固相膜免疫測定

關(guān)于固相膜免疫測定第一頁，共二十八頁，2022年，8月28日第十一章固相膜免疫分析技術(shù)第二頁，共二十八頁，2022年，8月28日掌握：免疫印跡試驗熟悉：膠體金免疫技術(shù)的方法學(xué)種類與原理了解：膠體金與免疫金的制備、其他膜載體免疫分析技術(shù)第三頁，共二十八頁，2022年，8月28日一概述二免疫層析試驗三免疫滲濾試驗四斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗五免疫印跡試驗六影響固相膜免疫試驗的主要因素七固相膜免疫分析技術(shù)的臨床應(yīng)用第四頁，共二十八頁，2022年，8月28日概述固相膜免疫分析技術(shù)

(solidphasemembrane-basedimmunoassay)特點:以微孔膜作為固相載體

多孔性,

非共價鍵高度吸附抗原或抗體易于漂洗第五頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫層析試驗

免疫層析試驗原理：以NC膜等為固相載體，樣品溶液借助毛細作用在層析條上泳動，同時樣品中的待測物與層析材料上待測物的受體（抗原或抗體）發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)，層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域，通過目測或儀器檢測標記物，在短時間內(nèi)得到直觀的實驗結(jié)果。

第六頁，共二十八頁，2022年，8月28日毛細作用是指浸潤液體在細管里升高的現(xiàn)象和不浸潤液體在細管里降低的現(xiàn)象第七頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫層析試驗

免疫層析試驗分為：膠體金免疫層析試驗（ICA）熒光免疫層析試驗（GICA）

第八頁，共二十八頁，2022年，8月28日

二、測定模式

（一）膠體金免疫層析試驗1、雙抗體夾心法測抗原2、競爭法測小分子抗原3、間接法測抗體

第九頁，共二十八頁，2022年，8月28日膠體金免疫層析試驗AGCB雙抗體夾心法測大分子抗原（陽性，2個條帶）第十頁，共二十八頁，2022年，8月28日膠體金免疫層析試驗AGCB競爭法測小分子抗原（陰性，2個條帶）第十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日

三技術(shù)要點操作要點：（1）將試劑條標記線一端浸入待測標本中2-5s,或在標本加樣處加一定量待檢標本,平放于水平桌面上（2）在5-20分鐘內(nèi)觀察結(jié)果結(jié)果判斷夾心法：陰性:1條棕紅色指控條帶陽性:出現(xiàn)2條棕紅色條帶

無棕紅色條帶出現(xiàn)為試劑失效競爭法：陰性:出現(xiàn)2條棕紅色條帶。陽性:1條棕紅色指控條帶第十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日

第三節(jié)免疫滲濾試驗1原理在硝酸纖維素膜為載體并包被了抗原或抗體的滲濾裝置中，依次滴加標本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜貼置于吸水材料上故溶液流經(jīng)滲濾裝置時與膜上的抗原或抗體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達到檢測目的。2方法類型雙抗體夾心法測抗原間接法測特異性抗體第十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日三、試劑盒組成和技術(shù)要點

①滲濾裝置②膠體金標志物③洗滌液④Ag參照品第十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日技術(shù)要點：1、平放反應(yīng)板，于小孔內(nèi)滴加含待測Ag標本1-2滴，與膜上的Ab反應(yīng)而結(jié)合在膜上2、于小孔內(nèi)滴加膠體金標記Ab試劑1-2滴，使膠體金標記Ab與結(jié)合在膜上的Ag反應(yīng)3、于小孔內(nèi)滴加洗滌液2-3滴，待完全滲入，洗去未結(jié)合的膠體金標記Ab。4、結(jié)果觀察：陽性膜中央有淡紅色或紅色斑點

第十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日第四節(jié).斑點酶免疫吸附試驗(Dot-ELISA)第十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日技術(shù)要點：1、抗原包被NC膜吸附力強，包被后封閉。2、抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)后再加二抗3、確定酶結(jié)合物最佳稀釋度陰性樣品不顯色，陽性顯色最強時的酶結(jié)合物稀釋度4、顯色反應(yīng)pH值時反應(yīng)最靈敏強陽性藍黑色斑點

弱陽性淡綠色半點第十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日方法學(xué)評價：1、NC吸附力強，靈敏度較ELISA高6～8倍；2、可同時檢測多種抗體；3、操作簡便不需特殊儀器設(shè)備4、吸附抗原（抗體）或已有結(jié)果的NC膜可長期保存，不影響期活性。第十八頁，共二十八頁，2022年，8月28日

第五節(jié).免疫印跡試驗

（immunoblottest,IBT）免疫印跡試驗

將凝膠電泳的高分辨率與抗原抗體反應(yīng)的高特異性結(jié)合.又稱Westernblot.是檢測蛋白質(zhì)特性、表達及分布的一種最常用的方法。蛋白免疫印跡試驗重組免疫印跡試驗第十九頁，共二十八頁，2022年，8月28日

二Westernblot技術(shù)要點:1.抗原印跡與包被①（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳）②電轉(zhuǎn)移2.抗原抗體反應(yīng)（間接法）3.檢測動畫第二十頁，共二十八頁，2022年，8月28日SDS

抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）第二十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日電轉(zhuǎn)移

將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1-2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此分階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。第二十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日酶免疫定位將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)