畢赤酵母表達(dá)知識(shí)

很好，需要好好研究一下原文地址：畢赤酵母表達(dá)知識(shí)01轉(zhuǎn)載于丁香作者：思時(shí)爾非配制500XBIOTINstocksolution（0.02%）有這么3種方案:1、懶人是將Biotin直接溶在去離子水中，放過(guò)夜，基本就能溶；2、急性子是將溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加熱，溫度不能高于50度。D—生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在畢赤酵母代謝過(guò)程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養(yǎng)基中一般可以不單獨(dú)添加，因?yàn)閅NB中、酵母粉、蛋白月東中均含有一定量的生物素，但是做高密度發(fā)酵還是必須要添加的。有幾個(gè)比較迷惑的問(wèn)題請(qǐng)教大家：（很典型的小問(wèn)題）1、制感受態(tài)細(xì)胞，OD多少比較好？pyrimidine戰(zhàn)友的方法：取1mlGS115過(guò)夜培養(yǎng)物（OD約6-10）分裝到1.5mlEP管中。說(shuō)明書(shū)還有一些文獻(xiàn)是說(shuō)在1.3左右效率高，再高了效率會(huì)很低2、關(guān)于高效轉(zhuǎn)化法，文獻(xiàn)說(shuō)用（LiAc）,而invitrogen的說(shuō)明書(shū)說(shuō)轉(zhuǎn)化畢赤酵母用（LiAc）沒(méi)用，要用LiCl。LithiumacetatedoesnotworkwithPichiapastoris.Useonlylithiumchloride.3、YNB到底能高溫滅么？有的說(shuō)能有的說(shuō)不能。過(guò)濾滅菌的怎么操作？我是把濾器裝好膜綁到瓶口用紗布蓋上，報(bào)紙包上，瓶蓋放燒杯里單滅。然后把配好的溶液用注射器一點(diǎn)點(diǎn)推進(jìn)去。4、葡萄糖為什么在YPD里一起滅顏色很深，單滅則不會(huì)。該115度還是121度滅？網(wǎng)上搜了下，都有人用！5、電轉(zhuǎn)化參數(shù)用400歐還是200歐？有的用400,有的還專(zhuān)門(mén)說(shuō)不是用400。都是從園里看到的！電擊參數(shù)：1.5KV,25uF,200歐姆（不是400）6、電轉(zhuǎn)后，在MD平板上長(zhǎng)的應(yīng)該就是整合了目的基因的重組子了吧？如果不想篩高拷貝的，是否PCR驗(yàn)證一下即可？網(wǎng)友的回答：ynb最好不滅菌，我是0.22um過(guò)濾處理的。invitrogen手冊(cè)上可以滅菌的。glucose和含氮化合物在一起容易產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。顏色很深的話(huà)，基本不能使用了。想請(qǐng)教下關(guān)于菌種保存的方法。我現(xiàn)在是采用斜面保存的方法，但感覺(jué)每次接菌都要打開(kāi)斜面，而且每次的接菌量難免會(huì)有不少的誤差，所以很想問(wèn)一下大家都是怎么保存菌種的，特別是甘油菌的保存方法。我一般吸取300ul的菌液到滅菌的EP管然后加等體積的甘油，混勻.防于一20度.保存長(zhǎng)的話(huà)最好放一80度冰箱一般OD是2-6,過(guò)夜菌在篩選高表達(dá)菌種中，我一般有一下步驟，很很多人做的不太一樣，和說(shuō)明書(shū)也有點(diǎn)差異，如下：每次轉(zhuǎn)化前，均用多種酶切，BlgII/salI/sacI同時(shí)切，然后轉(zhuǎn)化時(shí)，用GS115/KM71/KM71H同時(shí)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的條件也和大家一樣，即1.5/25/200但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，轉(zhuǎn)化后涂MM及YPD+0.25G,長(zhǎng)出菌落后，即進(jìn)行大規(guī)模的表達(dá)試驗(yàn)，這里我要重點(diǎn)說(shuō)明的是，我直接用YPD表達(dá)的，一般48h后即進(jìn)行大量的SDS鑒定，鑒定時(shí)，樣品不用濃縮，直接上樣，看到目的帶后再做PCR，測(cè)序。我已用這兒方法做了好幾個(gè)基因出來(lái)。關(guān)于酵母表達(dá)時(shí)BMMY的PH值我也覺(jué)得PH7.0-7.5要比PH6.0好，我表達(dá)的兩個(gè)蛋白都是這樣，表達(dá)量要高一些。但也不能一概而論，不同目標(biāo)蛋白表達(dá)最適pH不一樣，不過(guò)表達(dá)的pH值最好要遠(yuǎn)離目標(biāo)蛋白的pI。像目前國(guó)內(nèi)外做的最好的rHSA，最適pH大概5-6左右，也有不同的報(bào)道，可能和工藝頁(yè)有關(guān)系。而我自己正在做的一個(gè)蛋白pH4較好，3、5表達(dá)時(shí)上清電泳目標(biāo)帶大量減少，雜帶大量增多。求助一下很棘手的問(wèn)題，大家在酵母表達(dá)過(guò)程中控制目標(biāo)蛋白降解方面有什么高招，小弟最近為這個(gè)有點(diǎn)兒焦頭爛額。我試過(guò)用酸消解酪蛋白，可是作用并不是很明顯。不知道兄臺(tái)是胞內(nèi)表達(dá)還是胞外表達(dá)，如果是分泌表達(dá)，目標(biāo)蛋白確實(shí)容易被降解。你可以嘗試以下幾種辦法：1、盡可能降低培養(yǎng)液的pH值減少酶活，酵母生長(zhǎng)pH值比較廣，4?7都可以試一下；2、多試幾種蛋白添加劑，充當(dāng)酶解底物；3、摸索最適下罐（搖瓶也一樣），寧可少表達(dá)點(diǎn)也別給降解光了。實(shí)在沒(méi)辦法，只好換菌株或做pcr突變酶切位點(diǎn)（當(dāng)然不能影響表達(dá)和蛋白活性）。SeveralstrategieshavebeenreportedaseffectiveinminimizingtheproteolyticinstabilityofspecificforeignproteinssecretedintotheP.pastorisculturemedium.Thefirstisaddingtotheculturemediumofamino-acidrichsupplementsuchaspeptoneorcasaminoacid,whichreduceproductdegradationpossiblybyactingasexecesssubstratesforoneormoreproblemproteases.ThesecondstrategytominimizeproteolyticdegradationistooptimizetheculturepHbetweenpH3.0andpH7.0.Thethirdstrategyinvolveselevatingthelevelofammoniumintheculturebrothadequately,whichisexplainedbythehypothesisthatporteaseactivityisinducedundernitrogenstarvation.Theforthstrategyislettheculturetemperature28deginsteadof30deg.如何優(yōu)化密碼子來(lái)提高蛋白表達(dá)量，具體考慮哪些因素（肯定不是單純的全部置換為使用頻率高的密碼子吧)看有些文獻(xiàn)優(yōu)化后的密碼子有些都是使用頻率不高的，實(shí)在很困惑.有沒(méi)有做過(guò)這方面的，急切的想得到你的指導(dǎo)，收取一定的費(fèi)用也可以。謝謝了，我在上海。密碼子改造對(duì)提高表達(dá)量只有有限的作用。影響外源蛋白在Pichia中表達(dá)水平的限速步驟(rate-limitingfactors)很多。涉及到轉(zhuǎn)錄，翻譯，蛋白在ER和Golgi的合成和折疊，以及分泌信號(hào)肽定位和切割，蛋白修飾等很多方面(H.Hohenblum,BiotechnologyandBioenginering,2004,85:367-374)。關(guān)鍵是根據(jù)你要表達(dá)的蛋白性質(zhì)以及DNA序列特性來(lái)推測(cè)(！)哪個(gè)步驟是關(guān)鍵的限速步驟。實(shí)際上，很多分泌表達(dá)的蛋白，蛋白在￡日中合成和折疊以及信號(hào)肽的切割是關(guān)鍵步驟?，F(xiàn)象是很多錯(cuò)誤折疊的蛋白在胞內(nèi)聚集和降解。密碼子作為限速步驟很多時(shí)候體現(xiàn)在某些蛋白由于高AT含量或者其他因素轉(zhuǎn)錄提前終止，這方面文獻(xiàn)在NCBI上有一些。我用Pichia酵母分泌表達(dá)兩個(gè)不同的蛋白，結(jié)果WesternBlot的結(jié)果顯示，兩個(gè)蛋白均比理論分子量少了20k左右。難道都是被發(fā)酵液中的蛋白酶降解了？大家碰到過(guò)這樣的情況嗎？如果是少了20K左右，肯定要考慮酶解的可能了.