實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用注意事項適合菜鳥入門課件

匯報人：朱林林2011/03/25實時熒光定量PCR技術(shù)

1目錄實時熒光定量PCR基本原理實時熒光定量PCR的實驗設(shè)計實時熒光定量PCR兩種相對定量方法比較實時熒光定量PCR誤差分析及操作規(guī)范實驗中污染的防控?zé)晒舛縋CR報告模板目錄實時熒光定量PCR基本原理2實時熒光定量PCR基本原理實時熒光定量PCR基本原理3常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析。定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板進(jìn)行定量分析。常規(guī)vs實時常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析。4優(yōu)缺點比較優(yōu)缺點比較5定量PCR三個基本概念(1)擴增曲線PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過程中熒光強度為縱坐標(biāo)所做的曲線。定量PCR三個基本概念(1)擴增曲線6定量PCR三個基本概念(2)閾值的概念在熒光定量PCR擴增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強度與其本底熒光強度的差值全部相同。定量PCR三個基本概念(2)閾值的概念7定量PCR三個基本概念(3)CT值PCR過程中，各樣品擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時，所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。定量PCR三個基本概念(3)CT值8C(t)與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)與初始模板濃度的對數(shù)值成線性關(guān)系熒光強度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210C(t)與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小熒光強度9熒光定量PCR的定量原理濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)（Ct值）就可分析樣品中起始模板量。熒光定量PCR的定量原理濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)10熒光定量PCR的化學(xué)原理化學(xué)方法分類非特異性SYBRGreenI法特異性TaqMan探針法熒光定量PCR的化學(xué)原理化學(xué)方法分類11SYBRGreenI法原理：結(jié)合雙鏈DNA分子小溝延伸結(jié)束，形成雙鏈DNA，SYBRGreen結(jié)合到雙螺旋小溝中，當(dāng)受到適合光源激發(fā)，發(fā)射出熒光，反映產(chǎn)物濃度優(yōu)點使用方便，無需復(fù)雜的設(shè)計成本較低缺點與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，無模板特異性試驗方法較難優(yōu)化靈敏度低GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBRGreenI法原理：結(jié)合雙鏈DNA分子小溝GTT12實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用注意事項適合菜鳥入門課件13SYBRGreenI法溶解曲線分析SYBRGreenI法溶解曲線分析14熒光染料的特點及應(yīng)用(1)、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強度與雙鏈核酸的含量及長度成正比，因此本底較高；(2)、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；(3)、SYBRGreenⅠ染料本身價格便宜，但是做熒光定量PCR時對引物設(shè)計的要求很高；對Taq酶要求較高，最好是HotStarTaq酶，或者操作時需要嚴(yán)格的冷啟動，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴增會嚴(yán)重干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是模板含量較低時；(4)、適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；(5)、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。(6)、對PCR反應(yīng)的毒性，能抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)的效率。熒光染料的特點及應(yīng)用(1)、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后15TaqMan探針法水解型報告基團，淬滅基團FRET（熒光諧振能量傳遞）識別特異性產(chǎn)物優(yōu)點特異性高，可準(zhǔn)確定量靈敏度高設(shè)計不同標(biāo)記的探針，可進(jìn)行多重檢測缺點一個探針只適用于一個目標(biāo)價格較高探針設(shè)計較繁瑣TaqMan探針法水解型16實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用注意事項適合菜鳥入門課件17TaqMan作用機理TaqMan作用機理18兩種化學(xué)的比較兩種化學(xué)的比較19實時熒光定量PCR的實驗設(shè)計實時熒光定量PCR的實驗設(shè)計20絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應(yīng)的模板濃度（DNA，RNA）相對定量：計算初始反應(yīng)模板的相對含量絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應(yīng)的模板濃度（D21定量PCR--絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線已知濃度的相應(yīng)DNA模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實時PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行PCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)值定量PCR--絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線22定量PCR--相對定量相對定量的目的比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）相對定量的問題樣品材料不均一造成的差別內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)要相對恒定，表達(dá)不受處理因素影響）對目的基因進(jìn)行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的誤差定量PCR--相對定量相對定量的目的23實時熒光定量PCR兩種相對定量方法比較相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法和2-ΔΔc(t)

