分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一.質(zhì)粒提取與瓊脂糖電泳目的掌握質(zhì)粒的提取方法及原理；瓊脂糖凝膠電泳及觀察評判方法。原理質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。硅基質(zhì)樹脂在高鹽狀態(tài)下，特異性吸附DNA，而在低鹽狀態(tài)下，DNA被洗脫下來。帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動稱為電泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。在pH值為8.0~8.3時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器、試劑（1）菌種：大腸桿菌DH5α（2）分子生物學(xué)試劑10mg/ml溴化乙錠（EB）:按10mg/ml濃度將EB溶于去離子水中，劇烈攪拌，完全溶解后，室溫下避光保存。50×TAE電泳緩沖液:24.2gTris5.71g冰乙酸10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）加去離子水至100ml，室溫保存?zhèn)溆?，工作液?×TAE。6×上樣緩沖液:0.25%溴酚藍(lán)40%（W/V）蔗糖水溶液1%瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖溶于100ml1×TAE電泳緩沖液中，溶化后加入5μl10mg/mlEB貯存液，使凝膠中EB終濃度達(dá)到0.5mg/ml。(4)細(xì)菌培養(yǎng)基含抗生素的LB培養(yǎng)液酵母提取物5g蛋白胨10gNaCl10g瓊脂15～20g水1000mL，必要時(shí)，調(diào)整至pH7.4～7.6將上述培養(yǎng)基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分鐘高壓蒸汽滅菌。滅菌后的LB培養(yǎng)基可室溫保存，使用前加入相應(yīng)抗生素。含抗生素的LB培養(yǎng)基應(yīng)放入4OC冰箱內(nèi)暫存。含抗生素的LB瓊脂平板LB培養(yǎng)基中加15g瓊脂，以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分鐘高壓蒸汽滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至40-42OC，加入相應(yīng)抗生素，搖動培養(yǎng)基，使抗生素與培養(yǎng)基充分混勻。將培養(yǎng)基倒入細(xì)菌培養(yǎng)皿，凝固后倒置。6小時(shí)后放入4OC冰箱備用。（5）PromegaEastepTM質(zhì)粒小提試劑盒（6）其它準(zhǔn)備物品 1mL、100μL、10μL加樣器及其槍頭、盒子；滅菌的1.5mLeppendorf管；試管及試管塞：小型離心機(jī)；無水乙醇。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）大腸桿菌的制備從新鮮LB瓊脂平板（含抗生素）上挑出單個(gè)菌落接種于5mlLB培養(yǎng)液中（含相同的抗生素），于37°C搖床培養(yǎng)過夜（12-16小時(shí)）。（二）大腸桿菌的裂解1.將1-5ml(高拷貝數(shù)的質(zhì)粒)或10ml（低拷貝數(shù)的質(zhì)粒）的細(xì)菌培養(yǎng)物于10,000×g離心5分鐘。棄去上清液，并吸去剩余培養(yǎng)液。2.加入250μl細(xì)胞懸浮液，震蕩或吹打以充分混勻細(xì)胞。充分混勻細(xì)胞非常關(guān)鍵。如果懸浮的細(xì)胞不在離心管中，則將其轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管中。注意：以下操作步驟不要震蕩以避免切斷染色體DNA。3.加入250μl細(xì)胞裂解液，顛倒離心管4次以充分混勻（不要震蕩）。室溫孵育細(xì)胞懸浮液至澄清，孵育時(shí)間大約需要1-5分鐘。注意：在加入堿性蛋白酶溶液（第4步）之前觀察裂解液是否變?yōu)槌吻宸浅Ｖ匾?。但孵育時(shí)間不要超過5分鐘。4.加入10μl堿性蛋白酶溶液并顛倒離心管4次以充分混勻。于室溫孵育5分鐘。堿性蛋白酶能夠滅活核酸酶及其它在細(xì)菌裂解過程中釋放出的能夠影響分離質(zhì)粒質(zhì)量的蛋白。堿性蛋白酶孵育時(shí)間不要超過5分鐘，否則質(zhì)粒DNA會出現(xiàn)缺口。5.加入350μl中和溶液并迅速顛倒離心管4次以充分混勻（不要震蕩）。6.于室溫將細(xì)胞裂解液以最大速度（約14,000×g）離心10分鐘。取澄清裂解液進(jìn)行以下步驟的質(zhì)粒DNA的分離及純化。(三)質(zhì)粒DNA的純化7．準(zhǔn)備好微量純化柱和收集管。一個(gè)樣品需要一個(gè)微量純化柱和一個(gè)收集管，將微量純化柱插入收集管中。8．用移液槍將澄清裂解液（大約850μl）轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的微量純化柱中，避免碰到沉淀物。注意：如果轉(zhuǎn)移過程中不小心帶入了白色沉淀物，需將微量純化柱中的內(nèi)含物重新轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌1.5ml離心管中并以最大速度離心5-10分鐘。再將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至先前使用的微量純化柱中。微量純化柱可以重復(fù)使用，但僅限于同一樣品。9．于室溫，14000×g離心1分鐘，將微量純化柱從收集管上移開，棄去收集管中的液體后重新裝回到收集管上。10．加入750μl柱清洗液（已加95%乙醇）。11．于室溫，14000×g離心1分鐘，清空收集管。12．加入250μl柱清洗液重復(fù)清洗步聚（已加95%乙醇）。13．于室溫，14000×g離心2分鐘。14．從收集管上取下微量純化柱并轉(zhuǎn)移至無菌1.5ml離心管中。操作時(shí)需小心，在轉(zhuǎn)移微量純化柱到離心管中時(shí)切勿帶入清洗液。如果微量純化柱上粘有柱清洗液，則需要重新以最大速度離心1分鐘，以甩掉柱清洗液后再轉(zhuǎn)移到離心管中。15．加入100μl無核酸酶水，于室溫，14000×g離心1分鐘。不加緩沖液的DNA水溶液可保存在—20°C或更低的溫度下。