CRISPR-Cas英教學(xué)講解課件

CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介CRISPR-Cas系統(tǒng)作用機(jī)理CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建載體構(gòu)建、導(dǎo)入目的生物或細(xì)胞系、篩選CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不足之處提高打靶特異性的策略小結(jié)CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介1CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介1.1CRISPR-Cas系統(tǒng)的來(lái)源

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種廣泛存在于細(xì)菌與古細(xì)菌中的，由RNA介導(dǎo)的、可遺傳的獲得性免疫系統(tǒng)。1CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介1.2

CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史1987年，日本課題組在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，2002年，正式將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列2005年發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測(cè)細(xì)菌可能通過(guò)CRISPR系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。2007年，Barrangou等首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可能利用CRSPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；2008年，Marraffini等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR系統(tǒng)的功能2013年初，MIT

的研究組首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)人293T細(xì)胞EMX1

和PVALB基因以及小鼠Nero2A細(xì)胞Th基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變。同年Mali利用CRISPR/Cas9在人293T細(xì)胞和K652細(xì)胞基因的靶位點(diǎn)形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制高效介導(dǎo)外源基因定點(diǎn)插入。1.2CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史1.3

CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)CRISPR-CAS系統(tǒng)的組成主要包括:由不連續(xù)的重復(fù)序列R(repeat)與長(zhǎng)度相似的間區(qū)序列S(spacers)間隔排列而成的CRISPR簇，前導(dǎo)序列L(leader)以及一系CRISPR相關(guān)蛋白基因cas。

1.3CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)CRISPR-C

1.4

CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型CRISPR/Cas系統(tǒng)有3種類型，其中，產(chǎn)膿鏈球菌的TypeⅡ型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶，已經(jīng)在人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚(yú)中成功實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)修飾，目前被廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因組編輯中。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)包含3個(gè)主要基因位點(diǎn):編碼相關(guān)蛋白的位點(diǎn)（Cas9、Cas1、Cas2、Csn2），編碼含重復(fù)片段的小RNA位點(diǎn)（CRISPR位點(diǎn)）和1個(gè)輔助小片段RNA(tracrRNA位點(diǎn))。1.4CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型CRISPR/Cas2CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機(jī)理2.1適應(yīng)：間隔序列的獲得當(dāng)外源DNA片段入侵后，CRISPR/Cas識(shí)別入侵的核酸和掃描外源DNA潛在的PAM（NGG序列），將臨近PAM

的序列作為候選protospacer，然后在CRISPR基因座的5'端合成重復(fù)序列，再將該DNA的1個(gè)片段(約20bp)整合到兩個(gè)重復(fù)序列之間，從而使得菌體擁有“記憶”。2CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機(jī)理2.1適應(yīng)：間隔序2.2表達(dá)：表達(dá)并加工CRISPR

CRISPR區(qū)域首先轉(zhuǎn)錄成前體RNA(pre-crRNA)，之后被Cas蛋白剪切成更小的crRNA，即成熟的crRNA，包含1個(gè)間隔序列和部分重復(fù)序列。同時(shí)，tracrRNA

也會(huì)被轉(zhuǎn)錄并和crRNA形成一種雙鏈的RNA結(jié)構(gòu)，再與Cas9蛋白組成具有DNA內(nèi)切酶活性的復(fù)合物。2.2表達(dá)：表達(dá)并加工CRISPR

CRISPR區(qū)2.3干擾:干擾入侵核酸

復(fù)合物在crRNA的引導(dǎo)下，由Cas9

蛋白的核酸結(jié)構(gòu)域?qū)ν庠碊NA分子進(jìn)行切割。

首先RNA/Cas9復(fù)合體沿外源入侵DNA進(jìn)行掃描，當(dāng)遇到PAM序列且DNA序列可與crRNA互補(bǔ)配對(duì)形成一個(gè)R環(huán)時(shí)，Cas9蛋白將分別利用HNH與RuvC結(jié)構(gòu)域?qū)NA的互補(bǔ)鏈與非互補(bǔ)鏈進(jìn)行切割，而形成DNA的雙鏈斷裂。2.3干擾:干擾入侵核酸

復(fù)合物在crRNAPAM（Protospaceradjacentmotif）

在嗜熱鏈球菌中，PAM序列多數(shù)為5‘-NGG，而5’-NAG雖然效率低一些，但也可用于靶DNA的定位，可擴(kuò)展在基因組編輯中靶DNA的選擇范圍。介導(dǎo)切割效率依次為：NGG>NGA>NAG人類基因組中每8bp就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)PAM在Ⅰ型與Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中，自身基因組CRISPR序列的下游無(wú)PAM序列，從而將自身基因組DNA序列與外源DNA序列區(qū)分開(kāi)，避免自我免疫。PAM（ProtospaceradjacentmotifcrRNA

