色譜法本科生教學(xué)中教學(xué)課件

色譜法本科生教學(xué)中幻燈片PPT本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！色譜法本科生教學(xué)中幻燈片PPT本課件PPT僅供大家學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1.生物化學(xué)常用四大技術(shù)（分光光度法－血糖測(cè)定，蛋白定量分析；色譜法－離子交換色譜和凝膠色譜；電泳法－醋酸纖維薄膜電泳；聚丙烯酰胺凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳；離心－質(zhì)粒DNA的小量快速制備中使用）2.GPT酶活性測(cè)定3.過(guò)氧化氫酶Km值測(cè)定4.酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制5.實(shí)驗(yàn)操作考試6.課堂討論及課堂答疑實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1.生物化學(xué)常用四大技術(shù)（分光光度法－血糖測(cè)定，蛋色譜法色譜法第一節(jié)概述色譜法早在1903年由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特分離植物色素時(shí)采用。他在研究植物葉的色素成分時(shí)，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為色譜法（chromatography)。又稱層析法。第一節(jié)概述色譜法早在1903年由俄國(guó)植物學(xué)家茨第一節(jié)概述石油醚（流動(dòng)相M）碳酸鈣（固定相S）玻璃管（色譜柱）胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素A、B連續(xù)色帶（色譜）植物葉子的石油醚萃取液第一節(jié)概述石油醚（流動(dòng)相M）碳酸鈣（固定相S）玻璃管（第一節(jié)概述在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動(dòng)的一相（固體或液體）稱為固定相

；自上而下運(yùn)動(dòng)的一相（一般是氣體或液體）稱為流動(dòng)相

；裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜柱

。第一節(jié)概述第一節(jié)概述當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。第一節(jié)概述當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)與固定第一節(jié)概述色譜法是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異（吸附力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力等），使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相叫固定相（stationaryphase），另一相流過(guò)此固定相叫做流動(dòng)相（mobilephase）。由于各組分受流動(dòng)相作用產(chǎn)生的推力和受固定相作用產(chǎn)生的阻力的不同，使各組分產(chǎn)生不同的移動(dòng)速度，從而使結(jié)構(gòu)上只有微小差異的各組分得到分離。第一節(jié)概述色譜法是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異（第一節(jié)概述特點(diǎn)：1．具有極高的分辨效力：同系物、同分異構(gòu)體，甚至同位素。2．具有極高的分析效率：HPLC(highperformancethinlayerliquidchromatography)一次僅10分鐘就可完成40個(gè)樣品的點(diǎn)樣和分析工作。3．具有極高靈敏度：樣品組分含量?jī)H數(shù)微克，或不足一個(gè)微克都可進(jìn)行很好的分析。4．操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用廣泛：第一節(jié)概述特點(diǎn)：第一節(jié)概述從不同角度，可將色譜法分類如下：1.按兩相狀態(tài)分類氣體為流動(dòng)相的色譜稱為氣相色譜（GC）

根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC）。第一節(jié)概述從不同角度，可將色譜法分類如下：第一節(jié)概述液體為流動(dòng)相的色譜稱液相色譜（LC）

同理液相色譜亦可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）。第一節(jié)概述液體為流動(dòng)相的色譜稱液相色譜（LC）第一節(jié)概述2.按分離機(jī)理分類利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為分配色譜法。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法，稱為離子交換色譜法。第一節(jié)概述2.按分離機(jī)理分類第一節(jié)概述利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，稱為凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。將具有生物學(xué)活性（如酶、輔酶、抗體等）的配位基，鍵合到載體或基質(zhì)表面形成固定相。利用蛋白質(zhì)或生物大分子與親和色譜固定相配位基的親和力進(jìn)行分離的色譜法，稱為親和色譜法。第一節(jié)概述利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而第一節(jié)概述3.按操作形式不同分類柱色譜法：固定相裝于柱內(nèi)的色譜法。平面色譜法：色譜過(guò)程在固定相構(gòu)成的平面層內(nèi)進(jìn)行的色譜法，包括紙色譜法、薄層色譜法和薄膜色譜法。第一節(jié)概述3.按操作形式不同分類第二節(jié)常用的色譜方法第二節(jié)（一）基本原理：