你的目的蛋白一級(jí)序列是否有Pichia酵母的Kex2酶降解位點(diǎn).我現(xiàn)在做的蛋白就有這種情況，但是是降解產(chǎn)物和目的蛋白共存，有的蛋白幸免遇難用BglII、SalI、SacI酶切的區(qū)別是什么？我是想做蛋白表達(dá)，用BglII后轉(zhuǎn)化行么？它們?nèi)齻€(gè)是不是哪個(gè)可以用了？BglII好像能把質(zhì)粒切成兩段，與其它兩種線(xiàn)性化方法比較，較易生成muts型的轉(zhuǎn)化子，當(dāng)然比例也是少。SalI、SacI酶切基本只能產(chǎn)生mut+型的轉(zhuǎn)化子，我看文獻(xiàn)介紹，后者的轉(zhuǎn)化效率比前者要高。我用前者線(xiàn)性化的，感受態(tài)也是用常規(guī)方法，沒(méi)有DTTLiCl什么的，板子也是長(zhǎng)得滿(mǎn)滿(mǎn)的。哪位有畢赤酵母上罐的一些無(wú)機(jī)培養(yǎng)基配方能提供參考！謝謝！畢赤酵母基因組DNAPCR怎么也p不出來(lái)，質(zhì)粒和線(xiàn)性化后的質(zhì)粒都能P出來(lái)，但是電轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母GS115后怎么也p不出來(lái)，不知怎么了？以前做的都是小菜一碟呀，那位戰(zhàn)友有這方面的經(jīng)驗(yàn)??？是不菌株有問(wèn)題??？懇求指點(diǎn)一下！非常感謝！電轉(zhuǎn)化后涂在MD平板上的么？應(yīng)該大部分都是陽(yáng)性克隆，可能是你提基因組的方法有問(wèn)題，以前有戰(zhàn)友介紹過(guò)菌落PCR的方法，我剛試過(guò)，效果非常非常好。2.2kb的片段非常清楚。退火溫度我用的56度1min，72度2min，35個(gè)循環(huán)。挑取單菌落均勻涂抹于管底，開(kāi)蓋在微波爐中檔加熱1min,-80°C5min，再加熱一次，然后加入20ul水，取1ul作為PCR模板。他本來(lái)說(shuō)離心取上清為模板，我就直接取的。非常非常好用，一般的方法提基因組，比如煮凍煮法等，很難P出2.2kb的AOX1基因而這個(gè)方法就能，還非常明顯。你翻一下前兩頁(yè)吧，我還把自己的圖貼出來(lái)了。選5‘a(chǎn)ox和3’aox這兩個(gè)引物，這樣還能判斷你的轉(zhuǎn)化子是mut+或muts型的。跑出兩條來(lái)說(shuō)明是mut+，其中一條2.2kb的就是aox1基因。這里不涉及aox2，建議你去invitrogen網(wǎng)站下一本multicopypichiaexpressionmanual,看一遍就很清楚了。MD平板上的陽(yáng)性克隆應(yīng)該比例很大的，我覺(jué)得3個(gè)就至少有一個(gè)是。萬(wàn)事都沒(méi)那么覺(jué)對(duì)的，在整合時(shí)，可能僅His4基因整合入了酵母基因組，所以也能生長(zhǎng)，但無(wú)目的基因。請(qǐng)教幾個(gè)問(wèn)題鑒定重組時(shí)候，我煮凍煮方法獲取酵母基因組作為模板，用目的基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果有些產(chǎn)物很強(qiáng)，有些很弱，為什么？是否存在這樣情況，線(xiàn)性化載體進(jìn)入酵母內(nèi)，沒(méi)有進(jìn)入核內(nèi)進(jìn)行重組，或者進(jìn)入核內(nèi)，僅僅黏附在酵母基因組上，沒(méi)有發(fā)生重組呢？如果有這個(gè)情況，該如何區(qū)別？用燒瓶搖菌的轉(zhuǎn)速對(duì)表達(dá)有什么影響，聽(tīng)說(shuō)過(guò)高轉(zhuǎn)速使酵母總處于分裂增殖，而表達(dá)低？大家大規(guī)模發(fā)酵的步驟是怎么樣的，能提供一個(gè)方案嗎？關(guān)于PCR的問(wèn)題，我覺(jué)得你的模板差異大嗎？我做很多次PCR鑒定，發(fā)覺(jué)模板量的差別對(duì)PCR的結(jié)果會(huì)有非常大的影響。不過(guò)我做的PCR鑒定，基本上都是用AOX1引物P的，倒是沒(méi)用過(guò)目的基因引物。搖瓶的問(wèn)題我也說(shuō)不出來(lái)，因?yàn)槲业侥壳盀橹苟紱](méi)做出分泌性表達(dá)來(lái)，汗啊……（都在胞內(nèi)了）速度我都是按照Protocol上的推薦速度搖的，一般都是250rpm以上。我做的時(shí)候使用蝸牛酶消化0.5h，然后沸水浴15min，12000g離心3min，取1ul做模板即可。再問(wèn)個(gè)有關(guān)GAP質(zhì)粒表達(dá)的問(wèn)題。小量搖瓶表達(dá)的時(shí)候需要保證氧通量而使用雙層紗布包住瓶口嗎？還是直接用牛皮紙包住就行了？一般說(shuō)來(lái)，小瓶發(fā)酵的時(shí)候只需要用牛皮紙包住瓶口就可以了，搖床的速度不要過(guò)快，那樣會(huì)使得通氣量不夠，小瓶發(fā)酵時(shí)由于不添加消泡劑所以應(yīng)該避免搖速過(guò)快而引起得泡沫。泡沫得產(chǎn)生直接影響到通氣的效果。我們?cè)谧龃笠?guī)模發(fā)酵時(shí)才用紗布將發(fā)酵罐的餓通氣口都包住，小瓶發(fā)酵，那么做得話(huà)，可能會(huì)導(dǎo)致污染，因?yàn)榻湍甘情L(zhǎng)得比較慢的。這個(gè)想法可以阿鹽濃度對(duì)表達(dá)的影響我想有個(gè)問(wèn)題，緩沖液是起緩沖作用的，濃度低了影響緩沖效果，濃度高了抑制菌生長(zhǎng)？可以做不同pH的比較試驗(yàn)，再加上其他的因素，比如轉(zhuǎn)速，所加培養(yǎng)基的量（通氣量），甲醇量等做個(gè)正交設(shè)計(jì)，學(xué)了統(tǒng)計(jì)，就是不會(huì)用阿，呵呵pH和甲醇濃度我之前都有嘗試過(guò)。轉(zhuǎn)速啥的沒(méi)做過(guò)。濃度也是偶然想到的，所以想嘗試下。我的目的基因序列中有一個(gè)AAAATT,不知道這個(gè)序列是否會(huì)影響我的目的蛋白的表達(dá)，心里沒(méi)有譜，希望能有高手指點(diǎn)。應(yīng)該不會(huì)，現(xiàn)在鑒定出來(lái)的導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止的序列只有HIVgp120蛋白上一段序列包含TTTTATA。如果不怕麻煩，做一下Northern鑒定，或者直接突變掉一兩個(gè)堿基。酵母發(fā)酵兩三天后有些菌體發(fā)紅，是怎么回事啊是突變還是真菌污染呢我的最近也出現(xiàn)這樣情況，是否真的是污染呢？我的最近也出現(xiàn)這樣情況，是否真的是污染呢？個(gè)人認(rèn)為是老化了試過(guò)同一批轉(zhuǎn)化的克隆，有些克隆在培養(yǎng)幾天后就轉(zhuǎn)粉紅，但多數(shù)克隆沒(méi)有轉(zhuǎn)變，聽(tīng)說(shuō)是培養(yǎng)的代數(shù)多了，酵母的某個(gè)酶發(fā)生突變回纖夫兄：你的目的基因是1.7kb，有沒(méi)有加493bp左右的載體序列？你有沒(méi)有做一個(gè)空載體的轉(zhuǎn)化？應(yīng)該是500bp左右，這樣你的帶也在2.2kb左右，呵呵分不清了，可以用a-factor3‘a(chǎn)ox來(lái)擴(kuò)，這樣好像增加196pPIC9K:9276bpAOX1基因?yàn)?.2kb以GS115基因組為模板，5’AOX1/3’AOX1為引物，將擴(kuò)出2.2kb的AOX1基因。以a-factor/3’AOX1為引物，將不能擴(kuò)出任何片段。以整合了pPIC9K的GS115基因組為模板，5’AOX1/3’AOX1為引物，將擴(kuò)出2.2kb的AOX1基因以及pPIC9K載體上的493bp,以a-factor/3’AOX1為引物，將擴(kuò)出pPIC9K載體上的196bp。另外求助以下幾個(gè)問(wèn)題：1、BCA法測(cè)酵母上清總蛋白含量（BMMY）可以么？詳細(xì)的見(jiàn)下面的帖子，請(qǐng)?jiān)诖速N回復(fù)，謝謝。BCA法測(cè)酵母上清蛋白濃度的問(wèn)題我做的時(shí)候是把上清稀釋了20倍，然后才落在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi)，蛋白的量是6ug吧（標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍是0-10ug，是每孔的蛋白量，不是濃度）那樣，也就是說(shuō)稀釋20倍后的上清濃度是6ug除以20ul（96孔板測(cè)得，每孔加20ul樣品）未稀釋的上清就是6ug/ul,每升就是6g,我的蛋白跑SDS,占上清的80%,那我蛋白的量豈不達(dá)到克級(jí)了！而通過(guò)SDS判斷，30多mg左右吧，這是怎么回事呢？請(qǐng)問(wèn)是否有干擾？就是BMMY培養(yǎng)上清阿添加了1%的酪蛋白氨基酸，會(huì)影響么？/bbs/post/view?bid=65&id=5990019&tpg=1&ppg=1&sty=1#60086212、用軟件分析的SDS光密度，是否與其蛋白濃度成正比？