上的單一一限制性酶切切位點（多多克隆位點點，multiplecloningsites），，以便目的的基因的插插入。具有合適的的篩選標記（如抗藥性性基因，酶酶基因等）），以便篩選陽性性克隆。載體分子量小，以便容納納較大目的的基因，拷拷貝數(shù)高。。在細胞內(nèi)穩(wěn)定性高，以便確保保重組體穩(wěn)穩(wěn)定傳代而而不易丟失失。理想載體應應具備的基基本條件載體的分類類

質(zhì)粒（plasmid）

噬菌體（phage）

病毒（virus）

克隆載體（cloningvector）

表達載體（expressionvector）常用的載體體按來源分分為載體按得到到的產(chǎn)物分分類可分為為質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒是存在在于細菌染染色體外的的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，能在在宿主細胞胞獨立自主地地進行復制制，并在細胞胞分裂時保保持恒定地地傳給子代代細胞。質(zhì)質(zhì)粒帶有某某些遺傳信息，會賦予宿宿主細胞新的遺傳性性狀。因為質(zhì)粒粒DNA有有自我復制制功能及攜攜帶遺傳信信息等特性性，可作為為重組DNA操作作的載體。。染色體質(zhì)粒pBR322質(zhì)粒粒圖譜氨芐青霉素素抗性基因因四環(huán)素抗性性基因多克隆位點點噬菌體載體體噬菌體是一種細菌菌病毒，可可作為克隆隆載體。目前使用的的噬菌體載載體主要有有λ噬菌體衍生物載體體、M13噬菌體載體等。除除M13噬菌體載體體外，這類類載體的特特點是其容量比質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體大，即即可可插插入入較較大大的的外外源源DNA片片段段（（如如20kb以以上上））。?？梢砸栽谠隗w體外外包包裝裝產(chǎn)產(chǎn)生生感感染染性性很很高高的的噬噬菌菌體體顆顆粒粒。。噬菌菌體體頭部尾部尾絲λ噬菌菌體λ噬菌菌體（（lambdlabacteriophage））是一一種大大腸桿桿菌病病毒，，為線性雙雙鏈DNA，它的的兩端端各有有12個堿堿基的的互補粘粘性末末端，稱COS位點點。當噬噬菌體體侵入入宿主主細胞胞，兩兩個粘粘性末末端互互補結(jié)結(jié)合，，形成成環(huán)狀分分子。λDNA在體體外可可包裝裝成病病毒顆顆粒，，并高高效感感染大大腸桿桿菌。。λ噬菌菌體侵侵入細細菌后后，即即可裂解生生長（環(huán)狀狀DNA在在細菌菌中多多次復復制，，合成成大量量噬菌菌體基基因產(chǎn)產(chǎn)物，，裝配配成噬噬菌體體顆粒粒，裂裂解宿宿主菌菌），，又可可以溶源生生長（λ噬噬菌體體DNA整整合到到細胞胞染色色體基基因組組DNA中中，與與染色色體DNA一起起復制制，并并遺傳傳給子子代細細胞，，宿主主細胞胞不被被裂解解）。。噬菌體體感染染細菌菌示意意圖裂解生生長λ噬菌菌體基基因組組中有有較大大區(qū)域域僅與與溶源源生長長有關關，而而對裂裂解生生長并并非絕絕對需需要，，因此此可以以缺失失或被被外源DNA取代。。經(jīng)改改造的的λ噬噬菌體體衍生生載體體可分分兩類類:一類是是插入型型載體體，即外外源基基因插插入到到載體體上單單一的的限制制酶位位點，，如λλgt系列列等。。另一類類是置換型型，即兩兩個限限制酶酶位點點之間間的DNA片段段可被被外源源DNA取取代，，如Charon，，EMBL系列列等。。M13噬菌體體載體體M13噬菌體體基因因組是是單鏈環(huán)環(huán)狀DNA，當它它侵犯犯宿主主菌后后，在在細菌菌胞內(nèi)內(nèi)酶的的作用用下，，單鏈鏈DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變成成復制制型雙雙鏈DNA，可可提取取出來來做基基因重重組。。經(jīng)改造的M13噬菌體有M13mp系列和pUC系列。。M13噬菌體載體——pUC19α互補：單獨存在的的α及ω片段都沒有半半乳糖苷酶的的活性，只有有宿主細胞與與克隆載體同同時表達兩個個片段時，宿宿主細胞內(nèi)才才有半乳糖糖苷酶活性，，使特異性作作用物（X-gal）變變?yōu)樗{色化合物。