利用不同的生物大分子的帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑吸附強(qiáng)弱不同，經(jīng)過(guò)強(qiáng)弱不同的洗脫劑進(jìn)行洗脫從而達(dá)到分離目的。一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）（一）基本原理：一、離子交換色譜

（ionexchange離子交換劑：

藉酯化、氧化或醚化等化學(xué)反應(yīng)在瓊脂糖、纖維素或凝膠分子上引入陽(yáng)離子或陰離子基團(tuán)的特殊劑型。當(dāng)離子交換劑帶陽(yáng)離子基團(tuán)時(shí)，可吸附陰離子樣品稱為陰離子交換劑，如DEAE。反之，離子交換劑帶陰離子基團(tuán)時(shí)，可吸附陽(yáng)離子樣品稱之為陽(yáng)離子交換劑，如CM。

一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）離子交換劑：一、離子交換色譜

（ionexchangec一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）陽(yáng)離子交換劑分子中具有酸性基團(tuán)，能和流動(dòng)相中的陽(yáng)離子進(jìn)行交換。例：R—SO3－H++Na+←→R—SO3Na+

+H+陰離子交換劑分子中具有堿性基團(tuán)，能和流動(dòng)相中的陰離子進(jìn)行交換。如：R—NH4＋

OH－+Cl－←→R—NH4+

Cl－+OH－一、離子交換色譜

（ionexchangechromatIonexchanger

Anionexchangerconsistsofaninsolublematrixtowhichchargedgroupshavebeencovalentlybound,thechargedgroupsareassociatedwiththemobilecounter-ions(反離子).Thesecounter-ionscanbereversiblyexchangedwithotherionsofthesamechargewithoutalteringthematrix.Therearetwokindsofionexchangers.IonexchangerAnionexchangerCationexchanger(陽(yáng)離子交換劑)Cationexchangershavepositivelychargedcounter-ionswhichcanbeexchangedwiththecationsinthemobilephase.R—SO3－H++Na+←→R—SO3Na+

+H++++++counter-ionsCationexchanger(陽(yáng)離子交換劑)CAnionexchanger(陰離子交換劑)Anionexchangershavenegetivelychargedcounter-ionswhichcanbeexchangedwiththeanionsinthemobilephase.

R—NH4＋

OH－+Cl－←→R—NH4f+

Cl－+OH－++++++

counterionsAnionexchanger(陰離子交換劑)Anion一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）分離樣品時(shí)，主要依靠增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度或改變酸堿度來(lái)進(jìn)行洗脫。增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度：當(dāng)緩沖液的離子強(qiáng)度增加時(shí)，即增加了它與生物大分子對(duì)交換基團(tuán)競(jìng)爭(zhēng)吸附的能力，把生物大分子置換下來(lái)。改變酸堿度：當(dāng)緩沖液的pH接近生物大分子的等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，從而可被洗脫。一、離子交換色譜

（ionexchangechromat一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）（二）離子交換劑的類型：主要有離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維素、離子交換瓊脂糖和離子交換葡聚糖。常用的離子交換基團(tuán)有:二乙基氨基乙基（DEAE）、羧甲基（CM）、磺酸基等。一、離子交換色譜

（ionexchangechromat一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）（三）洗脫方式：（1）分步洗脫法：選用幾種洗脫能力逐步增強(qiáng)的洗脫液相繼洗脫，適用于各組分對(duì)交換劑親和力比較懸殊的樣品。（2）連續(xù)梯度洗脫法：選用離子強(qiáng)度和pH呈連續(xù)梯度變動(dòng)的洗脫液進(jìn)行洗脫，使洗脫能力持續(xù)增強(qiáng)，適用于各組分與交換劑親和力相近的樣品。一、離子交換色譜

（ionexchangechromat

（四）具體實(shí)驗(yàn)應(yīng)用：實(shí)驗(yàn)五氨基酸的離子交換柱色譜分離（四）具體實(shí)驗(yàn)應(yīng)用：實(shí)驗(yàn)五1．實(shí)驗(yàn)原理:離子交換劑：磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（732型）