如果一條帶是另一個(gè)帶的3倍，是否蛋白量就是它的3倍？但我測(cè)其蛋白濃度，卻相差不是很多？3、電泳看到我的蛋白占上清的絕大多數(shù)，70%以上吧，但上親和柱，流出液的吸收都在5000mAU,好像大部分都流出了阿，我流速1ml/min，柱子是5ml的，絕對(duì)沒(méi)有過(guò)載，因?yàn)橄疵摃r(shí)可以看到，我的蛋白才從頂端下來(lái)，也就利用了1/10的柱子不到。這是怎么回事呢？是否也與BCA法測(cè)蛋白濃度達(dá)到g級(jí)有關(guān)呢？我用Lowry法測(cè)定的BMMY培養(yǎng)基中總蛋白濃度約200—300mg/L,使用的是Sigma的試劑盒，不過(guò)沒(méi)有加1%酪蛋白氨基酸，我看過(guò)的文獻(xiàn)BMMY培養(yǎng)基上清總蛋白濃度一般這個(gè)范圍。BCA法應(yīng)該也可以，但是6g/L的總蛋白濃度似乎太高，不過(guò)也有可能，因?yàn)?升培養(yǎng)基你加了10g酪蛋白氨基酸。另外你絕對(duì)不能根據(jù)你所謂的SDS的蛋白含量來(lái)計(jì)算你的蛋白表達(dá)量，實(shí)際值應(yīng)該要小很多很多倍，酵母粉、蛋白月東和酪蛋白中那么多的蛋白降解片段和小肽等，電泳上是看不出來(lái)的，你過(guò)柱時(shí)光吸收值5000mAU,這就說(shuō)明了5000mAU絕大部分是BMMY培養(yǎng)基中的雜蛋白。感謝husiyi兄出來(lái)給我解答！我也不知為什么BCA法測(cè)出來(lái)這么高，我用TCA法將上清沉淀后，跑電泳，后來(lái)見(jiàn)蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)上說(shuō)用TCA法沉淀上清能去除干擾物質(zhì)，我就測(cè)了下TCA沉淀后的蛋白濃度，經(jīng)過(guò)換算，是153mg/L。TCA法應(yīng)該不沉淀小肽吧？我記得以前做空載體對(duì)照的誘導(dǎo)表達(dá)，好像沉淀不出東西。那我該如何估算我目的蛋白的表達(dá)量呢？我見(jiàn)過(guò)都是用SDS分析目的蛋白占上清總蛋白的比例阿，然后根據(jù)上清總蛋白推算。標(biāo)準(zhǔn)的方法該是什么樣呢？SDS上顯示不出小肽，顯示的只是分泌的蛋白，這樣的話(huà)推算也該比較準(zhǔn)的吧？我的GS115宿主放在-80°C凍存有兩年多了，最近拿出來(lái)做了感受態(tài)做轉(zhuǎn)化，用的是LiCl法，載體是pPIC9，按照推薦的量最后鋪板，生長(zhǎng)48h后RDB板上密密麻麻一層，設(shè)陰性對(duì)照同樣也長(zhǎng)了一層。我覺(jué)得可能是GS115的組氨酸缺陷標(biāo)記丟失了，于是用RDB&RDBH板篩選（這兩個(gè)板我沒(méi)配錯(cuò)可以確定），結(jié)果挑了16個(gè)單菌落化版在RDB板上也均能生長(zhǎng)，我不知道是不是全部?jī)龃娴腉S115均已丟失標(biāo)記，大家有遇到過(guò)這種情況嘛？能給我一些建議？我在兩年前做過(guò)一批酵母轉(zhuǎn)化，用此方法均很順利的就挑出來(lái)陽(yáng)性克隆，那個(gè)時(shí)候宿主是剛剛和別人討來(lái)的應(yīng)該是篩選過(guò)的。其他試劑我都重新配過(guò)了應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題。組氨酸缺陷標(biāo)記丟失不太可能因?yàn)镚S115菌株組氨酸基因本身就是整合在基因上組的保種菌株搞混倒有可能，說(shuō)不定是一個(gè)你以前的轉(zhuǎn)化菌株"原始單克隆菌重復(fù)生長(zhǎng)"是這個(gè)意思：?jiǎn)慰寺【鷵u起來(lái)再涂板的話(huà)，也會(huì)長(zhǎng)出許多個(gè)，它們其實(shí)是一種，這對(duì)于以后篩選多拷貝重組子來(lái)說(shuō)增加了無(wú)謂的困難。sooow，你好！你說(shuō)的方法我看到了，正在嘗試，只是煮了煮，沒(méi)有液氮處理，擴(kuò)了兩次，可能是我挑菌后用無(wú)菌去離子水稀釋的濃度不對(duì)，或是其它原因，還沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)，我會(huì)繼續(xù)摸索條件的。husiyi你說(shuō)的方法在Invitrogen手冊(cè)上是用96孔板，小孔液體培養(yǎng)的，我看過(guò)外文也有在電轉(zhuǎn)化之后，將轉(zhuǎn)化子直接涂不同G418濃度的YPDS平板（不是涂MD平板），我還沒(méi)有試過(guò)這種方法，我現(xiàn)在是要篩選MD板上長(zhǎng)出的HIS+重組子，我覺(jué)得這個(gè)方法不合適，還是對(duì)"原始單克隆菌重復(fù)生長(zhǎng)"有顧慮。因?yàn)檎n題是以應(yīng)用為主的，必須為后面的高產(chǎn)著想。用極少量的菌涂YPD-G418板，濃度提高，我會(huì)嘗試的。謝謝你們依我看過(guò)的文獻(xiàn)和我們這邊表達(dá)的至少十幾個(gè)不同類(lèi)型的蛋白來(lái)看高拷貝對(duì)應(yīng)高表達(dá)在99%的情況下是瞎扯，尤其對(duì)分泌表達(dá)的蛋白來(lái)說(shuō)決定蛋白分泌表達(dá)水平的一個(gè)重要因素是蛋白在胞內(nèi)正確折疊和信號(hào)肽分泌處理過(guò)程，很多蛋白表達(dá)量太低基本上都是由于這個(gè)問(wèn)題酵母對(duì)二硫鍵的加工能力有一定局限性，所以二硫鍵含量較多的蛋白，以及一些很大的蛋白表達(dá)不是很好我個(gè)人認(rèn)為1^板結(jié)合G418-YP。板篩選的主要作用是利用兩個(gè)標(biāo)記進(jìn)行“雙保險(xiǎn)”篩選，保證挑選的克隆基本是整合了目的基因的陽(yáng)性克隆，但是不代表重組蛋白一定會(huì)有表達(dá)影響蛋白分泌表達(dá)水平的因素有很多，如:蛋白本身性質(zhì)、基因劑量（拷貝數(shù)）、啟動(dòng)子類(lèi)型、信號(hào)肽種類(lèi)、細(xì)胞內(nèi)蛋白折疊能力、蛋白降解以及培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)起始菌體濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等等。這些從DNA、轉(zhuǎn)錄、翻譯到翻譯后加工水平的各種因素都可以說(shuō)是蛋白高水平分泌表達(dá)的必要條件，不是充分條件。在起始條件下，可能某一因素是限制條件，如基因劑量。你提高了基因拷貝數(shù)，表達(dá)有所提高。提高到一定水平，細(xì)胞內(nèi)蛋白折疊能力又成為了限制因素。加入分子伴侶提高了折疊能力，表達(dá)提高了，這時(shí)蛋白降解問(wèn)題又出來(lái)了。所以具體蛋白要具體分析。能找到蛋白表達(dá)水平的特定限制因素那就是水平。就單一強(qiáng)調(diào)某一因素而不結(jié)合具體表達(dá)目標(biāo)情況，那都是片面的。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)包括：1尋找新的啟動(dòng)子、信號(hào)肽和篩選標(biāo)志；2蛋白折疊、聚合和降解；3表達(dá)蛋白糖基化；4表達(dá)全抗體、膜蛋白及富含二硫鍵蛋白；5基礎(chǔ)研究包括過(guò)氧化物酶體、基因組測(cè)序（已完成，正注釋?zhuān)?。哎！我的?wèn)題解決了?。。。。?！冷丙酮造成的鹽共沉淀，不是蛋白沉淀?。。。?！看來(lái)我的分泌表達(dá)量是太少了，做了半年了，哎我該如何優(yōu)化表達(dá)條件，提高表達(dá)量呢？？我半年的工作時(shí)間呀我也碰到了類(lèi)似問(wèn)題。請(qǐng)問(wèn)，你如何知道是“冷丙酮造成的鹽共沉淀”呢？蛋白沉淀為絮狀,鹽沉淀呈片狀晶體；我用tca沉淀做了對(duì)照，沉淀兩很少，在有丙酮不預(yù)熱沉淀會(huì)很少，不過(guò)還是鹽沉淀.就是這樣了！Casaminoacid中文名叫什么呢？能加熱滅菌嗎？酸水解酪素，可以加熱滅菌。沒(méi)有問(wèn)題。1、采用pyrimidine兄弟推薦的畢赤酵母高效轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方案，方法附后.果然每個(gè)MD板子上長(zhǎng)了上千個(gè)克隆.但是洗滌菌體后，稀釋200倍涂G418板子，在2~4mg的G418上都沒(méi)有生長(zhǎng).相反，上次每個(gè)MD板子上只長(zhǎng)了30個(gè)左右克隆，在在2~4mg的G418上都有生長(zhǎng).大家知道什么原因嗎？2、在G418板子上長(zhǎng)出的克隆，大家都用什么辦法，簡(jiǎn)捷而又準(zhǔn)確地知道蛋白是否表達(dá)了呢?是否PCR鑒定正確的克隆，都能表達(dá)呢？對(duì)于能用抗體檢測(cè)的表達(dá)產(chǎn)物，用westernblot法，可以直接檢測(cè)電轉(zhuǎn)化后MD板上生長(zhǎng)出來(lái)的HIS+轉(zhuǎn)化子，方法就是在BMMY平板上，覆上NC膜（無(wú)菌），用牙簽將菌落點(diǎn)到膜上，培養(yǎng)幾天，期間往平板蓋上補(bǔ)加甲醇，因?yàn)槭堑怪玫?