《電泳法electroph》教學(xué)課件

《電泳法electroph》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！《電泳法electroph》幻燈片本課件PPT僅供大歷史及應(yīng)用分類〔據(jù)原理〕根本原理常用電泳法例舉[全屬于區(qū)帶電泳〔注意介質(zhì)〕]歷史及應(yīng)用電泳法最早由瑞典的Tiselius于1937建立，用移界電泳法成功地將血清蛋白質(zhì)分成5個(gè)主要成分，即白蛋白、α1-

、α2-

、β-、和γ-球蛋白。在藥學(xué)領(lǐng)域，是生化藥物和基因工程藥物分析的重要手段。電泳法最早由瑞典的Tiselius于1937建立，用移界電泳按別離原理分類移界電泳〔movingboundaryEP〕區(qū)帶電泳(zoneEP)等速電泳(isotachophoresis)等電聚焦(isoelectricfocusing)不同電泳法的分離原理示意圖按別離原理分類移界電泳〔movingboundaryAB+BABAABBAABCCBA移界區(qū)帶ABC等速等電聚焦pH9876混合分立穩(wěn)態(tài)時(shí)毗鄰穩(wěn)態(tài)時(shí)分立靜止AB+BABAABB高效毛細(xì)管電泳〔highperformancecapillaryelectrophores,HPCE〕毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管等電聚焦……與一般電泳法的區(qū)別：

使用了毛細(xì)管柱。極為高效。高效毛細(xì)管電泳〔highperformancecapil基本原理：在電場(chǎng)作用下,溶質(zhì)因遷移率(泳動(dòng)率)不同而達(dá)到分離.阻力:f=6пrηv(r為質(zhì)點(diǎn)直徑;η為介質(zhì)粘度;v為遷移率)受力分析動(dòng)力:F=EQ質(zhì)荷比質(zhì)點(diǎn)有效直徑溶液粘度離子強(qiáng)度電滲現(xiàn)象影響因素基本原理：在電場(chǎng)作用下,溶質(zhì)因阻力:f=6пr離子氛現(xiàn)象：被分離的粒子（如蛋白），在離子強(qiáng)度大的體系中。離子氛現(xiàn)象明顯。具相反電荷的粒子阻礙了粒子的運(yùn)動(dòng),朝相反方向運(yùn)動(dòng).離子強(qiáng)度對(duì)電泳的影響離子強(qiáng)度

+++++++++離子氛遷移率離子氛現(xiàn)象：被分離的粒子（如蛋白），在離子離子強(qiáng)度對(duì)電泳的影電滲現(xiàn)象對(duì)電泳的影響

電滲：液體在電場(chǎng)中對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)固體------------+++++++++++++電滲方向電滲現(xiàn)象對(duì)電泳的影響

電滲：液體在電場(chǎng)中對(duì)固體支持物的相

介質(zhì)

原理

特點(diǎn)紙電泳Paperelectrophoresis

紙（纖維素）質(zhì)荷比分辨率低醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素質(zhì)荷比在紙電泳基礎(chǔ)上的改進(jìn)PAGE法聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)荷比+分子篩凝膠不僅作為支持物，且以分子篩主動(dòng)參與樣品的分離。SDS聚丙烯酰胺凝膠分子篩用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖分子篩因孔徑大，用于核酸的研究介質(zhì)原理特點(diǎn)紙電泳紙（纖維素）質(zhì)荷比分辨率醋酸纖維素較紙電泳的優(yōu)點(diǎn)電滲現(xiàn)象影響小醋酸纖維素膜對(duì)蛋白的吸附小，幾無“拖尾〞。由于醋酸纖維素親水性小，所容納的緩沖液也較少，電流大局部是由樣品傳導(dǎo)，所以別離速度快。醋酸纖維素是纖維素（紙）的醋酸酯醋酸纖維素較紙電泳的優(yōu)點(diǎn)電滲現(xiàn)象影響小醋酸纖維素是纖維素（紙丙烯酰胺+N，N-甲叉雙丙烯酰胺具三維空間凝膠網(wǎng)絡(luò)聚合催化劑：過硫酸銨（AP）催化生成自由基加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）提供自由基為什么聚丙烯酰胺具有分子篩的作用？（不同的配比不同的孔徑）丙烯酰胺+N，N-甲叉雙丙烯酰胺具三維空SDS與PAGE有什么區(qū)別呢？SDS（十二烷基磺酸鈉）+蛋白線性復(fù)合物使復(fù)合物所帶負(fù)電荷遠(yuǎn)超過天然蛋白本身電荷，消除了電荷效應(yīng)，而分子量占主導(dǎo)。SDS與PAGE有什么區(qū)別呢？SDS（十二烷基磺酸瓊脂瓊脂糖瓊脂膠脫去SO42-丙酮酸酯基應(yīng)用由于孔徑大，對(duì)大多數(shù)蛋白來說，其分子篩作用微不足道。因此廣泛應(yīng)用于核酸的研究，分離范圍廣（200bp-50kb的DNA）.瓊脂瓊脂糖脫去SO42-丙酮酸酯基應(yīng)用由于孔徑大，對(duì)大多數(shù)蛋PAGE圓盤電泳（discEP）不連續(xù)平板電泳（slabEP）連續(xù)PAGE圓盤電泳（discEP）不連續(xù)樣品膠（溶解樣品）濃縮膠（無分子篩作用，濃縮樣品）分離膠（主要分子篩兼有質(zhì)荷比）discNotice:1.兩化合物均是中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒物,避免吸入粉塵和接觸皮膚。2.染色：一般用考馬斯亮藍(lán)R-250（595nm）若靈敏度要求高，用微量銀染（靈敏度較前者大100倍）Steps:1.制膠2.上樣3.電泳4.染色樣品膠（溶解樣品）濃縮膠（無分子篩作用，濃縮樣品）分Steps:1.loadedwithDNA2.beingrunbytheapplicationofanelectriccurrent3.Observation.ThesmallerthepieceofDNA,thefasteritrunsinthegel.4.observeunderultravioletlightwhenthecurrentisturnedoff.thegelisstainedwithethidiumbromide(EB).