成熟crRNA可分為5’手柄、3’發(fā)卡結(jié)構(gòu)和間隔序列，5’手柄具有保守性，3’發(fā)卡是核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，5’端重復(fù)序列均質(zhì)性較3’端好，其與PAMs一起保護(hù)自身CRISPR序列不被誤切。crRNA末端還含有一段起“種子區(qū)”作用的序列，它決定著尋找靶基因的效率，該區(qū)域僅需1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變即極可能無(wú)法正確識(shí)別靶基因，但在種子區(qū)外發(fā)生少量突變則不容易導(dǎo)致識(shí)別功能失效。CRISPR/Cas9對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別需要PAM(NGG)和靠近PAM的11bp的種子序列完全保守，14bp(PAM+種子序列)序列中的任何一個(gè)堿基突變之后CRISPR/Cas9的切割效率基本降至零。crRNA

成熟crRNA可分為5’手柄、3’發(fā)卡結(jié)構(gòu)和間

tracrRNA(trans-activatingcrRNA)指導(dǎo)RNaseⅢ和Cas9完成前體crRNA的成熟。tracrRNA對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別和切割是必需的，tracrRNA的5'端與成熟的crRNA3'端有部分序列(約13bp)能夠配對(duì)進(jìn)而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)維持crRNA與靶點(diǎn)的配對(duì)可能十分重要。

tracrRNA(trans-activatingcrRCas9蛋白

900-1600個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白

Cas9REC--在REC識(shí)別區(qū)中的一個(gè)富含精氨酸的α-螺旋負(fù)責(zé)與RNA-DNA異源二聚體的3‘端8～12個(gè)核苷酸的結(jié)合HNH結(jié)構(gòu)域--在crRNA互補(bǔ)鏈PAM元件上游3nt處切割。位于HNH結(jié)構(gòu)域的H840A突變體可導(dǎo)致HNH結(jié)構(gòu)域的失活RuvC結(jié)構(gòu)域--在非互補(bǔ)鏈PAM元件上游的3～8nt處切割。位于RuvC結(jié)構(gòu)域中的D10A突變體可導(dǎo)致RuvC結(jié)構(gòu)域的失活。（RuvC則分為3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域:RuvCⅠ位于蛋白的N端，RuvCⅡ/Ⅲ分別位于HNH結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)）PAM結(jié)合區(qū)Cas9蛋白

900-1600個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白

CRISPR-Cas英教學(xué)講解課件3CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建

3.1sgRNA設(shè)計(jì)目前，大多數(shù)研究將與靶DNA互補(bǔ)的crRNA與tracrRNA融合為一條單獨(dú)的引導(dǎo)RNA(singleguideRNA，sgRNA).將sgRNA設(shè)計(jì)為100nt左右，包含位于5'端20nt的DNA互補(bǔ)區(qū)、crRNA以及位于3'端70～80nt的tracrRNA。通常設(shè)計(jì)的sgRNA具有二級(jí)發(fā)卡結(jié)構(gòu)和1條3'端尾，設(shè)計(jì)的sgRNA與靶基因有1～3個(gè)堿基錯(cuò)配并不影響編輯效率，但是，靠近PAM元件的12個(gè)堿基要嚴(yán)格配對(duì).3CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建