，甲醇揮發(fā)可以補(bǔ)充培養(yǎng)里的甲醇消耗.到時(shí)取出NC膜，檢測(cè)，通過(guò)顯色圈位置與大小，就可初步判斷是否表達(dá)與表達(dá)量的多少.另外的情況，就是沒(méi)有抗體可用的.遇到上千個(gè)重組子要篩選的話(huà)，真的很頭疼，看到很多發(fā)表的文獻(xiàn)上，用G418濃度梯度，從最小的0.25mg/mL,0.5mg/mL,4mg/mL.操作條件和檢測(cè)效果真的有這么理想么？？？假若1000個(gè)重組子里有一個(gè)是抗4mg/mL的多拷貝，其他都無(wú)抗性，這一個(gè)重組子也會(huì)增值，可能在每個(gè)濃度梯度的板上都會(huì)長(zhǎng)，在4mg/mL的板上也可能會(huì)長(zhǎng)出好多個(gè)，結(jié)果做花了這么多功夫，到底還是就那么一個(gè).（這是推測(cè)了，但可能就是事實(shí)）所以當(dāng)你面對(duì)--幾千--個(gè)MD板上長(zhǎng)出的HIS+轉(zhuǎn)化子時(shí)，是喜悅還是苦惱呢？！（除了Invitrogen手冊(cè)上，在96孔板里傳3代,使每個(gè)轉(zhuǎn)化子都達(dá)到相同的稀釋外），還有什么好方法能使每個(gè)轉(zhuǎn)化子的濃度均一？或有什么更簡(jiǎn)便有效的方法？用G418濃度梯度，想把梯度放大，少做幾板，有什么經(jīng)驗(yàn)可以參考呀？請(qǐng)教了對(duì)于樓上的，我也有相同的困惑。如果載體是pPIC9K,pPIC3K，這樣轉(zhuǎn)化出的重組子可以進(jìn)行G418篩選，如果對(duì)于普通的載體轉(zhuǎn)化的重組子除了進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)型篩選，PCR鑒定目的片斷已經(jīng)整合到酵母基因組中，對(duì)于其是否表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的量多少，大家有沒(méi)有好點(diǎn)的方法啊？對(duì)于樓上說(shuō)的鑒定多拷貝的煩惱我也理解，不過(guò)我覺(jué)得如果你的轉(zhuǎn)化子很多的話(huà)，也就說(shuō)明你的轉(zhuǎn)化率很高，形成多拷貝的幾率也越大，我這幾次做的時(shí)就是直接點(diǎn)到G4184mg/ml的平板上，這樣雖然費(fèi)點(diǎn)事，但是各個(gè)克隆還是獨(dú)立的，比較可靠！G418篩選不能用點(diǎn)的方法，你會(huì)發(fā)現(xiàn)所有的克隆在高濃度平板上都會(huì)長(zhǎng)。應(yīng)該是把MD板上的菌落全洗下來(lái)，稀釋到一定濃度，然后涂板。0.250.511.52mg/ml，我做了這幾個(gè)濃度，每個(gè)濃度就是一個(gè)板，不是很多吧？可以看到每個(gè)板長(zhǎng)得菌落數(shù)是越來(lái)越少，長(zhǎng)出來(lái)的時(shí)間也越來(lái)越長(zhǎng)。當(dāng)然存在你從0.25板上取得可能是抗更高濃度的，可以通過(guò)雜交法準(zhǔn)確確定拷貝數(shù)的，說(shuō)明書(shū)上提到了。但肯定不存在seventhcat說(shuō)的那種情況，高拷貝生成的幾率是非常低的。電轉(zhuǎn)化過(guò)程，生成了低拷貝的基礎(chǔ)上才能生成高拷貝。我的結(jié)果是1.5的表達(dá)量最高，2.0的雖然蛋白總量挺高，但目的蛋白并不是最多的。我們不可能對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)化子都去比較它們的表達(dá)量，而且它們之間差距并不大，我覺(jué)得后面的條件優(yōu)化對(duì)表達(dá)量的影響更大。一般的做研究生課題，表達(dá)了就達(dá)到了你的目的了，可以找上十幾個(gè)比較一下。本人剛開(kāi)始作畢赤酵母表達(dá)，碰到了一個(gè)實(shí)質(zhì)性問(wèn)題，我的欲表達(dá)蛋白前端有一個(gè)信號(hào)肽，設(shè)計(jì)引物時(shí)沒(méi)有注意到這個(gè)問(wèn)題，現(xiàn)在就帶著信號(hào)肽直接連到載體上了，前面的工作都作完后，發(fā)現(xiàn)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的上清液中檢測(cè)不到目的蛋白，不知是不是我引入的這段信號(hào)肽影響了目的蛋白的表達(dá)，請(qǐng)高手賜教！急！應(yīng)該不會(huì)，信號(hào)肽是被切割后，目的蛋白才分泌到培養(yǎng)基中的，也就是說(shuō)，只要酵母本身切割徹底，你的目的蛋白就能夠在培養(yǎng)基中得到。這幾天做表達(dá)，我覺(jué)得我的目的蛋白條帶較弱，而且在前面有不明條帶，我懷疑是被降解了，不知畢赤酵母本身分泌的蛋白酶都是什么了？怎么可以避免降解了？我用的是BMGY/BMMY培養(yǎng)基，謝謝了！蛋白酶的成分很復(fù)雜，研究沒(méi)有意義，如果想避免降解，可以注意以下方面：優(yōu)化培養(yǎng)基PH值，從3到6，不影響酵母生長(zhǎng)，用添加緩沖液的方式來(lái)調(diào)PH值。加入酸水解酪素，1%比例，可作為保護(hù)劑。也可以添加一些蛋白月東。降低酵母表達(dá)溫度，可以試驗(yàn)25度，這樣蛋白酶的活性會(huì)受到抑制。請(qǐng)問(wèn)個(gè)位戰(zhàn)友：煮-凍-煮提酵母DNA方法很靈驗(yàn)么為什么我做了兩次都沒(méi)有呀用了5AOX和3AOX引物和目的基因的引物都沒(méi)有個(gè)擴(kuò)出來(lái)，以前用化學(xué)方法做出來(lái)過(guò)呀！望賜教??！煮-凍-煮提酵母DNA方法，我試了6次，只有上次不成功，但是我認(rèn)為我作的轉(zhuǎn)化肯定沒(méi)有問(wèn)題，所以我用玻璃珠法抽基因組DNA,在PCR,2.2kb,目的條帶都P出來(lái)了，不過(guò)就是麻煩了一點(diǎn)。但是這個(gè)方法很好用，不管是啤酒酵母，還是PICHIA,都沒(méi)有問(wèn)題。玻璃珠法提取酵母基因組DNA1）接種到5mlYEPD液體培養(yǎng)基中，30°C,250RPM過(guò)夜培養(yǎng)。2）把培養(yǎng)液轉(zhuǎn)到15ml離心管，4000RPM離心5分鐘，去上清。3）用3ml滅菌水洗細(xì)胞，離心去上清。4）把細(xì)胞懸浮在500ul細(xì)胞裂解液中，并轉(zhuǎn)到1.5mlEppendorf管中。5）加入250u廣300ul玻璃珠，并加入25ul5MNacl.。6）在蝸旋震蕩器上最大速度震蕩一分鐘。.7）2000rpm離心2minute。8）用1ml的移液槍把液體轉(zhuǎn)到1.5mlEppendorf管中。9）加入500ulTris平衡酚（ph8.2）,用手劇烈搖1分鐘，13200rpm離心1分鐘。用1ml的移液槍把水相（上層）轉(zhuǎn)到一個(gè)干凈的Eppendorf管中。10）加入500ulSEVAG（24:1氯仿：異丙醇），用手劇烈搖1分鐘，13200rpm離心1分鐘。用1ml的移液槍把水相（上層）轉(zhuǎn)到一個(gè)干凈的Eppendorf管中。11）加入1ml預(yù)冷的95%乙醇并在-20C沉淀DNA一個(gè)小時(shí)。12）13200RPM離心5分鐘，去上清，用70%的乙醇洗兩次，把DNA懸浮在500ul的TE中。13）加入50ulEDTA-Sark和3ulRNase（10mg/ml），在37C孵育30分鐘。再加入2.5ulproteinaseK（20mg/ml）,在37C孵育30分鐘。14）加入17ul5MNacl,終濃度為0.15M,重復(fù)步驟9和10。15）13200RPM離心5分鐘，去上清，用70%的乙醇洗兩次，把DNA懸浮在200ul的TE中。緩沖液：細(xì)胞裂解液：0.1MTris-Hcl（pH8.0）50mMEDTA1%SDSEDTA-Sark:0.4MEDTA（pH8.0）2%SarkosylTE:10mMTris-Hcl1mMEDTA（pH8.0）to超馬兄，你說(shuō)的細(xì)胞內(nèi)外的蛋白都是一樣的，我倒是沒(méi)做過(guò)驗(yàn)證，但是我總覺(jué)得細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)該是帶有信號(hào)肽的，如果你說(shuō)的正確的話(huà)，那么也就是說(shuō)，當(dāng)信號(hào)肽分泌到細(xì)胞膜的時(shí)候，Kex2信號(hào)肽酶切割完了又回到胞內(nèi)了？還是外源蛋白有ATG,信號(hào)肽沒(méi)有翻譯，直接從你的外源基因開(kāi)始翻譯？望賜教！我上次表達(dá)的外源蛋白沒(méi)有自身的ATG，而且沒(méi)有kex2酶切序列（當(dāng)時(shí)怕酶切不完全，沒(méi)有設(shè)計(jì)），我想信號(hào)肽應(yīng)該是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成切割的，停留在胞內(nèi)進(jìn)行糖基化，磷酸化等修飾。