Steps:ResultNotice:溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。勿將溶液灑在臺(tái)面上，用后用水徹底沖洗干凈ResultNotice:溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有四、生物檢定法定義：利用藥物對(duì)生物體（整體動(dòng)物、離體組織、微生物等）的作用以測(cè)定其效價(jià)或生物活性的一種方法。四、生物檢定法定義：利用藥物對(duì)生物體（整體動(dòng)物、離體組生物檢定的應(yīng)用范圍藥物效價(jià)測(cè)定1.理化方法不能測(cè)定含量2.雖可用理化方法測(cè)定，但理化測(cè)定不能反映臨床生物活性或效價(jià)〔如氨基苷類〕微量生理活性物質(zhì)的測(cè)定因濃度低，很難用理化方法測(cè)定〔神經(jīng)介質(zhì)、激素等〕生物檢定的應(yīng)用范圍藥物效價(jià)測(cè)定注意點(diǎn)：只有當(dāng)無適當(dāng)理化方法時(shí)，才用生物檢定法。它是理化檢驗(yàn)的一個(gè)補(bǔ)充。原因由于生物差異的存在，生物檢定結(jié)果誤差較大，重現(xiàn)性比較差，需要控制的條件較多；測(cè)定費(fèi)時(shí)，計(jì)算繁瑣。注意點(diǎn)：只有當(dāng)無適當(dāng)理化方法時(shí)，才用生物檢定法。它是理化檢驗(yàn)

謝謝！DNA-19DNA-19缺點(diǎn)：存在對(duì)流。成分相互重疊。定義:在一根U型管里的溶液中,各物質(zhì)據(jù)泳動(dòng)速率的不同,達(dá)到分離.移界電泳缺點(diǎn)：存在對(duì)流。定義:在一根U型管里的溶液中,各物質(zhì)據(jù)移+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10人工pH梯度基于如蔗糖的密度梯度。自然pH梯度基于載體兩性電解質(zhì)分辨率0.01pH單位+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5p定義:在電泳過程中,應(yīng)用各種不同的惰性支持介質(zhì)(醋酸纖維素,聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖等)使具有不同泳動(dòng)速率的各組分形成各自的區(qū)帶.區(qū)帶電泳定義:在電泳過程中,應(yīng)用各種不同的惰性支持介質(zhì)區(qū)帶電泳

《電泳法electroph》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！《電泳法electroph》幻燈片本課件PPT僅供大歷史及應(yīng)用分類〔據(jù)原理〕根本原理常用電泳法例舉[全屬于區(qū)帶電泳〔注意介質(zhì)〕]歷史及應(yīng)用電泳法最早由瑞典的Tiselius于1937建立，用移界電泳法成功地將血清蛋白質(zhì)分成5個(gè)主要成分，即白蛋白、α1-

、α2-

、β-、和γ-球蛋白。在藥學(xué)領(lǐng)域，是生化藥物和基因工程藥物分析的重要手段。電泳法最早由瑞典的Tiselius于1937建立，用移界電泳按別離原理分類移界電泳〔movingboundaryEP〕區(qū)帶電泳(zoneEP)等速電泳(isotachophoresis)等電聚焦(isoelectricfocusing)不同電泳法的分離原理示意圖按別離原理分類移界電泳〔movingboundaryAB+BABAABBAABCCBA移界區(qū)帶ABC等速等電聚焦pH9876混合分立穩(wěn)態(tài)時(shí)毗鄰穩(wěn)態(tài)時(shí)分立靜止AB+BABAABB高效毛細(xì)管電泳〔highperformancecapillaryelectrophores,HPCE〕毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管等電聚焦……與一般電泳法的區(qū)別：