法實時熒光定量PCR兩種相對定相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法和2-ΔΔc(t)24相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線處理與未處理樣品同時擴增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因，獲得C(t)值用內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ繕?biāo)基因均一化處理樣本與未處理樣本目標(biāo)基因C(t)值經(jīng)內(nèi)參基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理樣本的表達(dá)差異相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線25適用范圍目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴增效率差異較大擴增效率較低適用范圍目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴增效率差異較大262-ΔΔc(t)

法前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)

1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、計算表達(dá)水平比率：

2–ΔΔCT=表達(dá)量的比值當(dāng)有多個樣品時（如時間點），各樣品均一化后都與同一時間點相比2-ΔΔc(t)法前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近127一般步驟選定目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因設(shè)計一步法或兩步法RT-PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)獲得及處理目標(biāo)基因C(t)值內(nèi)標(biāo)基因C(t)值計算2-ΔΔc(t)

作圖一般步驟選定目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因28適用范圍當(dāng)擴增效率較高，且目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴增效率比較一致不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，高通量檢測適用范圍當(dāng)擴增效率較高，且目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴增效率比較一致29實時熒光定量PCR誤差分析及操作規(guī)范實時熒光定量PCR誤差分析301、誤差分析（1）、實驗方案本身的誤差熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會引起誤差；

2-△△CT法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會引起誤差；

Taqman探針法誤差相對較??；雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法誤差相對較小。（2）、儀器設(shè)備引起的誤差測量標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度時，分光光度計的誤差，從光密度值到質(zhì)量再到摩爾量，誤差本身就很大；定量PCR儀的誤差，耗材引起的誤差，96空板封口膜透光性的差異等1、誤差分析（1）、實驗方案本身的誤差31（3）、相對定量時內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差（4）、操作引起的誤差樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤差。（3）、相對定量時內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差322、操作規(guī)范熒光定量PCR是一項對操作要求很高的實驗，同時又是花費很高的一項實驗，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。要想達(dá)到這個目標(biāo)，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。2、操作規(guī)范熒光定量PCR是一項對操作要求很高的實驗，同33（1）、樣品的處理及選取處理樣品時，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測定一種藥物到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白鼠攝食；選取試驗樣品時，要保證選取的組織盡可能的純，不要污染其他組織，如選取脾臟組織時，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié)締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。（1）、樣品的處理及選取34（2）、核酸提取加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計檢測核算質(zhì)量，RNAOD260/280＝2.0左右，DNAOD260/280＝1.8左右，最好再做電泳檢測；同一樣品要提取2到3個RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。（3）、得到的RNA立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA要用看家基因檢測。（2）、核酸提取35（4）、對于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。（5）、做定量PCR時，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到PCR管中，分裝時盡量采用排槍，加樣時盡量最好采用排槍。（6）、體系中最好摻入ROX參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。（4）、對于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織36（7）、重復(fù)操作讓重復(fù)操作最大的修正偏差。最有意義的重復(fù)是在提取樣品RNA時就重復(fù)，同一個樣品，分別提取3份RNA，3份RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所得的3份cDNA都做定量PCR檢測，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因為我們是把RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、上機檢測三步做了重復(fù)，這樣得出的平均值要比只在上機檢測時對同一cDNA樣品做三個重復(fù)要有意義的多。