這樣胞內(nèi)帶信號(hào)肽的外源蛋白量很少，western的時(shí)候看不出來(lái)，而切了信號(hào)肽的外源蛋白占了絕大多數(shù)，不知我說(shuō)的是否正確？.這次我要表達(dá)的外源基因沒(méi)有自身的信號(hào)肽，為一個(gè)膜蛋白，我想是否需要將它自身的ATG也要設(shè)計(jì)進(jìn)去呢？謝謝你說(shuō)的“信號(hào)肽應(yīng)該是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成切割的，停留在胞內(nèi)進(jìn)行糖基化，磷酸化等修飾?！蔽矣X(jué)得是正確的，畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上的信號(hào)肽是引導(dǎo)外源融合蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的，但是要分泌到細(xì)胞外就得靠a一因子，a一因子是一個(gè)13個(gè)氨基酸的多肽，也就是說(shuō)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出來(lái)的蛋白，在外源蛋白的N末端仍然有13個(gè)氨基酸（a一因子），最后在分泌到細(xì)胞外的過(guò)程中被kex2酶切割，成為合適的外源蛋白，不知是否正確？望賜教！磷酸鉀溶液手冊(cè)說(shuō)要過(guò)慮，但能否高壓滅菌呢？未轉(zhuǎn)化的酵母單克隆YPD培養(yǎng)液在搖了16h后，菌體像豆腐渣的，這樣正常嗎?1磷酸鉀溶液高壓滅菌沒(méi)有問(wèn)題2肯定不正常，是不是染菌了，涂片看看。某些外源性蛋白在酵母中表達(dá)不理想，但經(jīng)過(guò)基因優(yōu)化以后有不少蛋白還是可以獲得一定量的表達(dá)。常見(jiàn)的優(yōu)化方式有密碼子優(yōu)化及發(fā)卡結(jié)構(gòu)消除。我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有兩個(gè)這樣的情況通過(guò)上述辦法得到解決。一個(gè)基因的表達(dá)主要也就轉(zhuǎn)錄和翻譯兩步。如果說(shuō)還有一部比較關(guān)鍵的話(huà)，也許再加一步分泌（在此，只討論分泌型表達(dá)的情況），這樣就算作三步：轉(zhuǎn)錄、翻譯、分泌。那一步有問(wèn)題都將導(dǎo)致表達(dá)量過(guò)低，但就我個(gè)人認(rèn)為轉(zhuǎn)綠應(yīng)該不是大問(wèn)題，諸如密碼子優(yōu)化、二級(jí)結(jié)構(gòu)消除等優(yōu)化策略均直指翻譯一步且效果不錯(cuò)，最近看到一篇文獻(xiàn)，作者針對(duì)于其表達(dá)的基因從mRNA水平、蛋白質(zhì)水平分別進(jìn)行了檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型低表達(dá)與優(yōu)化后告表達(dá)在mRNA水平上無(wú)明顯差別，而在蛋白質(zhì)水平有較大差別。翻譯和分泌我個(gè)人認(rèn)為可能是影響目的蛋白表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。先說(shuō)翻譯，密碼子的偏好性無(wú)疑是影響蛋白表大量的一個(gè)關(guān)鍵因素，基因二級(jí)結(jié)構(gòu)比如發(fā)卡結(jié)構(gòu)也應(yīng)當(dāng)是一個(gè)重要因素。但是在基因優(yōu)化過(guò)程中一味地選用高效密碼子或單一地消除二級(jí)結(jié)構(gòu)都不見(jiàn)得有好的效果。因此有關(guān)基因優(yōu)化的策略還希望有高人貢獻(xiàn)一下自己的心得或大家一起探索一些可能的策略。最后，分泌一步導(dǎo)致培液中蛋白量過(guò)少或沒(méi)有可能確與蛋白自身有些關(guān)系，更換信號(hào)肽或選擇其它表達(dá)方式可能是一條出路。今天最想和大家討論也是最想求助與大家的是：如果要通過(guò)Real-timePCR去分析一個(gè)外源基因的mRNA水平（哈哈，別笑我太奢侈）選擇一個(gè)什么樣的內(nèi)參合適，beta-actin？GAPDH？酵母中是否也有這些看家基因。我沒(méi)有能從NCBI上查到酵母中這兩個(gè)基因的序列。希望有哪位知道的施舍一下。提高表達(dá)量的方法有很多：1構(gòu)建多拷貝質(zhì)粒2選用酵母偏愛(ài)密碼子3增加產(chǎn)物穩(wěn)定性，在培養(yǎng)基中加PMSF,蛋白水解物等我也正在進(jìn)行Pichia的表達(dá)，可是在誘導(dǎo)過(guò)程的第2，3天是，酵母液的顏色變紅且味道發(fā)臭，請(qǐng)問(wèn)這是污染嗎？我一共搖了3次，都是這種情況，請(qǐng)問(wèn)有什么可以預(yù)防的方法嗎？是污染了，我的也曾經(jīng)出現(xiàn)過(guò)這種情況，但我不知道污染的是什么，記得以前也有人討論過(guò)這個(gè)問(wèn)題，好像是一種酵母，也有人說(shuō)是老化了，預(yù)防的話(huà)就是嚴(yán)格無(wú)菌操作，另外你的培養(yǎng)基是否已經(jīng)被污染了，我感覺(jué)我的就是培養(yǎng)基時(shí)間長(zhǎng)了，被污染了，重新配了就好了，另外，我不知道你是怎樣誘導(dǎo)的，你最好在MD板上劃菌，調(diào)單菌落，因?yàn)橛袝r(shí)板上也會(huì)長(zhǎng)出紅色的菌落的啊，goodluck!1、酵母分泌的蛋白酶在pH中性附近活力高。表達(dá)液徹底離心后，調(diào)節(jié)pH避開(kāi)中性范圍。2、蛋白質(zhì)幾次凍融應(yīng)該沒(méi)大的問(wèn)題，故先分裝-20度冷凍保存。3、另外，可根據(jù)情況加入蛋白酶抑制劑。我用的是Difco0919-07,的YNB無(wú)氨基酵母氮源，250g裝，F(xiàn)orclassifyingyeastsbasedonaminoacidandcarbohydraterequirementsAmmoniumsulfate5.0g/LRT這是北京拜爾迪生物公司"<>的YNB（無(wú)氨基酵母氮源），BD291920（原DIFCO公司），250g,價(jià)格：￥680/250g，現(xiàn)貨，Ammoniumsulfate5.0g/L,含有硫酸銨，請(qǐng)參考。134g用1L去離子水融解，就是10X的YNB了，不用加其它成分，過(guò)濾除菌就可以，不能高壓（我就是這樣做的，我們實(shí)驗(yàn)室就是買(mǎi)的這家公司的）G418我們這用的是上海生工的SD6308,40mg/mL的GS115的基因組DNA的提取方法分子克隆上講的很清楚，采用更簡(jiǎn)單的方法，就是反復(fù)煮凍煮，我就是這樣做，擴(kuò)不出來(lái)再煮凍，做了好幾輪PCR,最后出來(lái)了擴(kuò)增很亮，結(jié)果重復(fù)性也很好（當(dāng)然是用G418對(duì)HIS+轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了高拷貝篩選之后的重點(diǎn)菌落做的，需要鑒定的菌落個(gè)數(shù)也不多，十有七八都是陽(yáng)性的，需要有耐心）.我還沒(méi)開(kāi)始做，現(xiàn)在遇到一個(gè)問(wèn)題是，怎么能使信號(hào)肽被完全切掉，一個(gè)氨基酸殘基都不剩，因?yàn)椴恢朗Ｏ碌陌被釟埢鶗?huì)不會(huì)影響蛋白的活性，所以現(xiàn)在要先構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒，使其信號(hào)肽能100%被切掉。所以請(qǐng)教一下高手們關(guān)于各種信號(hào)肽及其切割位點(diǎn)的信息。幾天以后：最近查了一些文獻(xiàn)，a因子信號(hào)肽包含83個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)肽及后面一段由lys—Arg(Glu—Ala)l-2或Lys—Arg—Glu—Ala—Asp—Ala氨基酸序列組成的間隔肽。膜結(jié)合蛋白酶KEX2基因產(chǎn)物識(shí)別lys—Arg—C端，STE13基因表達(dá)產(chǎn)物則識(shí)別(Glu—Ala)或Asp—Ala外側(cè)。前導(dǎo)肽和間隔肽對(duì)蛋白質(zhì)的正確切割和分泌至關(guān)重要，但有時(shí)由于上述兩種基因產(chǎn)物的切割活力不同，會(huì)在外源蛋白的N端產(chǎn)生不同的切割位點(diǎn)，使一些分泌的蛋白N端帶有(Glu—Ala)融合序列，即產(chǎn)生酵母信號(hào)肽切割不完全現(xiàn)象，也就是我在上面提到的問(wèn)題。但是還是有很多人用以a因子為信號(hào)肽的載體并得到了成功表達(dá)。也有一些人采用別的信號(hào)肽來(lái)克服這方面的問(wèn)題。