分離的氨基酸：天冬氨酸（AsppI=2.97）和賴氨酸（LyspI=9.74）的混合液。洗脫方式：改變洗脫液的pH值在pH=5.3條件下，Lys解離成陽(yáng)離子掛在樹(shù)脂上；Asp解離成陰離子，不能被樹(shù)脂吸附而直接流出色譜柱。在pH=12條件下，Lys解離為陰離子從樹(shù)脂上被交換下來(lái)。1．實(shí)驗(yàn)原理:離子交換劑：磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（732型陽(yáng)離子交換色譜原理示意圖..陽(yáng)離子交換色譜原理示意圖..2．操作步驟：（1）樹(shù)脂的處理（2）裝柱（已作好）（3）平衡（檢查色譜柱有無(wú)裂痕和氣泡），調(diào)流速（10-12滴/分鐘）（4）加樣和洗脫（示教）（5）收集3管（一加樣就開(kāi)始收集，每管

3ml）（6）改換高pH洗脫液收集4-10管2．操作步驟：（1）樹(shù)脂的處理（2）裝柱（已作好）2．操作步驟：（7）測(cè)定（收集管按順序編號(hào)，每管取0.5ml于另一試管，加入1mlpH=5.3洗脫液、0.5ml茚三酮溶液，100oC水浴25min，水冷卻5-10min，加入60%乙醇3ml，搖勻，722型分光光度計(jì)比色，波長(zhǎng)為570nm，空白對(duì)照管為檸檬酸洗脫液1.5ml，茚三酮0.5ml,乙醇3ml）,繪制洗脫曲線（8）色譜柱再生（用pH=5.3洗脫液平衡）。2．操作步驟：（7）測(cè)定（收集管按順序編號(hào)，每管取0.5ml722S型分光光度計(jì)的使用方法（吸光度的測(cè)定）：

1.開(kāi)機(jī)預(yù)熱15min以上。

2.轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選擇鈕，選用所需的波長(zhǎng)。

3.將裝有空白、標(biāo)準(zhǔn)、樣品的比色杯放入比色杯架，使空白管對(duì)準(zhǔn)光路。

4.打開(kāi)樣品室暗箱蓋（光門自動(dòng)關(guān)閉），按0%ADJ鍵，即能自動(dòng)進(jìn)行機(jī)械零點(diǎn)的調(diào)整，數(shù)碼顯示為0.000。

5.蓋好比色杯暗箱蓋（光門自動(dòng)開(kāi)啟），按100%ADJ鍵，即能自動(dòng)進(jìn)行空白零點(diǎn)的調(diào)整，數(shù)碼顯示為100.0。（一次如有誤差可再按一次）

6.按MODE鍵選擇吸光度測(cè)定模式（ABS燈亮），數(shù)碼顯示自動(dòng)轉(zhuǎn)換為吸光度值0.000。

7.拉動(dòng)比色杯架的拉桿，使測(cè)定杯進(jìn)入光路，從數(shù)碼顯示上即可讀出樣品的吸光度8.比色完畢后，關(guān)上電源開(kāi)關(guān)，取出比色杯，將比色杯暗箱蓋好，清洗比色杯并晾干。722S型分光光度計(jì)的使用方法（吸光度的測(cè)定）：二、凝膠色譜

（gelchromatography）（一）基本原理：

凝膠色譜是指混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠作固定相的色譜柱時(shí)，混合物中各種物質(zhì)因分子大小不同而被分離的技術(shù)。二、凝膠色譜

（gelchromatography）（一）二、凝膠色譜

（gelchromatography）凝膠：是指一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，凝膠顆粒直徑一般在0.1-1mm之間。色譜過(guò)程與過(guò)濾相似，故又名凝膠過(guò)濾，其機(jī)理是分子篩效應(yīng)。在洗脫過(guò)程中，分子大小不一的物質(zhì)同時(shí)加入凝膠床，大分子因直徑大于凝膠網(wǎng)孔，在凝膠顆粒間隙流動(dòng)，阻滯小，流程短，先流出色譜柱；小分子因直徑小于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑而進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，受阻滯作用大，流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，后流出色譜柱。二、凝膠色譜

（gelchromatography）凝膠：A280A280A280小分子大分子凝膠色譜原理A280A280A280小分子大分子凝膠色譜原理（二）凝膠種類1．交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex/Dextran）：是由葡聚糖（右旋糖苷）和甘油通過(guò)醚橋相交聯(lián)而成。2．聚丙烯酰胺凝膠：3．瓊脂糖凝膠：4．Superdex凝膠：