同一個cDNA樣品做三個重復(fù)定量檢測求平均值主要是消除加樣時的誤差，排槍加樣時，誤差很小，加樣時的誤差可以通過設(shè)幾個重復(fù)檢測出來。（7）、重復(fù)操作37同一cDNA樣品的三個重復(fù)同一cDNA樣品的三個重復(fù)38模板濃度越低，染料法的誤差越大。如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們在擴增曲線上的CT值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個濃度低的樣品CT值明顯提前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。模板濃度越低，染料法的誤差越大。如圖一系列梯度稀釋的模板，理39實驗中污染的防控實驗中污染的防控401、熒光定量PCR實驗中污染源的分析（1）、PCR產(chǎn)物引起的污染在檢測過程中，熒光定量PCR產(chǎn)物都是封閉在PCR管中的，不存在開管檢測，所以有污染的話，最有可能是因為電泳檢測熒光定量PCR產(chǎn)物時引起的污染，只要將電泳室與PCR加樣室隔離開，就能有效的避免PCR產(chǎn)物的污染。1、熒光定量PCR實驗中污染源的分析（1）、PCR產(chǎn)物引起的41（2）、標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染常用的標(biāo)準(zhǔn)品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的PCR產(chǎn)物等，由于標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過程中，有可能引起污染。（2）、標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染42（3）、高濃度的樣品引起的污染高濃度的陽性樣品在加樣過程中可能會形成氣溶膠，造成污染。（3）、高濃度的樣品引起的污染432、熒光定量PCR實驗中污染的防控（1）、對于PCR產(chǎn)物引起的污染最簡單有效地辦法就是將電泳室與加樣室徹底隔離開，做到每個房間都有專屬的移液器，做到移液器專用；或者采用dU代替dT配合UNG酶，是解決PCR產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。2、熒光定量PCR實驗中污染的防控（1）、對于PCR產(chǎn)物引起44（2）、對于標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染目前只能是以預(yù)防，加標(biāo)準(zhǔn)品時最好采用專用移液器，不要和加樣的移液器交叉使用，加標(biāo)準(zhǔn)品時最好在通風(fēng)廚中進(jìn)行，和加樣的操作臺隔離開。（2）、對于標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染45（3）、對于樣品間的檢查污染樣品間的交叉污染往往是因為高濃度的樣品在加樣室形成了氣溶膠，因為樣品的cDNA鏈較長，經(jīng)常開紫外燈，把長鏈cDNA打斷，能有效避免此類污染的發(fā)生，另外保持加樣室空氣流通也有助于防止此類污染。（3）、對于樣品間的檢查污染46（4）、對于未知污染源的頑固的污染的防控這類污染也經(jīng)常出現(xiàn)，找不到明確的污染源，而且此類污染又非常頑固，對于這種情況，最好的辦法就是不去管它，在采用絕對定量和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法時，污染的初始模板量可由陰性對照檢測出來，知道了污染的初始模板量后，我們可以把測得樣品的初始模板量減去污染的初始模板量，在分析時就避免了污染造成的誤差。（4）、對于未知污染源的頑固的污染的防控47圖中最后一個樣品為陰性對照，本來應(yīng)該是一直線，但是儀器也檢測到了熒光信號圖中最后一個樣品為陰性對照，本來應(yīng)該是一直線，但是儀器也檢測48電泳結(jié)果顯示，該陰性對照確實有PCR產(chǎn)物出現(xiàn)電泳結(jié)果顯示，該陰性對照確實有PCR產(chǎn)物出現(xiàn)49通過定量PCR檢測，測得該陰性樣品中含有227個初始模板。假如這個污染屬于是頑固的未知污染，可以用正常樣品測得的初始模板量減去227，來避免污染引起的誤差通過定量PCR檢測，測得該陰性樣品中含有227個初始模板。假50熒光定量PCR報告模板熒光定量PCR報告模板51

匯報人：朱林林2011/03/25實時熒光定量PCR技術(shù)

