轉基因動物制備的方法的課件

轉基因動物的制備方法1轉基因動物的概念轉基因動物就是指用試驗的方法將人們所需要的外源基因導入到動物體內,使這種外源基因與動物本身的染色體整合在一起,這樣外源基因就能隨著細胞的分裂而增殖,在動物體內得到表達,并且能夠穩(wěn)定遺傳給后代的動物。

轉基因動物自產(chǎn)生以來,隨著研究的不斷深入,近些年來得到了迅速的發(fā)展。由于它打破了自然繁殖中的種間隔離,使基因能在種系關系很遠的機體間流動,實現(xiàn)了動物種間遺傳物質的交換與重組,這不僅為遺傳物質的研究提供了新的手段,豐富了物種的基因庫,而且擴大了生命科學的視野。Gordon等人首次成功地將含有HSV和SV40DNA片段的重組質粒DNA以顯微注射法導入小鼠受精卵的雄原核內，得到了帶有這種外源DNA順序的TGM。1982年Palmiter等運用此法得到的所謂“超級巨鼠”,曾引起整個生物學界的轟動。2轉基因動物的制備方法

以使用較多的小鼠為例，這一方法的實驗程序如下：

⑴準備假孕母鼠（養(yǎng)母）⑵受精卵的準備⑶基因導入⑷胚胎移植⑸對幼鼠的鑒定優(yōu)點：

外源DNA大小基本不受限制(1-50kb)導入過程直觀整合率高

2.2精子載體介導法將精子反復冷凍或經(jīng)過化學物質處理后與外源DNA共同孵育,從而使外源DNA與精子結合,然后通過人工授精得到轉基因個體目前國際上極少成功模型，國內也很少有相關報道，精子載體法很少被應用。

體外受精法

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胞質內顯微注射法體外受精法是一種直接用精子作為外源DNA載體的轉基因方法,其過程是將成熟的精子與外源DNA進行預培養(yǎng),因為在一定條件下,精子核后帽區(qū)有自發(fā)結合DNA的能力,因此,精子能夠攜帶外源DNA進入受精卵,并使之受精,從而使外源DNA整合到受體染色體中而得到轉基因動物。通過一定的方法將外源基因導入到ES,外源基因通過隨機插入或者同源重組的方式整合到ES基因組中,再以顯微注射法把這種轉基因胚胎干細胞植入正常發(fā)育的囊胚中,然后將囊胚移植到受體動物的子宮內,由于胚胎干細胞參與了胚胎生殖系的發(fā)育,所以所產(chǎn)生的嵌合體其生殖細胞中一部分細胞含有目的基因,將嵌合體連續(xù)與正常動物進行交配,就會得到轉基因動物。ES細胞技術發(fā)展歷史1956年，Whitten培養(yǎng)成功小鼠的受精卵，在體外發(fā)育成囊胚；1958年，McLaren經(jīng)胚胎移植，體外培養(yǎng)的胚胎產(chǎn)生小鼠個體；1965年，Brinster建立了胚胎的微滴培養(yǎng)技術；1968年，Gardner將分離的細胞注入囊胚，獲得嵌合鼠;1970年，Steven分離成功小鼠的胚胎瘤細胞；1981年，MartinEvans從正常的小鼠囊胚中分離成功ES細胞；1984年，Bradley證實注射入囊胚的小鼠ES細胞可分化為成體的各種組織，并整合入生殖系。意義：里程碑，與同源重組技術的結合使得在整體水平定向改變和修飾哺乳動物的遺傳特性成為可能。1995年，Thomson從恒河猴中分離了猴的ES細胞；1998年，Thomson從人的囊胚中分離成功人的ES細胞；2000年，Bongso等建立了人的ES細胞株……

優(yōu)點：外源基因整合情況的可控性高?？深A先在細胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因導入ES細胞的方法多樣，細胞鑒定及篩選方便。2.4逆轉錄病毒感染法逆轉錄病毒是第一個用于基因轉移的病毒載體。將目的基因整合到逆轉錄病毒的RNA載體上,制成高滴度的病毒顆粒,人為感染著床前或著床后的胚胎,RNA病毒感染宿主細胞后反轉錄成相應的DNA,并在整合酶和其末端特殊核酸序列的作用下整合到宿主細胞的基因組中進行表達和遺傳得到轉基因動物。

與顯微注射法的比較方式顯微注射法逆轉錄病毒法DNA長度＜50kb,＜10-15kb,與時相單細胞卵4-6細胞卵移卵部位輸卵管子宮整合方式隨機，多拷貝隨機，單拷貝表達受宿主旁側的DNA影響受LTR影響易缺失傳代可以有時不可以子代嵌合體機率高

優(yōu)點：受精卵攜帶外源基因的陽性率高外源基因多單拷貝整合操作簡單，避免注射法對卵子的損害宿主范圍廣可同時感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高。缺點：

容納大小有限；重組逆轉錄病毒的長末端容易甲基化，影響外源基因的表達。2.5體細胞核移植轉基因法近年來新出現(xiàn)的一種轉基因技術?？寺【d羊“多莉(Dolly)”的誕生是轉基因動物史上的一個里程碑。先把外源基因與供體細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng),使外源基因整合到供體細胞上,然后將供體細胞的細胞核轉移到去核的卵母細胞組成重構胚胎,再把其移植到假孕母體,待其妊娠、分娩后便可得到轉基因的克隆動物。核移植技術該技術源于用微細玻璃管對阿米巴原蟲進行的核注射1938年，Spemann提出了細胞核的全能性和將分化的細胞核移植到卵母細胞的設想；1952年，Briggs和King將蛙胚胎細胞核注射導卵內，構建的重組胚胎發(fā)育成蝌蚪和蛙；1962年，Gurdon證實已分化的細胞核可恢復其全能性；1969年，開始哺乳動物的核移植研究；1981年，Illmenser和Hoppe將小鼠胚胎內細胞團的細胞核植入去核的受精卵中，克隆出3只小鼠；1986年，Willadsen等用未分化的胚胎細胞克隆出一只核移植綿羊；1987年，Robl用胚胎細胞克隆出核移植羊；1997年，Wilmut用成年綿羊的乳腺上皮細胞為核供體，克隆出綿羊Dolly。

優(yōu)點：對體細胞進行基因改造后，用于核移植可以提高轉基因的效率，不僅具有“ES細胞途徑”的全部優(yōu)點，且物種適用面廣，無需經(jīng)過嵌合體育種就可獲得純合個體，周期短，效率高。

缺點：技術上難度大，成功率極低，胚胎死亡率高，非一般實驗室可以開展。2.6人工酵母染色體(YAC)法近年來發(fā)展起來的新型載體,具有克隆百萬堿基對的大片段外源DNA的能力,可以保證巨大基因的完整性。主要途徑有:①胚胎干細胞轉入YAC后體外篩選,陽性胚胎干細胞囊胚腔注射;②YAC原核注射。

優(yōu)點：保證大片段ＤＮＡ的完整性。

保證較長外源片段在轉基因動物研究中的整合率提高。

保證了目的基因上下游的側翼序列的完整性，因而可以消除或減弱基因整合后的位置效應。

ＹＡＣ介導法制備轉基因動物具有廣闊的應用前景。

除上述幾種常用的轉基因方法外，人們?yōu)榱诉m應于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。例如誘變技術(P265)等，這些方法都不太成熟，其應用也正被人們驗證。參考文獻[1]耿彩霞,狄冉,儲明星.轉基因動物的制備方法及應用評述.中國畜牧獸醫(yī),2010,37(6).[2]韓堃,劉東軍.細胞核移植技