（二）凝膠種類1．交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex/De（三）特點(diǎn)1．洗脫條件溫和，不會(huì)引起物質(zhì)變性失活。2．洗脫過(guò)程中不需改變洗脫液成分和種類，凝膠柱可反復(fù)使用。3．實(shí)驗(yàn)具有高度的重復(fù)性，回收樣品幾乎可達(dá)100%，既可用于大樣品制備，也可用于小樣品分析。（三）特點(diǎn)1．洗脫條件溫和，不會(huì)引起物質(zhì)變性失活。（四）應(yīng)用：作為脫鹽工具、高分子溶液的濃縮、用于去除熱源物質(zhì)、用于測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量、用于物質(zhì)的分離提純。（四）應(yīng)用：作為脫鹽工具、高分子溶液的濃縮、用于（五）實(shí)驗(yàn)舉例血紅蛋白與核黃素的凝膠柱色譜分離（五）實(shí)驗(yàn)舉例血紅蛋白與核黃素的1．原理：采用SephadexG-25凝膠柱，分離血紅蛋白和核黃素。血紅蛋白因分子量大，不易進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)網(wǎng)孔，被阻滯在顆粒外，受阻力小，流程短，先流出；核黃素分子量小，易滲透到網(wǎng)孔內(nèi)部，阻力大，流程長(zhǎng)，后流出，從而將二者分離。1．原理：采用SephadexG-25凝膠柱，分離血紅蛋白2．操作步驟：①凝膠處理：②裝柱③平衡④加樣與洗脫⑤收集與測(cè)定2．操作步驟：①凝膠處理：三、實(shí)驗(yàn)安排8:30-9:30講實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟、示教9:30-12:00學(xué)生自己做實(shí)驗(yàn)，2人/組2:00-4:00實(shí)驗(yàn)對(duì)換4:00-5:00結(jié)果分析，書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告三、實(shí)驗(yàn)安排8:30-9:30講實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟、示教色譜法本科生教學(xué)中幻燈片PPT本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！色譜法本科生教學(xué)中幻燈片PPT本課件PPT僅供大家學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1.生物化學(xué)常用四大技術(shù)（分光光度法－血糖測(cè)定，蛋白定量分析；色譜法－離子交換色譜和凝膠色譜；電泳法－醋酸纖維薄膜電泳；聚丙烯酰胺凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳；離心－質(zhì)粒DNA的小量快速制備中使用）2.GPT酶活性測(cè)定3.過(guò)氧化氫酶Km值測(cè)定4.酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制5.實(shí)驗(yàn)操作考試6.課堂討論及課堂答疑實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1.生物化學(xué)常用四大技術(shù)（分光光度法－血糖測(cè)定，蛋色譜法色譜法第一節(jié)概述色譜法早在1903年由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特分離植物色素時(shí)采用。他在研究植物葉的色素成分時(shí)，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為色譜法（chromatography)。又稱層析法。第一節(jié)概述色譜法早在1903年由俄國(guó)植物學(xué)家茨第一節(jié)概述石油醚（流動(dòng)相M）碳酸鈣（固定相S）玻璃管（色譜柱）胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素A、B連續(xù)色帶（色譜）植物葉子的石油醚萃取液第一節(jié)概述石油醚（流動(dòng)相M）碳酸鈣（固定相S）玻璃管（第一節(jié)概述在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動(dòng)的一相（固體或液體）稱為固定相

；自上而下運(yùn)動(dòng)的一相（一般是氣體或液體）稱為流動(dòng)相

；裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜柱

。第一節(jié)概述第一節(jié)概述當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。第一節(jié)概述當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)與固定第一節(jié)概述色譜法是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異（吸附力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力等），使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相叫固定相（stationaryphase），另一相流過(guò)此固定相叫做流動(dòng)相（mobilephase）。由于各組分受流動(dòng)相作用產(chǎn)生的推力和受固定相作用產(chǎn)生的阻力的不同，使各組分產(chǎn)生不同的移動(dòng)速度，從而使結(jié)構(gòu)上只有微小差異的各組分得到分離。第一節(jié)概述色譜法是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異（第一節(jié)概述特點(diǎn)：1．具有極高的分辨效力：同系物、同分異構(gòu)體，甚至同位素。2．具有極高的分析效率：HPLC(highperformancethinlayerliquidchromatography)一次僅10分鐘就可完成40個(gè)樣品的點(diǎn)樣和分析工作。3．具有極高靈敏度：樣品組分含量?jī)H數(shù)微克，或不足一個(gè)微克都可進(jìn)行很好的分析。4．操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用廣泛：第一節(jié)概述特點(diǎn)：第一節(jié)概述從不同角度，可將色譜法分類如下：1.按兩相狀態(tài)分類氣體為流動(dòng)相的色譜稱為氣相色譜（GC）