迄今我查的基本上是中文資料，所以還要繼續(xù)努力。我要做的蛋白N端對(duì)活性很重要，所以需要一個(gè)信號(hào)肽可以完全切掉的載體，目前正在查這方面的資料。各位園友誰(shuí)比較了解這方面，望多多指教！有沒(méi)有人試過(guò)低溫表達(dá)酵母(30以下)，據(jù)說(shuō)有助于蛋白結(jié)構(gòu)的折疊，對(duì)分泌表達(dá)也有好處.試過(guò)的請(qǐng)說(shuō)一下，在什么溫度下表達(dá)，效果如何？我做的就是在28度下表達(dá)的，量還可以至于對(duì)于空間結(jié)構(gòu)的影響沒(méi)有鑒定過(guò).甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)有不少優(yōu)點(diǎn)，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)最為人熟知，并廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)。雖然說(shuō)酵母表達(dá)操作簡(jiǎn)單表達(dá)量高，但是在實(shí)際操作中，并不是每個(gè)外源基因都能順利得到高表達(dá)的。不少人在操作中會(huì)遇到這樣那樣的問(wèn)題，生物通編者特地收集了部分用戶(hù)在使用EasySelectPichiaExpressionSystem這個(gè)被譽(yù)為最簡(jiǎn)單的畢赤酵母表達(dá)的經(jīng)典試劑盒過(guò)程中的心得體會(huì)。其中XiangYang是來(lái)自美國(guó)喬治城大學(xué)(GeorgetownUniversity)Lombardi癌癥中心(LombardiCancerCenter)，部分用戶(hù)來(lái)自國(guó)內(nèi)。甲基酵母部分優(yōu)點(diǎn)與其他真核表達(dá)系統(tǒng)比較與原核表達(dá)系統(tǒng)比較屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達(dá)優(yōu)點(diǎn)-+AOX強(qiáng)效啟動(dòng)子，外源基因產(chǎn)物表達(dá)量高，可以達(dá)到每升數(shù)克表達(dá)產(chǎn)物的水平++++酵母培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，遠(yuǎn)較真核系統(tǒng)簡(jiǎn)單，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。+++=可以誘導(dǎo)表達(dá)，也可以分泌表達(dá)，便于產(chǎn)物純化。=+可以甲醇代替IPTG作為誘導(dǎo)物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工業(yè)產(chǎn)物替代葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本低+++++表示優(yōu)勝于；-表示不如；二表示差不多EasySelectPichiaExpressionSystem產(chǎn)品性能：優(yōu)點(diǎn)使用簡(jiǎn)單，表達(dá)量高，His-tag便于純化缺點(diǎn)——酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問(wèn)題全面產(chǎn)品報(bào)告及心得體會(huì)：巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)是一種能高效表達(dá)重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達(dá)出來(lái)的蛋白可以進(jìn)行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長(zhǎng)速度快，可以將表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ在多克隆位點(diǎn)（MCR）3'端帶有his-tag和c-mycepitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測(cè)和純化，而且在MCR5'端引入了alphafactor（a-factor）用以增加表達(dá)，并且在表達(dá)后a-factor可以自動(dòng)被切除。在進(jìn)行克隆的時(shí)候，如果你選擇的是EcoRI,那么只需在目標(biāo)蛋白中增加兩個(gè)氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標(biāo)記，而誘導(dǎo)表達(dá)的載體需要甲醇——甲醇比一般用于大腸桿菌表達(dá)誘導(dǎo)使用的IPTG便宜。第一步——構(gòu)建載體XiangYang:pPICZ系列有許多克隆位點(diǎn)可供選擇，同時(shí)也有三種讀碼框以便不用的用戶(hù)需要。紅葉山莊：有關(guān)是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在原核表達(dá)，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點(diǎn)，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽(yáng)性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對(duì)于大小合適（30—50KD）的蛋白在產(chǎn)量上是pPIC9K無(wú)法比擬的。leslie:要做畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)，首先當(dāng)然就要了解這個(gè)可愛(ài)的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛(ài)），她和大腸桿菌長(zhǎng)得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過(guò)程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測(cè)。大家做畢赤表達(dá)的時(shí)候應(yīng)該都遇過(guò)這種情況吧，表達(dá)過(guò)程中染菌（我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)污染過(guò)各種顏色形狀的細(xì)菌，那真是一段可怕的經(jīng)歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就是浪費(fèi)大把的時(shí)間了?；臼煜ち水叧嘟湍福私饬怂L(zhǎng)的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長(zhǎng)的周期等等情況后，當(dāng)然更多的精力還是應(yīng)該花在表達(dá)的目的蛋白上，我的表達(dá)蛋白有些恐怖，有100KD,本來(lái)當(dāng)然應(yīng)該放在大腸桿菌中表達(dá)，但是為了分泌表達(dá)（其實(shí)后來(lái)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pET系列分泌表達(dá)系列也不錯(cuò)）和糖基化修飾（主要是這個(gè)方面，因?yàn)槲业牡鞍资侨嗽吹?，表達(dá)出來(lái)用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長(zhǎng)，所以在做克隆的時(shí)候也要非常小心，需要注意的是：酶切位點(diǎn)不能出現(xiàn)在目的DNA片段中——如果片段長(zhǎng)無(wú)法避免，可以采用平末端連接；雖然a-factor可以自動(dòng)切除，但是在設(shè)計(jì)表達(dá)的時(shí)候，如果在N端不能出現(xiàn)任何多余的aa（比如藥物蛋白表達(dá)），需要特別留意（說(shuō)明書(shū)上有詳細(xì)說(shuō)明：P13）；有三種不同的讀碼框（對(duì)于pPICZa系列來(lái)說(shuō)就是對(duì)上a-factor序列），在設(shè)計(jì)克隆的時(shí)候要反復(fù)確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問(wèn)題；無(wú)論pPICZ還是pPICZa都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒(méi)有ATG（起始密碼子），有人認(rèn)為酵母啟動(dòng)子與外源基因的ATG之間的距離越短對(duì)于表達(dá)的該基因越有利；如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關(guān)基因表達(dá)偏好密碼子的問(wèn)題有人認(rèn)為沒(méi)有必要更換，有人認(rèn)為一定要換，個(gè)人認(rèn)為以產(chǎn)量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過(guò)長(zhǎng)就比較麻煩，不過(guò)有許多真核保守蛋白其實(shí)是和酵母密碼子相似的；克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5a都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因?yàn)榕掠绊懙娇股刈饔茫╖eocin平板要避光保存）；測(cè)序引物可以用a-factor信號(hào)引物，也可以用5'AOX1引物；如果需要高量表達(dá)，可以考慮做克隆的時(shí)候串聯(lián)基因片段進(jìn)行表達(dá)，另外也可以在轉(zhuǎn)化酵母的時(shí)候重復(fù)轉(zhuǎn)化。