3.1sgRcrRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9crRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9目前(2014.10)報(bào)道的CRISPR/Cas系統(tǒng)中使用的gRNA有2種結(jié)構(gòu)，一種是M.Jinek等最先提出的，將一部分重復(fù)序列和一部分tracrRNA的序列直接拼接到一起形成的嵌合RNA結(jié)構(gòu)。目前(2014.10)報(bào)道的CRISPR/Cas系統(tǒng)中使用的另一種與第一種基本相同，只是3‘端更長(zhǎng)，添加了完整的tracrRNA序列.關(guān)于2種結(jié)構(gòu)的優(yōu)劣，麻省理工學(xué)院張峰研究團(tuán)隊(duì)做了細(xì)致的研究，他們發(fā)現(xiàn)，3’端越長(zhǎng)，gRNA表達(dá)豐度越高，相應(yīng)的打靶效率也越高。為了保證足夠的打靶活性，推薦gRNA的3’端長(zhǎng)度不低于67nt為好，而長(zhǎng)度為85nt時(shí)效率最高.另一種與第一種基本相同，只是3‘端更長(zhǎng)，添加了完整的trac在設(shè)計(jì)Guide序列時(shí)，需要特別注意第一個(gè)堿基必須是G，如果您選取的Guide序列的第一個(gè)堿基不是G，需要自行加上一個(gè)G，因?yàn)檫@個(gè)G對(duì)于起始轉(zhuǎn)錄非常重要。在線工具設(shè)計(jì)：麻省理工學(xué)院的CRISPRDesign：/德國(guó)癌癥研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr在設(shè)計(jì)Guide序列時(shí)，需要特別注意第一個(gè)堿基必須是G，如果3.2NLSCas9蛋白來(lái)源于細(xì)菌，因此要讓Cas9蛋白高效地轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)，需要在Cas9蛋白的N端或是C端加上真核細(xì)胞的核定位信號(hào)。對(duì)于添加NLS信號(hào)的位置，目前尚存在爭(zhēng)議。L.CONG的研究發(fā)現(xiàn)，在Cas9蛋白的N端和C端同時(shí)添加NLS信號(hào)最能有效的指導(dǎo)Cas9蛋白入核。而P.Mali等在Cas9蛋白的C端添加１個(gè)NLS信號(hào)構(gòu)建的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在人類的細(xì)胞中最高可以達(dá)到25%的敲除效率，表明在C端添加１個(gè)NLS信號(hào)是足以引導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)入核中的。但是南京大學(xué)的研究人員卻發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在Cas9蛋白的N端添加3個(gè)還是在N端、C端同時(shí)添加SV40核定位信號(hào)均不能使Cas9蛋白進(jìn)入293T細(xì)胞的細(xì)胞核中，只有在N端添加核定位信號(hào)并且在核定位信號(hào)和Cas9蛋白之間加上32個(gè)氨基酸殘基的接頭才能指導(dǎo)Cas9蛋白入核。這些不一致的結(jié)果有可能是由于各個(gè)研究中FLAG標(biāo)簽添加位置的不同引起的，但同時(shí)也說(shuō)明Cas9蛋白在折疊過(guò)程中可能干擾了NLS信號(hào)識(shí)別。3.2NLSCas9蛋白來(lái)源于細(xì)菌，因此要讓Cas9蛋4載體構(gòu)建、導(dǎo)入目的生物或細(xì)胞系、篩選

4.1載體構(gòu)建Cas9蛋白和gRNA的表達(dá)框可以分開(kāi)放到2個(gè)載體上，也可以直接構(gòu)建在同1個(gè)載體上，方便Cas9蛋白和gRNA的協(xié)同表達(dá)。

這2種策略各有好處。比如，構(gòu)建在同一載體上有利于Cas9蛋白和gRNA的協(xié)同表達(dá)，這一點(diǎn)非常適合于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。而分開(kāi)放在2個(gè)表達(dá)載體上則能更方便快速的對(duì)候選的gRNA進(jìn)行打靶效率和脫靶情況的檢測(cè)。構(gòu)建gRNA時(shí)，只要基因的序列連接到gRNA骨架上，或者直接合成帶有靶序列的gRNA再連接到表達(dá)載體上即可。4載體構(gòu)建、導(dǎo)入目的生物或細(xì)胞系、篩選

4.1載體構(gòu)4.2導(dǎo)入目的生物或細(xì)胞系在人工培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞中，可通過(guò)電穿孔(electroporation)、核轉(zhuǎn)染(nucleofection)與脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等方法將非自主復(fù)制的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，使Cas9與sgＲNA可進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。慢性病毒載體(lentiviralvectors)也已用于在人類或小鼠細(xì)胞中組成型表達(dá)Cas9與sgＲNA。體外轉(zhuǎn)錄的ＲNA也可直接注射導(dǎo)入斑馬魚(yú)、果蠅或小鼠的胚胎細(xì)胞中質(zhì)粒越大，成功率越低4.2導(dǎo)入目的生物或細(xì)胞系4.3篩選

將Cas9、引導(dǎo)ＲNA以及一條含有突變位點(diǎn)的靶DNA的同源重組修復(fù)模板共同轉(zhuǎn)化到目的菌株中。若在Cas9對(duì)基因組靶DNA序列產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂后，可利用導(dǎo)入的同源重組修復(fù)模板進(jìn)行DNA修復(fù)，由于修復(fù)模板在識(shí)別互補(bǔ)區(qū)或PAM位點(diǎn)中存在突變位點(diǎn)而不能被Cas9再次切割，因而可存活;而未能進(jìn)行同源重組修復(fù)的基因組則由于Cas9的切割降解，無(wú)法存活。利用該方法可明顯提高基因組編輯后的篩選效率，且在基因組中不殘留篩選標(biāo)記。4.3篩選5CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用基因組編輯技術(shù)是一種可以在基因組水平上對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。這種技術(shù)的原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的。通過(guò)修復(fù)途徑，基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)三種基因組改造，即基因敲除，特異突變的引入和定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因5.1CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組精確編輯技術(shù)5CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用基因組編輯技術(shù)是一種可以例子：基因敲除的實(shí)驗(yàn)過(guò)程1.在靶基因序列中尋找NGG序列獲得其附近20多個(gè)堿基的序列，設(shè)計(jì)出sgRNA并合成該序列2.將sgRNA及cas9基因連入載體3.轉(zhuǎn)化感受態(tài)，質(zhì)粒小提，測(cè)序驗(yàn)證4.細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染5.敲除效果檢測(cè)6.建立穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株例子：基因敲除的實(shí)驗(yàn)過(guò)程1.在靶基因序列中尋找NGG序列獲得5.2CRISPR-Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活