根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC）。第一節(jié)概述從不同角度，可將色譜法分類如下：第一節(jié)概述液體為流動(dòng)相的色譜稱液相色譜（LC）

同理液相色譜亦可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）。第一節(jié)概述液體為流動(dòng)相的色譜稱液相色譜（LC）第一節(jié)概述2.按分離機(jī)理分類利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為分配色譜法。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法，稱為離子交換色譜法。第一節(jié)概述2.按分離機(jī)理分類第一節(jié)概述利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，稱為凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。將具有生物學(xué)活性（如酶、輔酶、抗體等）的配位基，鍵合到載體或基質(zhì)表面形成固定相。利用蛋白質(zhì)或生物大分子與親和色譜固定相配位基的親和力進(jìn)行分離的色譜法，稱為親和色譜法。第一節(jié)概述利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而第一節(jié)概述3.按操作形式不同分類柱色譜法：固定相裝于柱內(nèi)的色譜法。平面色譜法：色譜過(guò)程在固定相構(gòu)成的平面層內(nèi)進(jìn)行的色譜法，包括紙色譜法、薄層色譜法和薄膜色譜法。第一節(jié)概述3.按操作形式不同分類第二節(jié)常用的色譜方法第二節(jié)（一）基本原理：

利用不同的生物大分子的帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑吸附強(qiáng)弱不同，經(jīng)過(guò)強(qiáng)弱不同的洗脫劑進(jìn)行洗脫從而達(dá)到分離目的。一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）（一）基本原理：一、離子交換色譜

（ionexchange離子交換劑：

藉酯化、氧化或醚化等化學(xué)反應(yīng)在瓊脂糖、纖維素或凝膠分子上引入陽(yáng)離子或陰離子基團(tuán)的特殊劑型。當(dāng)離子交換劑帶陽(yáng)離子基團(tuán)時(shí)，可吸附陰離子樣品稱為陰離子交換劑，如DEAE。反之，離子交換劑帶陰離子基團(tuán)時(shí)，可吸附陽(yáng)離子樣品稱之為陽(yáng)離子交換劑，如CM。

一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）離子交換劑：一、離子交換色譜

（ionexchangec一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）陽(yáng)離子交換劑分子中具有酸性基團(tuán)，能和流動(dòng)相中的陽(yáng)離子進(jìn)行交換。例：R—SO3－H++Na+←→R—SO3Na+

+H+陰離子交換劑分子中具有堿性基團(tuán)，能和流動(dòng)相中的陰離子進(jìn)行交換。如：R—NH4＋

OH－+Cl－←→R—NH4+

Cl－+OH－一、離子交換色譜

（ionexchangechromatIonexchanger

Anionexchangerconsistsofaninsolublematrixtowhichchargedgroupshavebeencovalentlybound,thechargedgroupsareassociatedwiththemobilecounter-ions(反離子).Thesecounter-ionscanbereversiblyexchangedwithotherionsofthesamechargewithoutalteringthematrix.Therearetwokindsofionexchangers.IonexchangerAnionexchangerCationexchanger(陽(yáng)離子交換劑)Cationexchangershavepositivelychargedcounter-ionswhichcanbeexchangedwiththecationsinthemobilephase.R—SO3－H++Na+←→R—SO3Na+

+H++++++counter-ionsCationexchanger(陽(yáng)離子交換劑)CAnionexchanger(陰離子交換劑)Anionexchangershavenegetivelychargedcounter-ionswhichcanbeexchangedwiththeanionsinthemobilephase.