突變型lac-E.coli表達β-半乳糖苷酶的的ω片段。如果插入的外外源基因是在在lacZ’’基因內(nèi)，就就會影響lacZ’的表表達，利用lac-E.coli為轉(zhuǎn)染或感染染細胞，在含含X-gal的培養(yǎng)基上上生長時會出出現(xiàn)白色菌落；若無外源基基因插入，則則出現(xiàn)藍色菌落。多克隆位點編碼β-半乳糖苷酶的α片段病毒載體是一類真核載體，能把基因引引入到真核核細胞中，并并在其中被表表達。因此是是研究真核細細胞表達及調(diào)調(diào)控的有力工工具。如:腺腺病毒、逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病毒、乳乳頭瘤病毒等等。二、重重組DNA技術術基本本原理理目的基基因的獲取取克隆載體的選擇擇和構(gòu)構(gòu)建外源基基因與與載體體的連接重組DNA導入受受體菌菌重組體體的篩選克隆基基因的的表達（一））目的的基因因的獲獲取化學合合成法法基因組組DNAcDNA聚合酶酶鏈反反應1.化化學合合成法法已知某某種基基因的的核苷苷酸序序列，，或根根據(jù)某某種基基因產(chǎn)產(chǎn)物的的氨基基酸序序列推推導出出編碼碼該多多肽鏈鏈的核核苷酸酸序列列，再再利用用DNA合成成儀通過化化學合合成原原理合合成目目的基基因。。利用該該法合合成的的基因因有：：人生生長激激素釋釋放抑抑制因因子、、胰胰島素素原、、腦腦啡肽肽、干干擾素素基因因等2.基基因組組DNA利用限制性性核酸酸內(nèi)切切酶將染色色體DNA切割割成一一定基基因水水平的的許多多片段段，將將這些些片段段與適適當?shù)牡目寺÷≥d體體拼接接成重重組DNA分子子，繼繼而轉(zhuǎn)入受受體菌菌擴增，，使每每個細細菌內(nèi)內(nèi)都攜攜帶一種重組DNA分子子的多多個拷拷貝。。不同細細菌所所包含含的重重組DNA分子子可能能為不不同的的染色色體DNA片段段，這這樣全全部轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化細細菌所所攜帶帶的各各種染染色體體片段段就代代表了了染色色體的的整個個基因因組。。存在在于轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化細細菌內(nèi)內(nèi)、由由克隆隆載體體所攜攜帶的的所有有基因組組DNA片片段的的集合合稱為基因組組DNA文文庫（genomicDNAlibrary））。基基因組組DNA文文庫涵涵蓋了了基因因組全全部的的遺傳傳信息息。建立基基因組組文庫庫后，，需結(jié)結(jié)合適適當篩選方方法從眾多多轉(zhuǎn)化化子菌菌落中中選出出含有有某一一基因因的菌菌落，，再進進行擴增，將重重組DNA分離離、回回收，，以獲獲得目目的基基因。。3.cDNA把細胞胞總mRNA通過逆逆轉(zhuǎn)錄錄合成成總cDNA，再與與適當當載體體連接接后轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受受體菌菌，從從而得得到含含有某某種生生物體體全部部cDNA集合合（稱稱為cDNA文文庫庫，cDNAlibrary）。。然后后用適適當?shù)牡姆椒ǚ◤腸DNA文文庫中中篩選出目的的cDNA。cDNA文文庫的特點點是它它只包包括已已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列，且不包括內(nèi)含含子及調(diào)控控序列，所以cDNA文庫庫的復雜性性要比基因因組文庫低低的多。但由于不同同的細胞類類型、發(fā)育育階段以及及細胞所處處的特定狀狀態(tài)是由特特定基因的的表達所決決定的，因因此各自的的mRNA種類就不不同，由此此產(chǎn)生的cDNA又又是獨特的的。與基因因組DNA文庫類似似，由總mRNA制作的cDNA文庫庫包含了細細胞表達的的各種mRNA信息息，自然也也含有我們們感興趣的的編碼cDNA。