抑制：在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系統(tǒng)中將Cas9中的切割域突變，會(huì)使Cas9蛋白失去對(duì)ＤＮＡ的切割活性，但不影響其與ＤＮＡ結(jié)合的能力。這種失去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名為DeadＣas9。將ｄCas9與gRNA在細(xì)胞中共表達(dá)，則gRNA可以介導(dǎo)ｄCas9蛋白與ＤＮＡ結(jié)合。如果ｄCas9結(jié)合到靶基因的閱讀框內(nèi)，可阻斷RNA聚合酶的延伸作用；如果ｄCas9結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域則可阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始.5.2CRISPR-Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活

抑制激活：將dCas蛋白與具有轉(zhuǎn)錄激活的蛋白質(zhì)功能域融合則可構(gòu)建具有轉(zhuǎn)錄激活活性的CRISPR-on系統(tǒng)。CRISPR轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)的靶序列位置對(duì)激活效率有重要影響。當(dāng)靶序列與啟動(dòng)子的距離合適時(shí)，激活效率較高；靶序列處于啟動(dòng)子上游較遠(yuǎn)位置激活效率相對(duì)下降；當(dāng)靶序列與啟動(dòng)子距離過(guò)近，或處于開(kāi)放閱讀框內(nèi)時(shí)則會(huì)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。也就是說(shuō)使用相同的CRISPR-on系統(tǒng)，不同的crRNA既可以對(duì)靶基因激活，也可以抑制靶基因表達(dá)。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活因子可通過(guò)將ｄCas9與單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活子ＶＰ16結(jié)合獲得。CRISPR-Cas英教學(xué)講解課件5.3單切口酶Cas9也可以改造成為單切口酶,只被一個(gè)Cas9n（Cas9n為D10A突變的突變體，只能切割與sgRNA直接互補(bǔ)的DNA單鏈）切割產(chǎn)生的單鏈缺口會(huì)被高保真性的堿基切除修復(fù)途徑(baseexcisionrepair,BER)修復(fù)，不會(huì)在基因組DNA上造成突變。5.3單切口酶Cas9也可以改造成為單切口酶,只被一個(gè)Ca5.4利用多個(gè)引導(dǎo)RNA序列可同時(shí)進(jìn)行基因組上多個(gè)不同位點(diǎn)的編輯.5.5將CRISPR/Cas9技術(shù)與成像技術(shù)結(jié)合，利用dCas9的基因組定位功能，使小鼠或人的基因組的元件可視化，用于監(jiān)測(cè)活體中各元件的動(dòng)態(tài)變化基因組規(guī)模的功能篩選、特定染色體位點(diǎn)的標(biāo)記等5.4利用多個(gè)引導(dǎo)RNA序列可同時(shí)進(jìn)行基因組上多6CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不足之處脫靶效應(yīng)：早期研究認(rèn)為crRNA的間隔序列(spacer)與外源DNA的靶位點(diǎn)完全互補(bǔ)配對(duì)對(duì)于切割是必需的，后來(lái)的研究證明spacer與protospacer部分互補(bǔ)配對(duì)時(shí)切割也可以發(fā)生。CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)打靶位點(diǎn)距離PAM區(qū)較遠(yuǎn)的5’區(qū)的識(shí)別特異性較低，當(dāng)出現(xiàn)幾個(gè)堿基的錯(cuò)配時(shí)，Cas9蛋白仍然會(huì)將序列切開(kāi)，造成脫靶效應(yīng)。

V.Pattanayak等的研究顯示，CRISPR/Cas復(fù)合體的濃度也與脫靶效應(yīng)緊密相關(guān)。當(dāng)CRISPR/Cas復(fù)合體的濃度較高時(shí)，即使錯(cuò)配發(fā)生在PAM區(qū)內(nèi)部或者靠近PAM區(qū)的位置，DNA切割也仍然會(huì)進(jìn)行，而這種現(xiàn)象在低濃度時(shí)則不會(huì)發(fā)生。6CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不足之處脫靶效應(yīng)：早期研究局限性：