R—NH4＋

OH－+Cl－←→R—NH4f+

Cl－+OH－++++++

counterionsAnionexchanger(陰離子交換劑)Anion一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）分離樣品時(shí)，主要依靠增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度或改變酸堿度來(lái)進(jìn)行洗脫。增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度：當(dāng)緩沖液的離子強(qiáng)度增加時(shí)，即增加了它與生物大分子對(duì)交換基團(tuán)競(jìng)爭(zhēng)吸附的能力，把生物大分子置換下來(lái)。改變酸堿度：當(dāng)緩沖液的pH接近生物大分子的等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，從而可被洗脫。一、離子交換色譜

（ionexchangechromat一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）（二）離子交換劑的類型：主要有離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維素、離子交換瓊脂糖和離子交換葡聚糖。常用的離子交換基團(tuán)有:二乙基氨基乙基（DEAE）、羧甲基（CM）、磺酸基等。一、離子交換色譜

（ionexchangechromat一、離子交換色譜

（ionexchangechromatography）（三）洗脫方式：（1）分步洗脫法：選用幾種洗脫能力逐步增強(qiáng)的洗脫液相繼洗脫，適用于各組分對(duì)交換劑親和力比較懸殊的樣品。（2）連續(xù)梯度洗脫法：選用離子強(qiáng)度和pH呈連續(xù)梯度變動(dòng)的洗脫液進(jìn)行洗脫，使洗脫能力持續(xù)增強(qiáng)，適用于各組分與交換劑親和力相近的樣品。一、離子交換色譜

（ionexchangechromat

（四）具體實(shí)驗(yàn)應(yīng)用：實(shí)驗(yàn)五氨基酸的離子交換柱色譜分離（四）具體實(shí)驗(yàn)應(yīng)用：實(shí)驗(yàn)五1．實(shí)驗(yàn)原理:離子交換劑：磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（732型）

分離的氨基酸：天冬氨酸（AsppI=2.97）和賴氨酸（LyspI=9.74）的混合液。洗脫方式：改變洗脫液的pH值在pH=5.3條件下，Lys解離成陽(yáng)離子掛在樹(shù)脂上；Asp解離成陰離子，不能被樹(shù)脂吸附而直接流出色譜柱。在pH=12條件下，Lys解離為陰離子從樹(shù)脂上被交換下來(lái)。1．實(shí)驗(yàn)原理:離子交換劑：磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（732型陽(yáng)離子交換色譜原理示意圖..陽(yáng)離子交換色譜原理示意圖..2．操作步驟：（1）樹(shù)脂的處理（2）裝柱（已作好）（3）平衡（檢查色譜柱有無(wú)裂痕和氣泡），調(diào)流速（10-12滴/分鐘）（4）加樣和洗脫（示教）（5）收集3管（一加樣就開(kāi)始收集，每管

3ml）（6）改換高pH洗脫液收集4-10管2．操作步驟：（1）樹(shù)脂的處理（2）裝柱（已作好）2．操作步驟：（7）測(cè)定（收集管按順序編號(hào)，每管取0.5ml于另一試管，加入1mlpH=5.3洗脫液、0.5ml茚三酮溶液，100oC水浴25min，水冷卻5-10min，加入60%乙醇3ml，搖勻，722型分光光度計(jì)比色，波長(zhǎng)為570nm，空白對(duì)照管為檸檬酸洗脫液1.5ml，茚三酮0.5ml,乙醇3ml）,繪制洗脫曲線（8）色譜柱再生（用pH=5.3洗脫液平衡）。2．操作步驟：（7）測(cè)定（收集管按順序編號(hào)，每管取0.5ml722S型分光光度計(jì)的使用方法（吸光度的測(cè)定）：

1.開(kāi)機(jī)預(yù)熱15min以上。

2.轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選擇鈕，選用所需的波長(zhǎng)。

3.將裝有空白、標(biāo)準(zhǔn)、樣品的比色杯放入比色杯架，使空白管對(duì)準(zhǔn)光路。

4.打開(kāi)樣品室暗箱蓋（光門自動(dòng)關(guān)閉），按0%ADJ鍵，即能自動(dòng)進(jìn)行機(jī)械零點(diǎn)的調(diào)整，數(shù)碼顯示為0.000。

5.蓋好比色杯暗箱蓋（光門自動(dòng)開(kāi)啟），按100%ADJ鍵，即能自動(dòng)進(jìn)行空白零點(diǎn)的調(diào)整，數(shù)碼顯示為100.0。（一次如有誤差可再按一次）

6.按MODE鍵選擇吸光度測(cè)定模式（ABS