如果需要將DNA保存于TE緩沖液中，則在100μlDNA中加入11μl10×TE緩沖液，加了TE緩沖液中的DNA保存在4°C是穩(wěn)定的。（四）瓊脂糖凝膠電泳1．將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺上；2．調(diào)整好梳子的高度；3．稱取0.24g瓊脂糖于30ml1×TAE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至45-50oC時(shí)加入核酸染料，倒入制膠板中；4．凝膠凝固后，小心拔去梳子；5．將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，6．將電泳樣品與6Xloadingbuffer混合后將樣品依次加入加樣孔中；打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動；7．電泳完成后切斷電源，取出凝膠，置于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果，并照相記錄。五、結(jié)果分析電泳檢測可看到幾條帶?提取EGFP質(zhì)粒的純度分析。六、思考與分析1．提取質(zhì)粒分子量如何確定?能通過與核酸分子量Marker比較確定質(zhì)粒分子量嗎?為什么?2．質(zhì)粒提取過程中各試劑的主要作用。感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化一．目的掌握制備和保存大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法掌握質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的技術(shù)方法二．原理體外連接的DNA重組分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能大量增殖。為了提高受體菌攝取外源DNA的能力，提高轉(zhuǎn)化效率以獲得更多的轉(zhuǎn)化子，人們摸索出了不同的方法處理細(xì)菌，使其處于感受態(tài)。Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并黏附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上。當(dāng)42℃熱刺激短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器、試劑（1）菌種：DH5a（2）分子生物學(xué)試劑0.1MCaCl250%甘油(3)細(xì)菌培養(yǎng)基含抗生素的LB培養(yǎng)液酵母提取物5g蛋白胨10gNaCl10g水1000mLpH7.4～7.6（4）其它準(zhǔn)備物品 1mL、100μL、10μL加樣器及其槍頭、盒子；滅菌的1.5mLeppendorf管；試管及試管塞：小型離心機(jī)；搖床；細(xì)菌培養(yǎng)箱。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）大腸桿菌DH5a感受態(tài)的制備前夜接種受體菌（DH5a），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜（約16小時(shí)）；取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(shí)（250-300rpm），搖至細(xì)菌OD為0.4-0.6；將0.1MCaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作吸取培養(yǎng)好的菌液至50ml離心管中，在冰上冷卻30分鐘；4℃下3000g冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入10ml預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；4℃下3000g冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入1ml預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加0.5ml50%甘油超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）（二）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250mlLB固體培養(yǎng)基中加入適量抗生素，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；每100μl感受態(tài)細(xì)胞加入約20ng質(zhì)粒DNA，以商品化感受態(tài)細(xì)胞為陽性對照，感受態(tài)中不加質(zhì)粒DNA為陰性對照；DNA（陽性對照）及不加入任何DNA（陰性對照），用移液器輕輕吸打均勻，在冰上放置30分鐘；熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置3分鐘；復(fù)蘇：每管加400mlLB培養(yǎng)基，在37℃搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇；布皿：取適當(dāng)體積均勻涂布于含有抗生素的LB平板；培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)12－16小時(shí)即可觀察到白色菌落。五、結(jié)果分析菌落計(jì)數(shù)；觀察菌落大小，均一性。六、思考與分析1．影響感受態(tài)效率的因素是什么？2．質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，37℃搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇的目的是什么？多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）一．目的掌握PCR擴(kuò)增原理及方法；鞏固瓊脂糖凝膠電泳及觀察評判方法。二．原理 PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR全過程每一步的轉(zhuǎn)換是通過溫度的改變來控制的。