DNA測序的基本原理

DNA測序的基本原理測序的基本原理是Sanger末端終止法在酶的作用下將原本是一條長達(dá)數(shù)百堿基的片斷擴(kuò)增成數(shù)百條片斷彼此間相差一個(gè)堿基。用電泳分離這些片斷后再通過測序儀將這些信號轉(zhuǎn)變成峰圖從而最終形成客戶所看到的測序序列和測序的峰圖。目前通用的擴(kuò)增方式是通過PCR的方式進(jìn)行的起源其原理簡述如下PCR類似于DNA的天然復(fù)制過程其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至93°C左右一定時(shí)間后使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離使之成為單鏈以便它與引物結(jié)合為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后溫度降至55C左右引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合③引物的延伸DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以dNTP為反應(yīng)原料靶序列為模板按堿基配對與半保留復(fù)制原理合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2-4分鐘2-3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。采用PCR的方式擴(kuò)增目標(biāo)片斷具有以下優(yōu)點(diǎn)微量的樣品也可進(jìn)行測序反應(yīng)操作簡便縮短了測序樣品的準(zhǔn)備時(shí)間。因此目前所有提供測序服務(wù)的公司都是采用PCR擴(kuò)增目標(biāo)片斷來進(jìn)行測序的。當(dāng)然由于測序反應(yīng)要求較普通PCR遠(yuǎn)為嚴(yán)格因此在所用的酶和反應(yīng)體系方面均進(jìn)行了特殊處理。轉(zhuǎn)錄為何不需要引物而復(fù)制需要轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶有特定的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)該酶結(jié)合到DNA上時(shí)，就確定了用哪條鏈，將來的核糖核苷酸的排列順序；復(fù)制時(shí)需要引物的原因很簡單，因?yàn)镈NA聚合酶不能從頭開始合成DNA，前面必須有一段DNA或RNA作為引物。識別61個(gè)編碼氨基酸的密碼子至少需要多少個(gè)tRNA核酶核酶(ribozyme)是具有催化功能的RNA分子，是生物催化劑，可降解特異的mRNA序列。核酶又稱核酸類酶、酶RNA、核酶類酶RNA。大多數(shù)核酶通過催化轉(zhuǎn)磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應(yīng)參與RNA自身剪切、加工過程。它的發(fā)現(xiàn)打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。核酶(ribozyme)—詞用于描述具有催化活性的RNA,即化學(xué)本質(zhì)是核糖核酸(RNA),卻具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子，有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多,有的能夠切割RNA,有的能夠切割DNA,有些還具有RNA連接酶、磷酸酶等活性。與蛋白質(zhì)酶相比，核酶的催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。2特點(diǎn)與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。3反應(yīng)大多數(shù)核酶通過催化轉(zhuǎn)磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應(yīng)參與RNA自身剪切、加工過程。發(fā)現(xiàn)美國科學(xué)家T.Cech和S.AItman發(fā)現(xiàn)了核酶(ribozyme)。最早發(fā)現(xiàn)大腸桿菌RNaseP的蛋白質(zhì)部分除去后，在體外高濃度Mg2+存在下，與留下的RNA部分(MIRNA)具有與全酶相同的催化活性。后來發(fā)現(xiàn)四膜蟲L19RNA在一定條件下能專一地催化寡聚核苷酸底物的切割與連接，具有核糖核酸酶和RNA聚合酶的活性。作用編輯隨著對核酶的深入研究，已經(jīng)認(rèn)識到核酶在遺傳病，腫瘤和病毒性疾病上的潛力。比如，對于艾滋病毒HIV的轉(zhuǎn)錄信息來源于RNA而非DNA，核酶能夠在特定位點(diǎn)切斷RNA，使得它失去活性。如果一個(gè)能專一識別HIV的RNA的核酶存在于被病毒感染的細(xì)胞內(nèi)，那么它就能建立抵抗入侵的第一防線。甚至，HIV確實(shí)進(jìn)入到了細(xì)胞并進(jìn)行了復(fù)制，RNA也可以在病毒生活史的不同階段切斷HIV的RNA而不影響自身的RNA。又如，白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，目前尚缺少有效的治療方法。核酶的發(fā)現(xiàn)，尤其是錘頭狀核酶，為白血病的基因治療帶來了新的希望。近些年，在國外的一些國家已經(jīng)在小白鼠體內(nèi)得到較好的效果。核酶是在對多種植物病毒衛(wèi)星RNA及類病毒RNA的自我剪接研究中發(fā)現(xiàn)的，數(shù)量較少，常見于rRNA的內(nèi)含子。核酶的具體作用主要有：核苷酸轉(zhuǎn)移作用。水解反應(yīng)，即磷酸二酯酶作用。磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)，類似磷酸轉(zhuǎn)移酶作用。脫磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。RNA內(nèi)切反應(yīng)，即RNA限制性內(nèi)切酶作用。核酸內(nèi)切酶可以催化水解多核苷酸內(nèi)部的磷酸二酯鍵。有些核酸內(nèi)切酶僅水解5,磷酸二酯鍵，把磷酸基團(tuán)留在3,位置上，稱為5，-內(nèi)切酶；而有些僅水解3，-磷酸二酯鍵，把磷酸基團(tuán)留在5'位置上，稱為3'-內(nèi)切酶。能專一性地識別并水解雙鏈DNA上的特異核苷酸順序，稱為限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,簡稱限制酶)。當(dāng)外源DNA侵入細(xì)菌后，限制性內(nèi)切酶可將其水解切成片段，從而限制了外源DNA在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，而細(xì)菌本身的DNA由于在該特異核苷酸順序處被甲基化酶修飾，不被水解，從而得到保護(hù)。限制性核酸內(nèi)切酶可被分成三種類型。I型和III型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亞基有通過在特殊堿基上補(bǔ)加甲基基團(tuán)對DNA進(jìn)行化學(xué)修飾的活性。II型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修飾DNA，能在所識別的特殊核苷酸順序內(nèi)或附近切割DNA。因此，被廣泛用于DNA分子克隆和序列測定。影響核酶的發(fā)現(xiàn)對于所有酶都是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念提出了挑戰(zhàn)。1989年,核酶的發(fā)現(xiàn)者T.Cech和S.Altman被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。核酸酶學(xué)：基礎(chǔ)與應(yīng)用是比較好的入門書籍。7補(bǔ)充核酶隨著生物學(xué)的發(fā)展，不僅僅只是包括RNA，如今人們還人工合成了一些DNA也具有催化活性。所以現(xiàn)在的核酶應(yīng)該包括催化性DNA和催化性RNA兩大類，上面只是介紹了催化性RNA。目前，催化性DNA只是人工合成的，并沒有發(fā)現(xiàn)有天然存在的。核酶(ribozyme)是具有酶活性的RNA，主要參加RNA的加工與成熟。天然核酶可分為四類：(1)異體催化剪切型，如RNaseP；(2)自體催化的剪切型，如植物類病毒、擬病毒和衛(wèi)星RNA；⑶第一組內(nèi)含子自我剪接型，如四膜蟲大核26SrRNA；⑷第二組內(nèi)含子自我剪接型。利用反義技術(shù)研