4.聚合合酶鏈反應應（polymerasechainreaction,PCR））參見437頁ChainReactionPolymerasechainreactionPCR的產(chǎn)產(chǎn)物數(shù)目以指數(shù)級方方式增長中子的釋放放數(shù)目以指數(shù)級方方式增長中子原子核短時間內(nèi)巨巨大的能量釋放，，原子爆炸DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3CycleN理論上可達2n個拷貝原料（pg）產(chǎn)物(ug)PCR的的基本原理理體外高效、快速速、特異地擴增目的的基因或DNA片段段的技術。其原理類似似于DNA的體內(nèi)復復制，只是是在試管中中給DNA的體外合合成提供一一種合適條條件——模模板DNA，寡核苷苷酸引物，，DNA聚聚合酶，合合適的緩沖沖液系統(tǒng)和和DNA變變性、復性性及延伸的的溫度與時時間等，使使目的DNA得以迅速擴擴增DNA的體體內(nèi)復制：：原料：模板DNA（基因組DNA），隨機小分子子RNA引引物，dNTPs酶：DNA聚合合酶，解旋旋酶，引發(fā)發(fā)酶反應條件：：胞液環(huán)境，，37℃℃反應過程：：模板DNA解旋、引引發(fā)體的形形成、延長長（三階段））產(chǎn)物：模板DNA（基因組DNA）拷貝數(shù)增增加一倍原料：模板DNA（基因組DNA，cDNA）一對特異性寡核苷酸引引物，dNTPs酶：TaqDNA聚合合酶反應條件：：合適的緩沖沖液，三種種變化的溫度度（94，50-70，72℃℃），一一定的循環(huán)數(shù)（25-35）反應過程：：DNA模板板變性（解解鏈）、模模板與與引物退火火、引物物延伸（三階段，，多循環(huán)）產(chǎn)物：目的DNA（特異性））拷貝數(shù)增增加2n倍PCR：DNA模板板變性與體內(nèi)DNA解鏈過過程不同，，PCR中中作為模板板的雙鏈DNA是通過95℃左右的的高溫使其發(fā)生變變性，形成成單鏈DNA模板與引物物退火PCR通通常常需需要要兩兩條條寡核核苷苷酸酸鏈鏈作為為DNA合合成成時時的的引物物（primer））,這這兩兩個個引引物物分分別別與與待待擴擴增增模模板板DNA的的目標標片片段段兩端端的的序序列列互互補補。。在在降降低低溫溫度度的的過過程程中中，，通通過過控控制制退火火條條件件，引引物物就就能能準準確確地地與與擴擴增增區(qū)區(qū)域域的的兩兩端端配配對對。。primers⑴引引物物短，不不易易纏纏繞繞；；⑵設設計計的的引引物物是是與與模模板板DNA兩兩端端序序列列互互補補；；⑶引引物物的的量量遠大大于于模板板分分子子的的量量，，引引物物與與模模板板DNA形形成成雙雙鏈鏈的的幾幾率率遠遠遠遠高高于于DNA分分子子自自身身的的復復性性。。引物物延延伸伸在PCR反反應應體體系系中中的的DNA聚聚合合酶酶，能能夠夠催催化化反反應應體體系系中中游游離離的的單單核核苷苷酸酸（（dNTPs））由由引引物物5'→→3'方方向向，，按按堿堿基基配配對對的的原原則則延延伸伸，，形形成成兩兩條條與與模模板板DNA互互補補的的復復制制鏈鏈。。Taq酶dNTPS新合成的的鏈又可可作為下下輪循環(huán)環(huán)反應的的模板。熱變性-復性-延伸的過程就就是一個個PCR循環(huán)每每一循循環(huán)后的的模板均均比前一一循環(huán)增增加1倍倍。理論論上講，，擴增DNA產(chǎn)產(chǎn)量是呈呈指數(shù)上上升的，，即n個個循環(huán)后后，產(chǎn)量量為2n拷貝。而而實際上上，PCR的擴擴增倍數(shù)數(shù)為（1+X）n，X為擴擴增效率率，平均均為75%熱變性-復性-延伸25-35次循環(huán)百萬倍擴增盡管PCR擴增增DNA非常有有效，但但目的DNA序序列的指指數(shù)擴增增并不是是一個無無限制的的過程。。在正常的的反應條條件下，，經(jīng)30次循環(huán)環(huán)之后，，酶的催催化反應應趨于飽飽和，就就會出現(xiàn)現(xiàn)平臺效應(Plateau)，產(chǎn)物的量量不再增加加?！