CRISPR/Cas9對(duì)目的序列的識(shí)別與結(jié)合必須有PAM的存在。這就使得該系統(tǒng)對(duì)基因組的靶向識(shí)別位點(diǎn)被限制在平均每8個(gè)堿基一個(gè)位點(diǎn)。局限性：?jiǎn)栴}CRISPR/Cas9來(lái)源于細(xì)菌，它是否會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或個(gè)體產(chǎn)生毒性或是否會(huì)誘發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或個(gè)體的免疫反應(yīng)？CRISPR/Cas系統(tǒng)是依賴ＤＮＡ復(fù)制或者轉(zhuǎn)錄過(guò)程將ＤＮＡ解螺旋還是本身就具有ＤＮＡ解旋能力？CRISPR/Cas9系統(tǒng)如何導(dǎo)入受體并保證CRISPR系統(tǒng)的組份能準(zhǔn)確地到達(dá)DNA靶序列？如何突破PAM序列的限制、如何建立對(duì)Cas9特異性(脫靶效應(yīng))的全面評(píng)價(jià)體系、如何構(gòu)建不同物種中可通用的Cas9與sgRNA導(dǎo)入與表達(dá)系統(tǒng)以及如何更有效的激活同源重組修復(fù)等。問(wèn)題7提高打靶特異性的策略降低sgRNA與Cas9的濃度。這一方法的效果還有待討論。有研究表明該方法可顯著降低脫靶突變/打靶突變的比例，但也有研究稱該方法將同時(shí)降低脫靶突變與打靶突變的發(fā)生。利用Cas9的切口酶突變體產(chǎn)生DNA單鏈斷裂。因?yàn)榕cDNA雙鏈斷裂相比，DNA單鏈斷裂將誘導(dǎo)保真性更高的堿基切除修復(fù)。7提高打靶特異性的策略降低sgRNA與Cas9的濃度。麻省理工學(xué)院張峰實(shí)驗(yàn)室的一種提高CRISPR/Cas系統(tǒng)特異性的新思路。他們開(kāi)創(chuàng)性的提出，將突變的只能在雙鏈DNA上形成缺口的Cas9n蛋白（Cas9n為D10A突變的突變體，只能切割與sgRNA直接互補(bǔ)的DNA單鏈）配對(duì)使用，同時(shí)切割雙鏈DNA的正負(fù)鏈，形成５′端突出的雙鏈缺口。這一方法可以降低脫靶率50～1500倍，同時(shí)不影響基因敲除效率。麻省理工學(xué)院張峰實(shí)驗(yàn)室的一種提高CRISPR/Cas系統(tǒng)特異8小結(jié)設(shè)計(jì)和構(gòu)建方法簡(jiǎn)單快捷，成本低廉?；蚓庉嬓蕛?yōu)于ＺＦＮｓ和ＴＡＬＥＮｓ系統(tǒng)?？赏瑫r(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的打靶?？梢苑奖憧旖莸母脑鞛榛虮磉_(dá)調(diào)控工具。

8小結(jié)設(shè)計(jì)和構(gòu)建方法簡(jiǎn)單快捷，成本低廉。CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介CRISPR-Cas系統(tǒng)作用機(jī)理CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建載體構(gòu)建、導(dǎo)入目的生物或細(xì)胞系、篩選CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不足之處提高打靶特異性的策略小結(jié)CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介1CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介1.1CRISPR-Cas系統(tǒng)的來(lái)源

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種廣泛存在于細(xì)菌與古細(xì)菌中的，由RNA介導(dǎo)的、可遺傳的獲得性免疫系統(tǒng)。1CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介1.2

CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史1987年，日本課題組在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，2002年，正式將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列2005年發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測(cè)細(xì)菌可能通過(guò)CRISPR系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。2007年，Barrangou等首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可能利用CRSPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；2008年，Marraffini等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR系統(tǒng)的功能2013年初，MIT

的研究組首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)人293T細(xì)胞EMX1

和PVALB基因以及小鼠Nero2A細(xì)胞Th基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變。同年Mali利用CRISPR/Cas9在人293T細(xì)胞和K652細(xì)胞基因的靶位點(diǎn)形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制高效介導(dǎo)外源基因定點(diǎn)插入。1.2CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史1.3

CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)CRISPR-CAS系統(tǒng)的組成主要包括:由不連續(xù)的重復(fù)序列R(repeat)與長(zhǎng)度相似的間區(qū)序列S(spacers)間隔排列而成的CRISPR簇，前導(dǎo)序列L(leader)以及一系CRISPR相關(guān)蛋白基因cas。

1.3CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)CRISPR-C

1.4

CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型CRISPR/Cas系統(tǒng)有3種類型，其中，產(chǎn)膿鏈球菌的TypeⅡ型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶，已經(jīng)在人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚(yú)中成功實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)修飾，目前被廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因組編輯中。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)包含3個(gè)主要基因位點(diǎn):編碼相關(guān)蛋白的位點(diǎn)（Cas9、Cas1、Cas2、Csn2），編碼含重復(fù)片段的小RNA位點(diǎn)（CRISPR位點(diǎn)）和1個(gè)輔助小片段RNA(tracrRNA位點(diǎn))。1.4CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型CRISPR/Cas2CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機(jī)理2.1適應(yīng)：間隔序列的獲得當(dāng)外源DNA片段入侵后，CRISPR/Cas識(shí)別入侵的核酸和掃描外源DNA潛在的PAM（NGG序列），將臨近PAM