需要重復(fù)進(jìn)行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸３個(gè)步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。DNA模板變性：模板雙鏈DNA?單鏈DNA，94℃。退火：引物＋單鏈DNA?雜交鏈，引物的Tm值。引物的延伸：溫度至70℃左右，TaqDNA聚合酶以４種dNTP為原料，以目的DNA為模板，催化以引物３’末端為起點(diǎn)的5三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器、試劑（1）基因：HIV-1P24（2）分子生物學(xué)試劑酶類：TaqDNA聚合酶，25mmol/LMgCl2，10×PCRBuffer，dNTPs。核酸Marker：DL2000DNAMarker（3）所用溶液的配制50×TAE電泳緩沖液:24.2gTris5.71g冰乙酸10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）加去離子水至100ml，室溫保存?zhèn)溆?，工作液?×TAE。6×上樣緩沖液:0.25%溴酚藍(lán)40%（W/V）蔗糖水溶液1%瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖溶于100ml1×TAE電泳緩沖液中，溶化后加入5μl10mg/mlEB貯存液，使凝膠中EB終濃度達(dá)到0.5mg/ml。（4）PCR特異性引物上游引物：CA-NdeI-F: GCCGCATATGCCGATCGTGCAGAACCTCCAGGGG下游引物：CA-BamHI-R: GCGCGGATCCTTACAAAACTCTTGCTTTATGGCCGGG（5）其它準(zhǔn)備物品 1mL、100μL、10μL移液器器及其槍頭、盒子；滅菌的1.5mLeppendorf管；PCR管。四、實(shí)驗(yàn)步驟DNA的PCR擴(kuò)增：在一個(gè)50l反應(yīng)體系中依次加入如下組分：H2O37.5l10×PCRbuffer5上游引物PW1（25pmol/L）1下游引物PW2（25pmol/L）1dNTPs（2.5mmol/L）4lDNA模板1lTaqDNA聚合酶（5U/l）0.5所有組分充分混勻后瞬時(shí)離心，確保反應(yīng)混合物位于PCR管底部。在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；最后72五、結(jié)果分析PCR產(chǎn)物大小，效率，是否有非特異性反應(yīng)。六、思考與分析1．哪些因素影響PCR擴(kuò)增效率？2．最后72℃目的基因克隆及鑒定一．目的學(xué)習(xí)目的基因克隆方法；學(xué)習(xí)陽性克隆篩選方法二．原理 選擇克隆載體多克隆位點(diǎn)上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，識別特定位點(diǎn)并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處理后在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實(shí)現(xiàn)外源片段的克隆。粘性末端連接，DNA片段兩端的互補(bǔ)堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內(nèi)切酶消化DNA可產(chǎn)生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復(fù)原樣，有些限制性內(nèi)切酶雖然識別不同順序，卻能產(chǎn)生相同末端。平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產(chǎn)生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器、試劑（1）基因：HIV-1P24PCR產(chǎn)物，載體：pET-11a（2）分子生物學(xué)試劑酶類：限制性內(nèi)切酶及緩沖液（Buffer）：NdeI,BamHIDNA連接酶(T4DNAligase)核酸Marker：DL2000DNAMarker（3）所用溶液的配制50×TAE電泳緩沖液:24.2gTris5.71g冰乙酸10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）加去離子水至100ml，室溫保存?zhèn)溆?，工作液?×TAE。6×上樣緩沖液:0.25%溴酚藍(lán)40%（W/V）蔗糖水溶液1%瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖溶于100ml1×TAE電泳緩沖液中，溶化后加入5μl10mg/mlEB貯存液，使凝膠中EB終濃度達(dá)到0.5mg/ml。（4）凝膠回收試劑盒（5）其它準(zhǔn)備物品 1mL、200μL、50μL、10μL加樣器及其槍頭、盒子；滅菌的1.5mLeppendorf管；PCR管；刀片；金屬浴，離心機(jī)。四、實(shí)驗(yàn)步驟1．PCR產(chǎn)物回收瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物在藍(lán)光透射儀下將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分），放入干凈的離心管（自備）中，稱取重量。注意：若膠塊的體積過大，可將膠塊切成碎塊；后續(xù)步驟按照說明書（如下）進(jìn)行2．限制性內(nèi)切酶消化回收所得PCR產(chǎn)物和載體（酶切）（1）適應(yīng)溫度：37℃50ul體系：Ncol：2ulBamHI：2ul10xBuffer4：5ulDNA片段：41ul放入37℃金屬浴酶切2.5小時(shí)。（2）所得酶切產(chǎn)物按上述純化方法再次純化回收。3．將DNA片段與載體連接：(1)20ul體系：10xBuffer：2ulQuick連接酶：1ul載體：2ulDNA片段：14ul插入片段與載體DNA摩爾比1:3-1:6,25℃靜置10分鐘。4．連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecoil.TransSetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，載體DNA酶切片段作為陰性對照，載體DNA為陽性對照。5．陽性克隆的鑒定：配置PCR反應(yīng)體系，并分裝入7個(gè)PCR管，確保每管中反應(yīng)體系為：H2O18.