捌脚_效應應”出現(xiàn)的的遲早還取取決于酶的性能、模板DNA的拷貝數(shù)、dNTP濃濃度等多種因素素。（三）外源基基因與載體的的連接（二）克隆載載體的選擇粘性末端連接接平端連接同聚物加尾連連接人工接頭連接接1.粘性性末端連接外源DNA片片段與載體用用同一種限制性內(nèi)切酶酶切割，獲得得相同的粘性性末端，相互互互補配對，，在DNA連連接酶作用下下，形成重組組DNA分子子。5’…C▼CGG…3’5’…C▼CGG…3’3’…GGC▲C…5’3’…GGC▲C…5’HpaII2.平端端連接因載體分子和和目的DNA分子之間并并不一定都產(chǎn)產(chǎn)生互補的粘粘性末端，有有的限制性內(nèi)內(nèi)切酶只能切切成平末端。平末端仍用用T4DNA連接酶酶連接，只是效率低，需要的DNA濃度更高高。3.同同聚物加尾連連接同聚物加尾連連接是利用同同聚物序列，，如polyG與polyC之間間的退火作用完成連接接。在末端轉(zhuǎn)移酶作用下，在DNA片段末末端加上同聚聚物序列，如如將poly（dC）加加到雙鏈DNA片段3'羥基上，，而將poly（dG））加到質(zhì)粒載載體3'羥羥基上，制造造出粘性末端，然后進行粘粘性末端連接接。4.人工工接頭連接接頭（linker）是是指人工合成成的一段雙鏈寡核苷酸酸，其中包含一一個（或兩個個）酶切位點。首先將接頭頭與目的DNA片段進行行平末端連接接，繼而用適適當?shù)膬?nèi)切酶酶將接頭部位位切出粘性末末端，最后與與載體進行粘粘性末端連接接。（四）重組體導導入受體細胞胞在分子克隆中中，將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體體構(gòu)建的重組組分子導入受受體細胞的過過程稱為轉(zhuǎn)化（transformation）。以噬菌體和真核病毒作載體構(gòu)建的的重組分子導導入受體細胞胞的過程稱為為轉(zhuǎn)染（transfection））?；蚱危ㄌ靥貏e是純化的的DNA）很很難直接導入入受體細胞，，通常將受體體細胞預先加加以處理，使使其提高基因因?qū)爰毎牡男?。例如如用低溫CaCl2（冰?。┨幚砝泶竽c桿菌，，可以大大提提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化效率。這這種經(jīng)過預處處理的、容易導入外源源核酸分子的受體細細胞被稱作“感受態(tài)細胞胞”（competentcell）。（五）重組體的的篩選通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染等方式，，重組體DNA分子被導導入受體細胞胞，經(jīng)適當涂涂布的培養(yǎng)基基培養(yǎng)得到大大量轉(zhuǎn)化子菌菌落或轉(zhuǎn)染噬噬菌斑。因為為每一重組體只攜帶某一段外源基基因，而轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時每一受體菌又只能接受一個重組體分分子，所以設法將將眾多的轉(zhuǎn)化化菌落或噬菌菌斑區(qū)分開來來，并鑒定哪哪一菌落或噬噬菌斑所含的的重組DNA分子子確實帶有有目的基因因，即可得得到目的的基因的的克隆，，這一過過程即為為篩選選（（screening））。根據(jù)據(jù)載載體體體體系系、、宿宿主主細細胞胞特特性性及及外外源源基基因因在在受受體體細細胞胞表表達達情情況況不不同同，，可可采采取取不不同同的的篩篩選選方方法法。。1.直接接篩篩選選法法（1））抗抗藥藥性性標標志志篩篩選選（2））標標志志補補救救（3））分分子子雜雜交交法法2.