第8章環(huán)境微生物的分離與鑒定技術(shù)課件

第八章環(huán)境微生物的分離與鑒定技術(shù)微生物純培養(yǎng)的分離方法微生物分類鑒定的經(jīng)典方法微生物的快速鑒定技術(shù)API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)Enterotube系統(tǒng)微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA堿基組成(G+C)mol%分析Biolog方法鑒定環(huán)境微生物群落技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)核酸雜交技術(shù)DNA芯片技術(shù)DNA指紋圖譜技術(shù)第八章環(huán)境微生物的分離與鑒定技術(shù)微生物純培養(yǎng)的分離方法1一、微生物純培養(yǎng)的分離方法固體平板分離純培養(yǎng)稀釋平板法平板劃線法單細(xì)胞分離法菌絲尖端分離法液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)利用選擇培養(yǎng)基分離一、微生物純培養(yǎng)的分離方法固體平板分離純培養(yǎng)2二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法指長(zhǎng)期以來在常規(guī)鑒定中普遍采用的一些關(guān)于形態(tài)、生理、生化、生態(tài)、生活史和血清學(xué)反應(yīng)等指標(biāo)的鑒定方法。微生物分類鑒定的依據(jù)：形態(tài)特征個(gè)體形態(tài)特征培養(yǎng)特征生理生化特征常用的生化反應(yīng)：糖發(fā)酵試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、三糖鐵(TSI)瓊脂試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)等二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法指長(zhǎng)期以來在常規(guī)鑒定中普遍采用的3二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法鑒定方法：一般先根據(jù)形態(tài)特征鑒別其屬于哪一大類(細(xì)菌、放線菌、酵母菌或霉菌)再根據(jù)生理生化特征、生態(tài)特征、免疫特征和遺傳特征等，借助于檢索表或鑒定手冊(cè)來依次確定是屬于哪個(gè)目、科、屬、種對(duì)于不同的微生物有不同的重點(diǎn)鑒定指標(biāo)二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法鑒定方法：4三、微生物的快速鑒定技術(shù)API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)(簡(jiǎn)易診檢技術(shù)、數(shù)碼分類鑒定法)

ADHODCH2STDAVPGLUINORHAMELARAONPGLDCCITUREINDGELMANSORSACAMY三、微生物的快速鑒定技術(shù)API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)(簡(jiǎn)易診檢技5三、微生物的快速鑒定技術(shù)Enterotube系統(tǒng)美國(guó)Roche公司生產(chǎn)的Enterotube系統(tǒng)三、微生物的快速鑒定技術(shù)Enterotube系統(tǒng)美國(guó)Roc6Biolog法Biolog測(cè)定原理：微孔板，每板含有96個(gè)孔，其中95個(gè)孔中加入了95種單一碳源和四唑染料，另外一個(gè)未加碳源的孔中加水為對(duì)照，環(huán)境微生物接種至孔中，孔中一旦有電子轉(zhuǎn)移，四唑染料就會(huì)變?yōu)樽仙?，顏色的深淺可以反映環(huán)境微生物對(duì)碳源的利用程度該方法由美國(guó)BIOLOG公司于1989年開發(fā)成功，至今已能鑒定包括細(xì)菌、酵母菌和霉菌在內(nèi)的2000多種病原微生物和環(huán)境微生物。三、微生物的快速鑒定技術(shù)Biolog法三、微生物的快速鑒定技術(shù)7四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)Biolog法Biolog系統(tǒng)組成：96個(gè)孔微孔板讀數(shù)器：讀取一波長(zhǎng)下小孔內(nèi)吸光度及變化微機(jī)系統(tǒng)：與讀數(shù)器相連，自動(dòng)完成數(shù)據(jù)采集、傳輸、存貯與分析方法操作平板選擇樣品制備加樣培育與讀數(shù)數(shù)據(jù)分析四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)Biolog法8四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA(G+C)mol%值的測(cè)定DNA(G+C)mol%值是微生物(除少數(shù)以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒)的一個(gè)基本遺傳特征，對(duì)特定微生物來說，(G+C)mol%是恒定的。(G+C)mol%=(G+C)(mol)/(A+T+G+C)(mol)×100%(G+C)mol%的變化范圍較廣，原核生物為20-80，真核生物為30-60。完全不同的微生物可能有相近的(G+C)mol%，但(G+C)mol%有明顯差異的微生物肯定不會(huì)屬于同一個(gè)種。一般認(rèn)為，種內(nèi)菌株間(G+C)mol%相差不超過4%，屬內(nèi)菌株間相差不超過10%，相差低于2%時(shí)沒有分類學(xué)意義四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA(G+C)mol%值的測(cè)9四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA(G+C)mol%值的測(cè)定DNA(G+C)mol%值可所用測(cè)定方法的不同和測(cè)定誤差等而有差異該方法操作簡(jiǎn)單，但分率力不高(G+C)mol%的測(cè)定方法熱變性溫度測(cè)定法(Tm法)紙層析法高效液相色譜法浮力密度法四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA(G+C)mol%值的測(cè)10四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)核酸雜交技術(shù)