目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因?yàn)檫@個(gè)序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會(huì)影響表達(dá)，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x二任何氨基酸），因?yàn)檫@些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會(huì)由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄，也需要多加注意。第二步就是將線(xiàn)性化的DNA轉(zhuǎn)化入Pichia酵母中。XiangYang:EasySelect試劑盒準(zhǔn)備了三種菌株：X33,GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因?yàn)檫@個(gè)菌株轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量相對(duì)而言較高，如果你有電轉(zhuǎn)儀（electroporator），可以嘗試一下。如果沒(méi)有的話(huà)，EasySelect也準(zhǔn)備了化學(xué)轉(zhuǎn)化試劑EasyCompTransformation，但是由于轉(zhuǎn)化率的緣故，我建議使用電轉(zhuǎn)儀。leslie:在得到了正確的序列之后就可以準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33,GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點(diǎn)有些不盡相同（Manual上寫(xiě)的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔(dān)心轉(zhuǎn)化率的話(huà)可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT+表現(xiàn)型，也就是說(shuō)可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)，但是據(jù)說(shuō)會(huì)對(duì)外源基因表達(dá)有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護(hù)表達(dá)產(chǎn)物免受降解，促進(jìn)表達(dá)量的提高。一般來(lái)說(shuō)，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用Mut一細(xì)胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對(duì)較多（約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進(jìn)行。而對(duì)于分泌蛋白的表達(dá)，無(wú)論是甲醇利用慢（Mut-）還是甲醇利用快（Mut+）的細(xì)胞都可應(yīng)用，如在人血清白蛋白（HSA）（為分泌型蛋白）的表達(dá)中就看不出兩種類(lèi)型的細(xì)胞之間有什么明顯差別。所以一般手冊(cè)都會(huì)建議同時(shí)在這幾種菌株中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這主要是因?yàn)椴煌幕蛟诓煌慕湍妇锌赡鼙磉_(dá)量截然不同，因此在最開(kāi)始的時(shí)候建議多用幾種酵母菌實(shí)驗(yàn)。另外有個(gè)保存問(wèn)題，原始酵母菌一定要保存好，因?yàn)榻湍冈趥鞔啻魏髸?huì)影響其轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量，所以一方面分多管分裝保存于-80°C，另一方面如果出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化或者表達(dá)的問(wèn)題，在其它方面都沒(méi)有出錯(cuò)的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。在準(zhǔn)備酵母菌的同時(shí)也需要準(zhǔn)備質(zhì)粒，由于酵母菌轉(zhuǎn)化對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的要求較高，量也較大（5-10ug），因此許多時(shí)候都會(huì)用PEG大提質(zhì)粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準(zhǔn)備好足夠量的質(zhì)粒，并且不要忘記也要同時(shí)準(zhǔn)備空載體以做對(duì)照。在轉(zhuǎn)化前質(zhì)粒需要進(jìn)行線(xiàn)性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達(dá)量高的一個(gè)重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達(dá)）。線(xiàn)性化位點(diǎn)個(gè)人認(rèn)為也會(huì)影響到表達(dá)量，對(duì)于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個(gè)線(xiàn)性化位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機(jī)會(huì)少，而且也有可能遇上沒(méi)有合適的線(xiàn)性化位點(diǎn)的情況，這個(gè)時(shí)候也不是說(shuō)不能進(jìn)行表達(dá)，但是準(zhǔn)備的質(zhì)粒就要增加10倍，另外也可以進(jìn)行部分酶切（即先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，掐定時(shí)間和酶量保證被切開(kāi)的質(zhì)粒有部分是在線(xiàn)性化位點(diǎn)切開(kāi)而基因片段保存完好）。在線(xiàn)性化之后的質(zhì)粒就可以酒精沉淀回收了——中間步驟需要使酶失活，說(shuō)明書(shū)建議是熱失活或者EDTA，個(gè)人認(rèn)為前者比較好，主要是擔(dān)心EDTA對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65C/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風(fēng)干，這一步需要多加注意保證風(fēng)干完全，因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)證明殘留的酒精對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響頗大。接下來(lái)就是酵母轉(zhuǎn)化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實(shí)驗(yàn)決定表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)化方法有不少，例如電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，其方法的難易程度和轉(zhuǎn)化率高低呈反向遞減的，也就是說(shuō)電轉(zhuǎn)最容易，轉(zhuǎn)化率較高（但要求有電轉(zhuǎn)儀），而原生質(zhì)體最麻煩，而且效果不好（比較傳統(tǒng)），因此不建議使用，EasySelect說(shuō)明書(shū)上這么建議，并且也詳細(xì)說(shuō)明了電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化（EasyComp和LiCl）方法的過(guò)程，可以按部就班。