非非直直接接篩篩選選法法免疫疫學學方方法法抗藥藥性性標標志志篩篩選選如果果克克隆隆載載體體攜攜帶帶有有某某種種抗藥藥性性標標志志基基因因，如如Ampr或Tetr，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化后后只只有有含含這這種種抗抗藥藥基基因因的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化子子細細菌菌才才能能在在含含該該抗抗生生素素的的培培養(yǎng)養(yǎng)板板上上生生存存并并形形成成菌菌落落，，這這樣樣就就可可將將轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化菌菌與與非非轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化菌菌區(qū)區(qū)別別開開來來。。如果果重重組組DNA時時將將外源源基基因因插插入入標標志志基基因因內(nèi)內(nèi)，如如插插入入Tetr內(nèi)，，使使標標志志基基因因Tetr失活活，陽陽性性重重組組子子則則不不能能在在含含有有Tet的的培培養(yǎng)養(yǎng)板板上上生生長長。。用用插入入失失活活篩選選的的重重組組子子載載體體往往往往帶帶有有另一一個個抗抗生生素素抗抗性性基基因因如Ampr，因此此可以以通過過雙抗生生素對照篩篩選，，即陽陽性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子子可以以在含含Amp的的培養(yǎng)養(yǎng)板上上生長長而不不能在在含Tet的培培養(yǎng)板板上生生長。。標志補補救若克隆隆的基基因能能夠在在宿主主菌內(nèi)內(nèi)表達達，且且表達達產(chǎn)物物與宿宿主菌菌的營營養(yǎng)缺缺陷互互補，，則可可以利利用營養(yǎng)突突變菌菌株進行篩篩選，，這就就是標志補補救（（markerrescue））。-互互補：：通過藍白斑斑篩選可可以篩篩選、、鑒定定重組組體與與非重重組體體載體體。當外源源基因因插入入后，，LacZ’基基因被被破壞壞，不不能合合成完完整的的β-半乳乳糖苷苷酶，，因此此不能能分解解底物物X-gal，，菌落落成白色β-半半乳糖糖苷酶酶能分分解X-gal，形形成藍色菌落。。分子雜雜交法法（molecularhybridization）參見435頁核酸分分子雜雜交（molecularhybridization））：指指用標標記的的已知知DNA或或RNA片片段（（探針）檢測樣樣品中未未知核酸酸序列，，通過堿堿基互補補配對原原則發(fā)生生同源性性結(jié)合，，再經(jīng)顯顯影或顯顯色的方方法，將將結(jié)合的的核酸序序列的位位置或大大小顯示示出來。。探針：帶有可可檢測標標記的已已知序列列的DNA或RNA片片段。核酸分子雜交的基本原理變性（denaturation）復性（renaturation）雜交（hybridization）預雜交（prehybridization）變性（denaturation））概念：在某些些理化因因素的作作用下，，核酸雙雙鏈分子子堿基對對的氫鍵鍵斷裂，，疏水作作用被破破壞，雙雙股螺旋旋或發(fā)夾夾結(jié)構(gòu)打打開，有有規(guī)則的的結(jié)構(gòu)被被破壞，，形成單單鏈分子子。變性的因因素：加熱、、酸、堿堿、尿素素、甲酰酰胺等增色效應應（hyperchroniceffect）：：核酸變變性時，，紫外吸吸收值A260隨之升高高的現(xiàn)象象。熱變性DNA的的熔解曲曲線Tm值（meltingtemperature）:熱變性性時，50%DNA分分子變性性的溫度度。又叫叫解鏈溫溫度、熔熔解溫度度。復性（renaturation））概念：在適當當條件下下，變性性DNA的兩條條互補單單鏈重新新締合，，形成雙雙鏈的過過程。熱變性后后，緩慢降低低溫度至比Tm值低20-30℃時，變性性的單鏈鏈DNA可恢復復其雙鏈鏈結(jié)構(gòu)，，稱為退火。雜交（hybridization）來源不不同的兩條條單鏈核酸分分子通通過堿堿基互互補可可形成成異源源雙螺螺旋。。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA雜交交分子子。預雜交交（prehybridization））概念：為了了減少少探針針與廣廣泛存存在的的非互互補核核酸的的非特特異性性結(jié)合合，在在雜交交前用用封閉閉物將將這些些非特特異性性位點點封閉閉。