52目錄實時熒光定量PCR基本原理實時熒光定量PCR的實驗設(shè)計實時熒光定量PCR兩種相對定量方法比較實時熒光定量PCR誤差分析及操作規(guī)范實驗中污染的防控?zé)晒舛縋CR報告模板目錄實時熒光定量PCR基本原理53實時熒光定量PCR基本原理實時熒光定量PCR基本原理54常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析。定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板進(jìn)行定量分析。常規(guī)vs實時常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析。55優(yōu)缺點比較優(yōu)缺點比較56定量PCR三個基本概念(1)擴增曲線PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過程中熒光強度為縱坐標(biāo)所做的曲線。定量PCR三個基本概念(1)擴增曲線57定量PCR三個基本概念(2)閾值的概念在熒光定量PCR擴增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強度與其本底熒光強度的差值全部相同。定量PCR三個基本概念(2)閾值的概念58定量PCR三個基本概念(3)CT值PCR過程中，各樣品擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時，所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。定量PCR三個基本概念(3)CT值59C(t)與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)與初始模板濃度的對數(shù)值成線性關(guān)系熒光強度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210C(t)與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小熒光強度60熒光定量PCR的定量原理濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)（Ct值）就可分析樣品中起始模板量。熒光定量PCR的定量原理濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)61熒光定量PCR的化學(xué)原理化學(xué)方法分類非特異性SYBRGreenI法特異性TaqMan探針法熒光定量PCR的化學(xué)原理化學(xué)方法分類62SYBRGreenI法原理：結(jié)合雙鏈DNA分子小溝延伸結(jié)束，形成雙鏈DNA，SYBRGreen結(jié)合到雙螺旋小溝中，當(dāng)受到適合光源激發(fā)，發(fā)射出熒光，反映產(chǎn)物濃度優(yōu)點使用方便，無需復(fù)雜的設(shè)計成本較低缺點與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，無模板特異性試驗方法較難優(yōu)化靈敏度低GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBRGreenI法原理：結(jié)合雙鏈DNA分子小溝GTT63實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用注意事項適合菜鳥入門課件64SYBRGreenI法溶解曲線分析SYBRGreenI法溶解曲線分析65熒光染料的特點及應(yīng)用(1)、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強度與雙鏈核酸的含量及長度成正比，因此本底較高；(2)、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；(3)、SYBRGreenⅠ染料本身價格便宜，但是做熒光定量PCR時對引物設(shè)計的要求很高；對Taq酶要求較高，最好是HotStarTaq酶，或者操作時需要嚴(yán)格的冷啟動，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴增會嚴(yán)重干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是模板含量較低時；(4)、適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；(5)、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。(6)、對PCR反應(yīng)的毒性，能抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)的效率。熒光染料的特點及應(yīng)用(1)、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后66TaqMan探針法水解型報告基團，淬滅基團FRET（熒光諧振能量傳遞）識別特異性產(chǎn)物優(yōu)點特異性高，可準(zhǔn)確定量靈敏度高設(shè)計不同標(biāo)記的探針，可進(jìn)行多重檢測缺點一個探針只適用于一個目標(biāo)價格較高探針設(shè)計較繁瑣TaqMan探針法水解型67實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用注意事項適合菜鳥入門課件68TaqMan作用機理TaqMan作用機理69兩種化學(xué)的比較兩種化學(xué)的比較70實時熒光定量PCR的實驗設(shè)計實時熒光定量PCR的實驗設(shè)計71絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應(yīng)的模板濃度（DNA，RNA）相對定量：計算初始反應(yīng)模板的相對含量絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應(yīng)的模板濃度（D72定量PCR--絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線已知濃度的相應(yīng)DNA模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實時PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行PCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)值定量PCR--絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線73定量PCR--相對定量相對定量的目的比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）相對定量的問題樣品材料不均一造成的差別內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)要相對恒定，表達(dá)不受處理因素影響）對目的基因進(jìn)行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的誤差定量PCR--相對定量相對定量的目的74實時熒光定量PCR兩種相對定量方法比較相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法和2-ΔΔc(t)