核酸雜交是指具有一定互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在液相或固相體系中按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則締結(jié)成異質(zhì)雙鏈的過程DNA-DNA同源性分析DNA-rRNA同源性分析雜交方法固相雜交法：一是待測(cè)菌的DNA或RNA，二是用于檢測(cè)的已知序列DNA或片段，即探針?biāo)?、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)核酸雜交技術(shù)11四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA芯片技術(shù)DNA芯片技術(shù)是指將多達(dá)成千上萬(wàn)種的探針分子按照特定的排列方式固定在固相載體(多數(shù)采用玻片)上，組成密集的微點(diǎn)陣或陣列，利用核酸雜交原理，用已知序列的DNA分子，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，與標(biāo)記的特異性單鏈DNA或RNA分子雜交形成雙鏈，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱來判斷樣品中靶分子的數(shù)量，實(shí)現(xiàn)核酸序列的分子識(shí)別。DNA芯片技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)是可以同時(shí)、快捷、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)基因組的信息DNA芯片技術(shù)的改進(jìn)使得DNA診斷不斷小型化并具有高效率。四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA芯片技術(shù)12四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)

基本原理細(xì)菌體內(nèi)有3種不同的RNA，即mRNA、rRNA和tRNA。它們分別行使著不同的功能，其中rRNA可將遺傳信息得以表達(dá)，轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)，它在所有細(xì)菌中都有一定的堿基序列和空間結(jié)構(gòu)。細(xì)菌種類不同，rRNA序列不同。原核生物的rRNA是由兩個(gè)亞基所組成：50S和30S，而30S亞基進(jìn)一步由3種類型組成，即23S、16S和5SrRNA，它們分別含有約2900、1500和120個(gè)核苷酸。16SrRNA相對(duì)分子量適中，又具有保守性和存在的普遍性等特點(diǎn)，序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)，序列分析的重現(xiàn)性極高，再加上16SrRNA可直接從DNA中轉(zhuǎn)錄而直接測(cè)序，因此，現(xiàn)在一般普遍采用16SrRNA作為序列分析對(duì)象對(duì)微生物進(jìn)行測(cè)序分析。四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)13四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)分析方法四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)14四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)分析方法從樣品中分離總微生物DNAPCR擴(kuò)增16SrRNA基因片段分析將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體上進(jìn)行直接測(cè)序通過16SrRNA種屬特異性的探針與PCR產(chǎn)物雜交以獲得微生物組成信息對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行梯度凝膠電泳分析，直接觀察其多樣性對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA指紋圖譜分析四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)15四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)應(yīng)注意的問題提取的DNA要能夠代表樣品中環(huán)境微生物的遺傳多樣性防止核酸污染出現(xiàn)PCR假陽(yáng)性結(jié)果克服混合環(huán)境微生物基因組DNAPCR出現(xiàn)的不均等擴(kuò)增現(xiàn)象排除PCR產(chǎn)物中的嵌合序列避免探針雜交中出現(xiàn)的假陰性結(jié)果四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)16四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA指紋圖譜技術(shù)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