的序列作為候選protospacer，然后在CRISPR基因座的5'端合成重復(fù)序列，再將該DNA的1個(gè)片段(約20bp)整合到兩個(gè)重復(fù)序列之間，從而使得菌體擁有“記憶”。2CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機(jī)理2.1適應(yīng)：間隔序2.2表達(dá)：表達(dá)并加工CRISPR

CRISPR區(qū)域首先轉(zhuǎn)錄成前體RNA(pre-crRNA)，之后被Cas蛋白剪切成更小的crRNA，即成熟的crRNA，包含1個(gè)間隔序列和部分重復(fù)序列。同時(shí)，tracrRNA

也會(huì)被轉(zhuǎn)錄并和crRNA形成一種雙鏈的RNA結(jié)構(gòu)，再與Cas9蛋白組成具有DNA內(nèi)切酶活性的復(fù)合物。2.2表達(dá)：表達(dá)并加工CRISPR

CRISPR區(qū)2.3干擾:干擾入侵核酸

復(fù)合物在crRNA的引導(dǎo)下，由Cas9

蛋白的核酸結(jié)構(gòu)域?qū)ν庠碊NA分子進(jìn)行切割。

首先RNA/Cas9復(fù)合體沿外源入侵DNA進(jìn)行掃描，當(dāng)遇到PAM序列且DNA序列可與crRNA互補(bǔ)配對(duì)形成一個(gè)R環(huán)時(shí)，Cas9蛋白將分別利用HNH與RuvC結(jié)構(gòu)域?qū)NA的互補(bǔ)鏈與非互補(bǔ)鏈進(jìn)行切割，而形成DNA的雙鏈斷裂。2.3干擾:干擾入侵核酸

復(fù)合物在crRNAPAM（Protospaceradjacentmotif）

在嗜熱鏈球菌中，PAM序列多數(shù)為5‘-NGG，而5’-NAG雖然效率低一些，但也可用于靶DNA的定位，可擴(kuò)展在基因組編輯中靶DNA的選擇范圍。介導(dǎo)切割效率依次為：NGG>NGA>NAG人類基因組中每8bp就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)PAM在Ⅰ型與Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中，自身基因組CRISPR序列的下游無(wú)PAM序列，從而將自身基因組DNA序列與外源DNA序列區(qū)分開(kāi)，避免自我免疫。PAM（ProtospaceradjacentmotifcrRNA

成熟crRNA可分為5’手柄、3’發(fā)卡結(jié)構(gòu)和間隔序列，5’手柄具有保守性，3’發(fā)卡是核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，5’端重復(fù)序列均質(zhì)性較3’端好，其與PAMs一起保護(hù)自身CRISPR序列不被誤切。crRNA末端還含有一段起“種子區(qū)”作用的序列，它決定著尋找靶基因的效率，該區(qū)域僅需1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變即極可能無(wú)法正確識(shí)別靶基因，但在種子區(qū)外發(fā)生少量突變則不容易導(dǎo)致識(shí)別功能失效。CRISPR/Cas9對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別需要PAM(NGG)和靠近PAM的11bp的種子序列完全保守，14bp(PAM+種子序列)序列中的任何一個(gè)堿基突變之后CRISPR/Cas9的切割效率基本降至零。crRNA

成熟crRNA可分為5’手柄、3’發(fā)卡結(jié)構(gòu)和間

tracrRNA(trans-activatingcrRNA)指導(dǎo)RNaseⅢ和Cas9完成前體crRNA的成熟。tracrRNA對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別和切割是必需的，tracrRNA的5'端與成熟的crRNA3'端有部分序列(約13bp)能夠配對(duì)進(jìn)而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)維持crRNA與靶點(diǎn)的配對(duì)可能十分重要。

tracrRNA(trans-activatingcrRCas9蛋白

900-1600個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白

Cas9REC--在REC識(shí)別區(qū)中的一個(gè)富含精氨酸的α-螺旋負(fù)責(zé)與RNA-DNA異源二聚體的3‘端8～12個(gè)核苷酸的結(jié)合HNH結(jié)構(gòu)域--在crRNA互補(bǔ)鏈PAM元件上游3nt處切割。位于HNH結(jié)構(gòu)域的H840A突變體可導(dǎo)致HNH結(jié)構(gòu)域的失活RuvC結(jié)構(gòu)域--在非互補(bǔ)鏈PAM元件上游的3～8nt處切割。位于RuvC結(jié)構(gòu)域中的D10A突變體可導(dǎo)致RuvC結(jié)構(gòu)域的失活。（RuvC則分為3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域:RuvCⅠ位于蛋白的N端，RuvCⅡ/Ⅲ分別位于HNH結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)）PAM結(jié)合區(qū)Cas9蛋白