法實時熒光定量PCR兩種相對定相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法和2-ΔΔc(t)75相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線處理與未處理樣品同時擴增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因，獲得C(t)值用內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ繕?biāo)基因均一化處理樣本與未處理樣本目標(biāo)基因C(t)值經(jīng)內(nèi)參基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理樣本的表達(dá)差異相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線76適用范圍目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴增效率差異較大擴增效率較低適用范圍目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴增效率差異較大772-ΔΔc(t)

法前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)

1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、計算表達(dá)水平比率：

2–ΔΔCT=表達(dá)量的比值當(dāng)有多個樣品時（如時間點），各樣品均一化后都與同一時間點相比2-ΔΔc(t)法前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近178一般步驟選定目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因設(shè)計一步法或兩步法RT-PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)獲得及處理目標(biāo)基因C(t)值內(nèi)標(biāo)基因C(t)值計算2-ΔΔc(t)

作圖一般步驟選定目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因79適用范圍當(dāng)擴增效率較高，且目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴增效率比較一致不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，高通量檢測適用范圍當(dāng)擴增效率較高，且目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴增效率比較一致80實時熒光定量PCR誤差分析及操作規(guī)范實時熒光定量PCR誤差分析811、誤差分析（1）、實驗方案本身的誤差熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會引起誤差；

2-△△CT法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會引起誤差；

Taqman探針法誤差相對較小；雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法誤差相對較小。（2）、儀器設(shè)備引起的誤差測量標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度時，分光光度計的誤差，從光密度值到質(zhì)量再到摩爾量，誤差本身就很大；定量PCR儀的誤差，耗材引起的誤差，96空板封口膜透光性的差異等1、誤差分析（1）、實驗方案本身的誤差82（3）、相對定量時內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差（4）、操作引起的誤差樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤差。（3）、相對定量時內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差832、操作規(guī)范熒光定量PCR是一項對操作要求很高的實驗，同時又是花費很高的一項實驗，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。要想達(dá)到這個目標(biāo)，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。2、操作規(guī)范熒光定量PCR是一項對操作要求很高的實驗，同84（1）、樣品的處理及選取處理樣品時，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測定一種藥物到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白鼠攝食；選取試驗樣品時，要保證選取的組織盡可能的純，不要污染其他組織，如選取脾臟組織時，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié)締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。（1）、樣品的處理及選取85（2）、核酸提取加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計檢測核算質(zhì)量，RNAOD260/280＝2.0左右，DNAOD260/280＝1.8左右，最好再做電泳檢測；同一樣品要提取2到3個RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。（3）、得到的RNA立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA要用看家基因檢測。（2）、核酸提取86（4）、對于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。（5）、做定量PCR時，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到PCR管中，分裝時盡量采用排槍，加樣時盡量最好采用排槍。（6）、體系中最好摻入ROX參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。（4）、對于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織87（7）、重復(fù)操作讓重復(fù)操作最大的修正偏差。最有意義的重復(fù)是在提取樣品RNA時就重復(fù)，同一個樣品，分別提取3份RNA，3份RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所得的3份cDNA都做定量PCR檢測，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因為我們是把RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、上機檢測三步做了重復(fù)，這樣得出的平均值要比只在上機檢測時對同一cDNA樣品做三個重復(fù)要有意義的多。

同一個cDNA樣品做三個重復(fù)定量檢測求平均值主要是消除加樣時的誤差，排槍加樣時，誤差很小，加樣時的誤差可以通過設(shè)幾個重復(fù)檢測出來。（7）、重復(fù)操作88同一cDNA樣品的三個重復(fù)同一cDNA樣品的三個重復(fù)89模板濃度越低，染料法的誤差越大。如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們在擴增曲線上的CT值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個濃度低的樣品CT值明顯提前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。模板濃度越低，染料法的誤差越大。如圖一系列梯度稀釋的模板，理90實驗