)其原理是利用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶在特定位點(diǎn)上將細(xì)胞基因組DNA切割成不同長(zhǎng)度的片段，然后在瓊脂糖凝膠上電泳分離后對(duì)所得圖譜進(jìn)行分析比較得出分類結(jié)論，以顯示不同種群基因組DNA的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA指紋圖譜技術(shù)17四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA指紋圖譜技術(shù)隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析(RAPD)其原理是不同的基因組中與隨意引物匹配的堿基序列的位點(diǎn)和數(shù)目可能不同，因而采用核苷酸序列的隨機(jī)引物進(jìn)行基因組DNA擴(kuò)增，非特異性引物可以結(jié)合在模板DNA的多個(gè)位點(diǎn)，產(chǎn)生多個(gè)PCR產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠電泳將產(chǎn)物分離，將每株菌的每條引物下擴(kuò)增后產(chǎn)生的圖譜合成為針對(duì)一株菌的單一圖譜，再通過軟件進(jìn)行分析。四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA指紋圖譜技術(shù)18四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA指紋圖譜技術(shù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(AFLP)其基本原理是通過PCR選擇性擴(kuò)增整個(gè)DNA的內(nèi)切酶片段，在分辨率高的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，產(chǎn)生一組特異的DNA限制性片段的指紋圖。四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA指紋圖譜技術(shù)19第八章環(huán)境微生物的分離與鑒定技術(shù)微生物純培養(yǎng)的分離方法微生物分類鑒定的經(jīng)典方法微生物的快速鑒定技術(shù)API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)Enterotube系統(tǒng)微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA堿基組成(G+C)mol%分析Biolog方法鑒定環(huán)境微生物群落技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)核酸雜交技術(shù)DNA芯片技術(shù)DNA指紋圖譜技術(shù)第八章環(huán)境微生物的分離與鑒定技術(shù)微生物純培養(yǎng)的分離方法20一、微生物純培養(yǎng)的分離方法固體平板分離純培養(yǎng)稀釋平板法平板劃線法單細(xì)胞分離法菌絲尖端分離法液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)利用選擇培養(yǎng)基分離一、微生物純培養(yǎng)的分離方法固體平板分離純培養(yǎng)21二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法指長(zhǎng)期以來在常規(guī)鑒定中普遍采用的一些關(guān)于形態(tài)、生理、生化、生態(tài)、生活史和血清學(xué)反應(yīng)等指標(biāo)的鑒定方法。微生物分類鑒定的依據(jù)：形態(tài)特征個(gè)體形態(tài)特征培養(yǎng)特征生理生化特征常用的生化反應(yīng)：糖發(fā)酵試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、三糖鐵(TSI)瓊脂試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)等二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法指長(zhǎng)期以來在常規(guī)鑒定中普遍采用的22二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法鑒定方法：一般先根據(jù)形態(tài)特征鑒別其屬于哪一大類(細(xì)菌、放線菌、酵母菌或霉菌)再根據(jù)生理生化特征、生態(tài)特征、免疫特征和遺傳特征等，借助于檢索表或鑒定手冊(cè)來依次確定是屬于哪個(gè)目、科、屬、種對(duì)于不同的微生物有不同的重點(diǎn)鑒定指標(biāo)二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法鑒定方法：23三、微生物的快速鑒定技術(shù)API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)(簡(jiǎn)易診檢技術(shù)、數(shù)碼分類鑒定法)