900-1600個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白

CRISPR-Cas英教學(xué)講解課件3CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建

3.1sgRNA設(shè)計(jì)目前，大多數(shù)研究將與靶DNA互補(bǔ)的crRNA與tracrRNA融合為一條單獨(dú)的引導(dǎo)RNA(singleguideRNA，sgRNA).將sgRNA設(shè)計(jì)為100nt左右，包含位于5'端20nt的DNA互補(bǔ)區(qū)、crRNA以及位于3'端70～80nt的tracrRNA。通常設(shè)計(jì)的sgRNA具有二級(jí)發(fā)卡結(jié)構(gòu)和1條3'端尾，設(shè)計(jì)的sgRNA與靶基因有1～3個(gè)堿基錯(cuò)配并不影響編輯效率，但是，靠近PAM元件的12個(gè)堿基要嚴(yán)格配對(duì).3CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建

3.1sgRcrRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9crRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9目前(2014.10)報(bào)道的CRISPR/Cas系統(tǒng)中使用的gRNA有2種結(jié)構(gòu)，一種是M.Jinek等最先提出的，將一部分重復(fù)序列和一部分tracrRNA的序列直接拼接到一起形成的嵌合RNA結(jié)構(gòu)。目前(2014.10)報(bào)道的CRISPR/Cas系統(tǒng)中使用的另一種與第一種基本相同，只是3‘端更長(zhǎng)，添加了完整的tracrRNA序列.關(guān)于2種結(jié)構(gòu)的優(yōu)劣，麻省理工學(xué)院張峰研究團(tuán)隊(duì)做了細(xì)致的研究，他們發(fā)現(xiàn)，3’端越長(zhǎng)，gRNA表達(dá)豐度越高，相應(yīng)的打靶效率也越高。為了保證足夠的打靶活性，推薦gRNA的3’端長(zhǎng)度不低于67nt為好，而長(zhǎng)度為85nt時(shí)效率最高.另一種與第一種基本相同，只是3‘端更長(zhǎng)，添加了完整的trac在設(shè)計(jì)Guide序列時(shí)，需要特別注意第一個(gè)堿基必須是G，如果您選取的Guide序列的第一個(gè)堿基不是G，需要自行加上一個(gè)G，因?yàn)檫@個(gè)G對(duì)于起始轉(zhuǎn)錄非常重要。在線工具設(shè)計(jì)：麻省理工學(xué)院的CRISPRDesign：/德國(guó)癌癥研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr在設(shè)計(jì)Guide序列時(shí)，需要特別注意第一個(gè)堿基必須是G，如果3.2NLSCas9蛋白來(lái)源于細(xì)菌，因此要讓Cas9蛋白高效地轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)，需要在Cas9蛋白的N端或是C端加上真核細(xì)胞的核定位信號(hào)。對(duì)于添加NLS信號(hào)的位置，目前尚存在爭(zhēng)議。L.CONG的研究發(fā)現(xiàn)，在Cas9蛋白的N端和C端同時(shí)添加NLS信號(hào)最能有效的指導(dǎo)Cas9蛋白入核。而P.Mali等在Cas9蛋白的C端添加１個(gè)NLS信號(hào)構(gòu)建的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在人類的細(xì)胞中最高可以達(dá)到25%的敲除效率，表明在C端添加１個(gè)NLS信號(hào)是足以引導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)入核中的。但是南京大學(xué)的研究人員卻發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在Cas9蛋白的N端添加3個(gè)還是在N端、C端同時(shí)添加SV40核定位信號(hào)均不能使Cas9蛋白進(jìn)入293T細(xì)胞的細(xì)胞核中，只有在N端添加核定位信號(hào)并且在核定位信號(hào)和Cas9蛋白之間加上32個(gè)氨基酸殘基的接頭才能指導(dǎo)Cas9蛋白入核。這些不一致的結(jié)果有可能是由于各個(gè)研究中FLAG標(biāo)簽添加位置的不同引起的，但同時(shí)也說(shuō)明Cas9蛋白在折疊過(guò)程中可能干擾了NLS信號(hào)識(shí)別。3.2NLSCas9蛋白來(lái)源于細(xì)菌，因此要讓Cas9蛋4載體構(gòu)建、導(dǎo)入目的生物或細(xì)胞系、篩選

4.1載體構(gòu)建Cas9蛋白和gRNA的表達(dá)框可以分開(kāi)放到2個(gè)載體上，也可以直接構(gòu)建在同1個(gè)載體上，方便Cas9蛋白和gRNA的協(xié)同表達(dá)。