這這一雜雜交前前的處處理過過程稱稱為預預雜交交。常用的的封閉閉物：變性性的非非特異異性DNA，如如鮭魚魚精子子DNA、、小牛牛胸腺腺DNA，，又稱稱為覆覆蓋DNA。變性、復性、、雜交示意圖圖核酸探針：帶有可檢測測標記的已知知DNA或RNA片段，，用于檢測待待測樣品中的的靶核酸序列列。探針分類放射性標記核酸探針非放射性標記核酸探針印跡雜交概念：指將待測核核酸序列結(jié)合合到一定的支支持物上，然然后與存在于于液相中的核核酸探針進行行雜交的過程程。探針與待測測核酸片段段中的同源源序列形成成雜交分子子，探針分分子顯示的的位置及其其量的多少少可反應出出待測的核核酸分子是是否存在相相應的基因因序列及其其大小。

分類DNA印跡雜交（Southernblotting）RNA印跡雜交（Northernblotting）提取DNA限制性內(nèi)切切酶消化瓊脂糖凝膠膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜與DNA或或RNA探探針雜交放射自顯影影DNA印跡跡雜交（Southernblotting）檢測靶分子子為DNA,檢測測靶分子是是否含有目目的基因?qū)傊悄z上的DNA分子轉(zhuǎn)移移到硝酸纖維素素膜上菌落原位雜雜交（Insituhybridization））含有與探針針互補序列列的菌落或或噬菌斑經(jīng)經(jīng)放射自顯顯影后，在在X光底片片上出現(xiàn)雜雜交點。將轉(zhuǎn)化后得得到的菌落落或噬菌斑斑原位轉(zhuǎn)移移到NC膜膜上，得到到一個與平平板菌落或或噬菌斑分分布完全一一致的復制制品。原位裂解細細胞，堿變變性，核酸酸分子被固固定于膜上上加入標記的的DNA或或RNA探探針進行雜交根據(jù)陽性反反應位置，，可從保留留的母板上上挑出所需需的陽性克隆。RNA印跡雜交（（Northernblotting）檢測靶分子子為RNA。主要用用于檢測某某一組織或或細胞中已已知的特異異mRNA的表達水水平，或比比較不同組組織或細胞胞的同一基基因的表達達情況。與Southernblotting不同的的是在轉(zhuǎn)移移前不需進進行限制性性內(nèi)切酶切切割。核酸雜交分分類表雜交方法適用范圍Southern印跡檢測經(jīng)凝膠電泳分開的DNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上Northern印跡檢測經(jīng)凝膠電泳分開的RNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上斑點雜交檢測未經(jīng)分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子菌落或噬菌斑雜交檢測固定在膜上的、經(jīng)裂解后從細菌或噬菌體中釋放出的DNA分子原位雜交檢測細胞或組織中的DNA或RNA分子免疫學方法法免疫學篩選選是利用特特異抗體與目的基因因表達的抗原產(chǎn)物相互作作用進行篩篩選，特異異性和敏感感性也較高高，尤其適適用于篩選選不為宿主主菌提供任任何選擇標標記的基因因，或者是是已獲得了了該基因編編碼的蛋白白質(zhì)產(chǎn)物的的多克隆或或單克隆抗抗體，用這這些抗體來來檢測目的的基因表達達的產(chǎn)物。。免疫學方方法很多，，如Westernblot，免免疫疫化化學學方方法法、、酶酶聯(lián)聯(lián)免免疫疫吸吸附附劑劑測測定定（（enzymelinkedimmunosorbentassay，，ELISA））、、放放射射免免疫疫沉沉淀淀、、免免疫疫熒熒光光抗抗體體技技術術等等，，可可對目目的的基基因因表表達達的的蛋蛋白白進進行行定定性性，，甚甚至至定定量量檢檢測測?；蛞蚬すこ坛痰牡淖钭罱K終目目的的是是在在一一個個合適適的的系系統(tǒng)統(tǒng)中，，使使外源源基基因因高高效效表表達達，從從而而產(chǎn)產(chǎn)生生有有重重要要價價值值的的蛋白白質(zhì)質(zhì)產(chǎn)品品。。其過過程程包包括括外外源源