ADHODCH2STDAVPGLUINORHAMELARAONPGLDCCITUREINDGELMANSORSACAMY三、微生物的快速鑒定技術(shù)API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)(簡(jiǎn)易診檢技24三、微生物的快速鑒定技術(shù)Enterotube系統(tǒng)美國(guó)Roche公司生產(chǎn)的Enterotube系統(tǒng)三、微生物的快速鑒定技術(shù)Enterotube系統(tǒng)美國(guó)Roc25Biolog法Biolog測(cè)定原理：微孔板，每板含有96個(gè)孔，其中95個(gè)孔中加入了95種單一碳源和四唑染料，另外一個(gè)未加碳源的孔中加水為對(duì)照，環(huán)境微生物接種至孔中，孔中一旦有電子轉(zhuǎn)移，四唑染料就會(huì)變?yōu)樽仙伾纳顪\可以反映環(huán)境微生物對(duì)碳源的利用程度該方法由美國(guó)BIOLOG公司于1989年開發(fā)成功，至今已能鑒定包括細(xì)菌、酵母菌和霉菌在內(nèi)的2000多種病原微生物和環(huán)境微生物。三、微生物的快速鑒定技術(shù)Biolog法三、微生物的快速鑒定技術(shù)26四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)Biolog法Biolog系統(tǒng)組成：96個(gè)孔微孔板讀數(shù)器：讀取一波長(zhǎng)下小孔內(nèi)吸光度及變化微機(jī)系統(tǒng)：與讀數(shù)器相連，自動(dòng)完成數(shù)據(jù)采集、傳輸、存貯與分析方法操作平板選擇樣品制備加樣培育與讀數(shù)數(shù)據(jù)分析四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)Biolog法27四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA(G+C)mol%值的測(cè)定DNA(G+C)mol%值是微生物(除少數(shù)以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒)的一個(gè)基本遺傳特征，對(duì)特定微生物來說，(G+C)mol%是恒定的。(G+C)mol%=(G+C)(mol)/(A+T+G+C)(mol)×100%(G+C)mol%的變化范圍較廣，原核生物為20-80，真核生物為30-60。完全不同的微生物可能有相近的(G+C)mol%，但(G+C)mol%有明顯差異的微生物肯定不會(huì)屬于同一個(gè)種。一般認(rèn)為，種內(nèi)菌株間(G+C)mol%相差不超過4%，屬內(nèi)菌株間相差不超過10%，相差低于2%時(shí)沒有分類學(xué)意義四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA(G+C)mol%值的測(cè)28四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA(G+C)mol%值的測(cè)定DNA(G+C)mol%值可所用測(cè)定方法的不同和測(cè)定誤差等而有差異該方法操作簡(jiǎn)單，但分率力不高(G+C)mol%的測(cè)定方法熱變性溫度測(cè)定法(Tm法)紙層析法高效液相色譜法浮力密度法四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA(G+C)mol%值的測(cè)29四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)核酸雜交技術(shù)

核酸雜交是指具有一定互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在液相或固相體系中按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則締結(jié)成異質(zhì)雙鏈的過程DNA-DNA同源性分析DNA-rRNA同源性分析雜交方法固相雜交法：一是待測(cè)菌的DNA或RNA，二是用于檢測(cè)的已知序列DNA或片段，即探針?biāo)?、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)核酸雜交技術(shù)30四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA芯片技術(shù)DNA芯片技術(shù)是指將多達(dá)成千上萬(wàn)種的探針分子按照特定的排列方式固定在固相載體(多數(shù)采用玻片)上，組成密集的微點(diǎn)陣或陣列，利用核酸雜交原理，用已知序列的DNA分子，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，與標(biāo)記的特異性單鏈DNA或RNA分子雜交形成雙鏈，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱來判斷樣品中靶分子的數(shù)量，實(shí)現(xiàn)核酸序列的分子識(shí)別。DNA芯片技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)是可以同時(shí)、快捷、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)基因組的信息DNA芯片技術(shù)的改進(jìn)使得DNA診斷不斷小型化并具有高效率。四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)DNA芯片技術(shù)31四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)

基本原理細(xì)菌體內(nèi)有3種不同的RNA，即mRNA、rRNA和tRNA。它們分別行使著不同的功能，其中rRNA可將遺傳信息得以表達(dá)，轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)，它在所有細(xì)菌中都有一定的堿基序列和空間結(jié)構(gòu)。細(xì)菌種類不同，rRNA序列不同。原核生物的rRNA是由兩個(gè)亞基所組成：50S和30S，而30S亞基進(jìn)一步由3種類型組成，即23S、16S和5SrRNA，它們分別含有約2900、1500和120個(gè)核苷酸。16SrRNA相對(duì)分子量適中，又具有保守性和存在的普遍性等特點(diǎn)，序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)，序列分析的重現(xiàn)性極高，再加上16SrRNA可直接從DNA中轉(zhuǎn)錄而直接測(cè)序，因此，現(xiàn)在一般普遍采用16SrRNA作為序列分析對(duì)象對(duì)微生物進(jìn)行測(cè)序分析。四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)32四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)分析方法四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)33四、微生物的現(xiàn)代分類檢測(cè)技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)分析方法從樣品中分離總微生物DNAPCR擴(kuò)增16SrRNA基因片段分析將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體上進(jìn)行直接測(cè)序通過16SrRNA種屬特異性的探針與PCR產(chǎn)物雜交以獲得微生物組成信息對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行梯度凝膠電泳分析，直接觀察其多樣性對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行