這2種策略各有好處。比如，構(gòu)建在同一載體上有利于Cas9蛋白和gRNA的協(xié)同表達(dá)，這一點(diǎn)非常適合于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。而分開(kāi)放在2個(gè)表達(dá)載體上則能更方便快速的對(duì)候選的gRNA進(jìn)行打靶效率和脫靶情況的檢測(cè)。構(gòu)建gRNA時(shí)，只要基因的序列連接到gRNA骨架上，或者直接合成帶有靶序列的gRNA再連接到表達(dá)載體上即可。4載體構(gòu)建、導(dǎo)入目的生物或細(xì)胞系、篩選

4.1載體構(gòu)4.2導(dǎo)入目的生物或細(xì)胞系在人工培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞中，可通過(guò)電穿孔(electroporation)、核轉(zhuǎn)染(nucleofection)與脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等方法將非自主復(fù)制的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，使Cas9與sgＲNA可進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。慢性病毒載體(lentiviralvectors)也已用于在人類或小鼠細(xì)胞中組成型表達(dá)Cas9與sgＲNA。體外轉(zhuǎn)錄的ＲNA也可直接注射導(dǎo)入斑馬魚(yú)、果蠅或小鼠的胚胎細(xì)胞中質(zhì)粒越大，成功率越低4.2導(dǎo)入目的生物或細(xì)胞系4.3篩選

將Cas9、引導(dǎo)ＲNA以及一條含有突變位點(diǎn)的靶DNA的同源重組修復(fù)模板共同轉(zhuǎn)化到目的菌株中。若在Cas9對(duì)基因組靶DNA序列產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂后，可利用導(dǎo)入的同源重組修復(fù)模板進(jìn)行DNA修復(fù)，由于修復(fù)模板在識(shí)別互補(bǔ)區(qū)或PAM位點(diǎn)中存在突變位點(diǎn)而不能被Cas9再次切割，因而可存活;而未能進(jìn)行同源重組修復(fù)的基因組則由于Cas9的切割降解，無(wú)法存活。利用該方法可明顯提高基因組編輯后的篩選效率，且在基因組中不殘留篩選標(biāo)記。4.3篩選5CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用基因組編輯技術(shù)是一種可以在基因組水平上對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。這種技術(shù)的原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的。通過(guò)修復(fù)途徑，基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)三種基因組改造，即基因敲除，特異突變的引入和定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因5.1CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組精確編輯技術(shù)5CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用基因組編輯技術(shù)是一種可以例子：基因敲除的實(shí)驗(yàn)過(guò)程1.在靶基因序列中尋找NGG序列獲得其附近20多個(gè)堿基的序列，設(shè)計(jì)出sgRNA并合成該序列2.將sgRNA及cas9基因連入載體3.轉(zhuǎn)化感受態(tài)，質(zhì)粒小提，測(cè)序驗(yàn)證4.細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染5.敲除效果檢測(cè)6.建立穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株例子：基因敲除的實(shí)驗(yàn)過(guò)程1.在靶基因序列中尋找NGG序列獲得5.2CRISPR-Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活

抑制：在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系統(tǒng)中將Cas9中的切割域突變，會(huì)使Cas9蛋白失去對(duì)ＤＮＡ的切割活性，但不影響其與ＤＮＡ結(jié)合的能力。這種失去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名為DeadＣas9。將ｄCas9與gRNA在細(xì)胞中共表達(dá)，則gRNA可以介導(dǎo)ｄCas9蛋白與ＤＮＡ結(jié)合。如果ｄCas9結(jié)合到靶基因的閱讀框內(nèi)，可阻斷RNA聚合酶的延伸作用；如果ｄCas9結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域則可阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始.5.2CRISPR-Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活

抑制激活：將dCas蛋白與具有轉(zhuǎn)錄激活的蛋白質(zhì)功能域融合則可構(gòu)建具有轉(zhuǎn)錄激活活性的CRISPR-on系統(tǒng)。CRISPR轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)的靶序列位置對(duì)激活效率有重要影響。當(dāng)靶序列與啟動(dòng)子的距離合適時(shí)，激活效率較高；靶序列處于啟動(dòng)子上游較遠(yuǎn)位置激活效率相對(duì)下降；當(dāng)靶序列與啟動(dòng)子距離過(guò)近，或處于開(kāi)放閱讀框內(nèi)時(shí)則會(huì)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。也就是說(shuō)使用相同的CRISPR-on系統(tǒng)，不同的crRNA既可以對(duì)靶基因激活，也可以抑制靶基因表達(dá)。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活因子可通過(guò)將ｄCas9與單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活子ＶＰ16結(jié)合獲得。CRISPR-Cas英教學(xué)講解課件5.3單切口酶C