需要注意的是：（電轉(zhuǎn)過(guò)程）最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過(guò)的酵母放置時(shí)間不要超過(guò)一個(gè)星期；擴(kuò)大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，個(gè)人認(rèn)為不需要OD600達(dá)到1.3-1.5,1.0-1.3的就好，這個(gè)時(shí)候的酵母比較新鮮，轉(zhuǎn)化率比較高；整個(gè)感受態(tài)制作過(guò)程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機(jī)，這是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵——為了進(jìn)一步保證這一點(diǎn)，無(wú)菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉(zhuǎn)杯都要預(yù)冷；電轉(zhuǎn)儀需要預(yù)熱，所以準(zhǔn)備感受態(tài)的時(shí)候就可以把電轉(zhuǎn)儀打開(kāi)了，電轉(zhuǎn)后山梨醇的加入要快，曾有人做實(shí)驗(yàn)證明晚一秒就會(huì)降低轉(zhuǎn)化的數(shù)量級(jí)，雖然不一定可信，但是我個(gè)人也認(rèn)為這個(gè)過(guò)程要快，電轉(zhuǎn)后可以看看時(shí)間，如果時(shí)間過(guò)短（比如〈4）就可能說(shuō)明雜質(zhì)較多，會(huì)影響轉(zhuǎn)化率；轉(zhuǎn)化后溫育是個(gè)增加同源重組，增加存活率的過(guò)程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30C搖一段時(shí)間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉(zhuǎn)化率。（化學(xué)轉(zhuǎn)化）如果沒(méi)有電轉(zhuǎn)儀，LiCl轉(zhuǎn)化是一種可供選擇的方法，轉(zhuǎn)化率是102到103cfu/ug。主要過(guò)程為：取過(guò)夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8-1.0;4C,4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL,4C,4500rpm離心5分鐘，沉淀用50口l冰預(yù)冷的100mmol/LLiCl懸浮，最后定容至80-90ml。LiCl轉(zhuǎn)化取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞12000rpm，離心15s,吸棄LiCl溶液，按順序依次加入50%PEG240ml1mmol/LLiCl36ml單鏈鮭精DNA25ml線(xiàn)性化質(zhì)粒DNA10ml（約10mg）用吸頭反復(fù)吹打，使細(xì)胞沉淀與加入的溶液混勻，30C靜置溫育30min,42C熱擊20-25min,4500rpm離心10min,吸棄轉(zhuǎn)化液，細(xì)胞沉淀加1mlYPD培養(yǎng)基于30C200rpm培養(yǎng)2-4hr，取轉(zhuǎn)化混合液100ml涂布含100g/mLZeocinTM的YPDS平板，30C培養(yǎng)2-3天。第三步——挑克隆篩選XiangYang:在protocol中用了許多篇幅來(lái)指導(dǎo)這一步，包括如何去通過(guò)平板篩選，觀測(cè)生長(zhǎng)速率來(lái)確定Mut表現(xiàn)型等。這個(gè)過(guò)程需要3到5天，而我一般只用用了4個(gè)小時(shí)進(jìn)行PCR（AOX引物）篩選。leslie:完成轉(zhuǎn)化后就是克隆鑒定的過(guò)程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過(guò)程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因?yàn)楸容^快），具體過(guò)程protocol上說(shuō)的很清楚，其實(shí)也很簡(jiǎn)單，就是凍融破菌進(jìn)行菌落PCR，但是其中許多具體細(xì)節(jié)問(wèn)題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問(wèn)題，許多人用PCR方法進(jìn)行鑒定都無(wú)法得到結(jié)果，甚至在表達(dá)出了以后還是無(wú)法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無(wú)法正常釋放酵母基因組，一般通過(guò)培養(yǎng)菌然后進(jìn)行沸水和-20C冷凍循環(huán)過(guò)程裂解細(xì)胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以?xún)?nèi)是可以得到好的結(jié)果的，但是有時(shí)候片段過(guò)長(zhǎng)，模壁就會(huì)阻礙擴(kuò)增，所以我們實(shí)驗(yàn)室會(huì)用蝸牛酶（很便宜的酶來(lái)的）來(lái)幫助溶菌，我看許多實(shí)驗(yàn)室也會(huì)這么做，不過(guò)加入的時(shí)間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。第二就是是模板量，個(gè)人建議模板真的不要加太多了，按照說(shuō)明書(shū)的上的5ul我覺(jué)得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當(dāng)然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來(lái)凍融的菌數(shù)量有關(guān)。其次是假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會(huì)出現(xiàn)3.6kb的片段，而Mut+則會(huì)出現(xiàn)AOX1基因原本長(zhǎng)度的片段——大約長(zhǎng)2.2kb，因此如果的基因片段長(zhǎng)度相似，要注意區(qū)分。建議PCR過(guò)程中使用多對(duì)引物進(jìn)行反應(yīng)，包括自己基因的，a-factor的，5'AOX的，都可以，反正各種對(duì)照多了有利于比較——當(dāng)然前提是你不能暈了頭。掉了毛的鴕鳥(niǎo)：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1（AOX1）基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄終止子（5’AOX1和3’AOX1）,他們被多克隆位點(diǎn)分開(kāi)，外源基因可在此插入，此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因（HIS4）選擇標(biāo)記（HIS4區(qū)的整合方式為位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4）恢復(fù)野生型.HIS4區(qū)或AOX1區(qū)位點(diǎn)的整合都使轉(zhuǎn)化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進(jìn)行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS+表型以篩選轉(zhuǎn)化子.）及3’AOX1區(qū)，當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個(gè)載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，外源基因在5’AOX1啟動(dòng)子的控制下表達(dá).在載體中引入Tn903Kanr基因（抗G418）有助于篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關(guān)，通過(guò)篩選抗G418能力強(qiáng)的酵母即可獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中，因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.第四步——表達(dá)XiangYang:將你的克隆在YPD培養(yǎng)基中培育到OD600值達(dá)到6.0,就可以離心收菌。用表達(dá)培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30C培育過(guò)夜。leslie:篩選鑒定出自己的重組子可以說(shuō)什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達(dá)，有許多人在酵母表達(dá)上花費(fèi)了大量的時(shí)間——不同于大腸桿