使用了毛細(xì)管柱。極為高效。高效毛細(xì)管電泳〔highperformancecapil基本原理：在電場(chǎng)作用下,溶質(zhì)因遷移率(泳動(dòng)率)不同而達(dá)到分離.阻力:f=6пrηv(r為質(zhì)點(diǎn)直徑;η為介質(zhì)粘度;v為遷移率)受力分析動(dòng)力:F=EQ質(zhì)荷比質(zhì)點(diǎn)有效直徑溶液粘度離子強(qiáng)度電滲現(xiàn)象影響因素基本原理：在電場(chǎng)作用下,溶質(zhì)因阻力:f=6пr離子氛現(xiàn)象：被分離的粒子（如蛋白），在離子強(qiáng)度大的體系中。離子氛現(xiàn)象明顯。具相反電荷的粒子阻礙了粒子的運(yùn)動(dòng),朝相反方向運(yùn)動(dòng).離子強(qiáng)度對(duì)電泳的影響離子強(qiáng)度

+++++++++離子氛遷移率離子氛現(xiàn)象：被分離的粒子（如蛋白），在離子離子強(qiáng)度對(duì)電泳的影電滲現(xiàn)象對(duì)電泳的影響

電滲：液體在電場(chǎng)中對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)固體------------+++++++++++++電滲方向電滲現(xiàn)象對(duì)電泳的影響

電滲：液體在電場(chǎng)中對(duì)固體支持物的相

介質(zhì)

原理

特點(diǎn)紙電泳Paperelectrophoresis

紙（纖維素）質(zhì)荷比分辨率低醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素質(zhì)荷比在紙電泳基礎(chǔ)上的改進(jìn)PAGE法聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)荷比+分子篩凝膠不僅作為支持物，且以分子篩主動(dòng)參與樣品的分離。SDS聚丙烯酰胺凝膠分子篩用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖分子篩因孔徑大，用于核酸的研究介質(zhì)原理特點(diǎn)紙電泳紙（纖維素）質(zhì)荷比分辨率醋酸纖維素較紙電泳的優(yōu)點(diǎn)電滲現(xiàn)象影響小醋酸纖維素膜對(duì)蛋白的吸附小，幾無“拖尾〞。由于醋酸纖維素親水性小，所容納的緩沖液也較少，電流大局部是由樣品傳導(dǎo)，所以別離速度快。醋酸纖維素是纖維素（紙）的醋酸酯醋酸纖維素較紙電泳的優(yōu)點(diǎn)電滲現(xiàn)象影響小醋酸纖維素是纖維素（紙丙烯酰胺+N，N-甲叉雙丙烯酰胺具三維空間凝膠網(wǎng)絡(luò)聚合催化劑：過硫酸銨（AP）催化生成自由基加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）提供自由基為什么聚丙烯酰胺具有分子篩的作用？（不同的配比不同的孔徑）丙烯酰胺+N，N-甲叉雙丙烯酰胺具三維空SDS與PAGE有什么區(qū)別呢？SDS（十二烷基磺酸鈉）+蛋白線性復(fù)合物使復(fù)合物所帶負(fù)電荷遠(yuǎn)超過天然蛋白本身電荷，消除了電荷效應(yīng)，而分子量占主導(dǎo)。SDS與PAGE有什么區(qū)別呢？SDS（十二烷基磺酸瓊脂瓊脂糖瓊脂膠脫去SO42-丙酮酸酯基應(yīng)用由于孔徑大，對(duì)大多數(shù)蛋白來說，其分子篩作用微不足道。因此廣泛應(yīng)用于核酸的研究，分離范圍廣（200bp-50kb的DNA）.瓊脂瓊脂糖脫去SO42-丙酮酸酯基應(yīng)用由于孔徑大，對(duì)大多數(shù)蛋PAGE圓盤電泳（discEP）不連續(xù)平板電泳（slabEP）連續(xù)PAGE圓盤電泳（discEP）不連續(xù)樣品膠（溶解樣品）濃縮膠（無分子篩作用，濃縮樣品）分離膠（主要分子篩兼有質(zhì)荷比）discNotice:1.兩化合物均是中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒物,避免吸入粉塵和接觸皮膚。2.染色：一般用考馬斯亮藍(lán)R-250（595nm）若靈敏度要求高，用微量銀染（靈敏度較前者大100倍）Steps:1.制膠2.上樣3.電泳4.染色樣品膠（溶解樣品）濃縮膠（無分子篩作用，濃縮樣品）分Steps:1.loadedwithDNA2.beingrunbytheapplicationofanelectriccurrent3.Observation.ThesmallerthepieceofDNA,thefasteritrunsinthegel.4.observeunderultravioletlightwhenthecurrentisturnedoff.thegelisstainedwithethidiumbromide(EB).

Steps:ResultNotice:溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。勿將溶液灑在臺(tái)面上，用后用水徹底沖洗干凈ResultNotice:溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有四、生物檢定法定義：利用藥物對(duì)生物體（整體動(dòng)物、離體組織、微生物等）的作用以測(cè)定其效價(jià)或生物活性的一種方法。四、生物檢定法定義：利用藥物對(duì)生物體（整體動(dòng)物、離體組生物檢定的應(yīng)用范圍藥物效價(jià)測(cè)定1.理化方法不能測(cè)定含量2.雖可用理化方法測(cè)定，但理化測(cè)定不能反映臨床生物活性或效價(jià)〔如氨基苷類〕微量生理活