常見生理測定用方法

常見生理指標(biāo)測定用方法--SOD、POD、CAT、可溶性蛋白、葉綠素、電導(dǎo)率、可溶性糖、MDA、脯氨酸、葉片含水量SOD酶液可用于SOD、POD、CAT、可溶性蛋白指標(biāo)的測定，即POD、CAT、可溶性蛋白三個(gè)指標(biāo)不用再取葉片。SOD酶液的提取。每個(gè)重復(fù)稱取去葉脈的葉片組織約0.25g。剪碎放入預(yù)先冷卻好的研缽中，加入少量（2-3ml，因總體積只有9ml，還要沖洗2次）的磷酸緩沖液（0.05mol/L，PH=7.8）（不加PVP）研磨成勻漿，然后倒入10ml的帶刻度的塑料離心管中（預(yù)先洗好晾干），并用此磷酸緩沖液定容到9ml。在3000轉(zhuǎn)，4°C高速離心機(jī)（提前4°C預(yù)冷一下，設(shè)好4°C后提前空轉(zhuǎn)運(yùn)行一下）中離心15分鐘，將提取的酶液放入置有冰袋的塑料盒中，低溫保存，備用。宜用酶液將4個(gè)指標(biāo)當(dāng)天測完，切記。實(shí)驗(yàn)一氮藍(lán)四唑（NBT）法測定SOD活力（優(yōu)先1-用材0.25g）實(shí)驗(yàn)原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶，它的反應(yīng)產(chǎn)物可由過氧化氫酶進(jìn)一步分解或被過氧化物酶利用。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除超氧陰離子自由基，從而抑制甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料葉片。（二）儀器設(shè)備高速臺(tái)式離心機(jī)，分光光度計(jì)，微量進(jìn)樣器（要注意測試一下是否準(zhǔn)確，用玻璃移液管來對(duì)比），熒光燈（反應(yīng)試管處照度為4000lx），我們用的光照培養(yǎng)箱，33%的光照下，上數(shù)第二個(gè)架子中間位置為4000lx。試管。（三）試劑（1）0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）。注：PBS（磷酸緩沖液）配制母液：A液：0.2mol/LNa2HPO4溶液：Na2HPO4.12H2O71.63g定容至1000ml;（計(jì)算步驟：358.14*0.2=71.628g）B液：0.2mol/LNaH2PO4溶液：NaH2PO4.2H2O31.20g定容至1000ml;（計(jì)算步驟：156.01*0.2=31.202g）0.05mol/LpH=7.8PBS：A液取114.38ml，B液取10.63ml，將A與B液混合并用蒸餾水定容至500ml.（詳見李合生版《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》P267）（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用0.05mol/LPBS定容至100ml。（3）750pmol/L氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.0613g（精確到最后一位，相差不要超0.0003g）NBT用磷酸緩沖液定容至100ml,4°C冰箱中，置于棕色瓶中避光保存。（4）100pmol/LEDTA-Na2溶液稱取0.0372gEDTA-Na2，用0.05mol/LPBS磷酸緩沖液定容至1000ml。（5）20pmol/L核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml。（注：核黃素現(xiàn)用現(xiàn)配，不用時(shí)嚴(yán)格避光保存，放在棕色瓶中，切記）實(shí)驗(yàn)步驟1）酶液提取稱取去葉脈的葉片組織約0.2500g（精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位），剪碎放入預(yù)先冷卻好的研缽中，加入少量的磷酸緩沖液（0.05mol/L,pH=7.8）（不加PVP）研磨成勻漿，然后倒入10ml的離心管（帶刻度）中，并用此磷酸緩沖液定容到9ml。在3000r/min，4C高速離心機(jī)中離心15分鐘（離心務(wù)必澄清，否則再離一次），將提取的酶液放入冰箱中，4C低溫保存。2）反應(yīng)混合液的配置（根據(jù)測定樣品現(xiàn)配，如50或100個(gè)樣品用量）每支試管中各溶液顯色反應(yīng)用量：0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8），1.5ml；130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液，0.3ml；750pmol/L氮藍(lán)四唑溶液，0.3ml；100pmol/LEDTA-Na2溶液，0.3ml；蒸餾水，0.10ml；以上總計(jì)2.50ml。根據(jù)樣品的量配制反應(yīng)混合液。3）顯色反應(yīng)取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支為測定管，另2支為對(duì)照管，每支加入2.50ml的反應(yīng)混合液，然后向?qū)φ展苤屑尤?.20ml（200pl）的0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）；向測定管管中加入0.20ml（200pl,酶液用量可以調(diào)整，夏枯草采用200pl）的酶液，然后再迅速向四支試管中分別加0.3ml的20pmol/L核黃素溶液?；靹蚝髮?支對(duì)照管置暗處，其他各管于4000lx日光下（置于2#209實(shí)驗(yàn)室靠門側(cè)光照培養(yǎng)箱由上往下第二層正中心位置，33%光照度）反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，溫度高，時(shí)間縮短，低時(shí)延長）。注：反應(yīng)結(jié)束應(yīng)立即測定，以防數(shù)值出現(xiàn)較大偏頗。4)SOD活性測定反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對(duì)照管作空白，在560nm處，分別測定其他各管的吸光度(在測定中測定管與吸收管應(yīng)該比對(duì)照管的吸光度值降低)。結(jié)果計(jì)算已知SOD活性單位以抑制NBT光還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。式中：SOD總活性以每克樣品鮮質(zhì)量酶單位表示(U/g)，Ack為對(duì)照管的吸光度Ae為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積；VT為測定時(shí)樣品用量(mL)；W為葉片的鮮重(g)。實(shí)驗(yàn)二過氧化物酶POD活性的測定(優(yōu)先1-用材0.25g，同SOD酶液)實(shí)驗(yàn)原理在過氧化物酶POD的催化下，過氧化氫將愈創(chuàng)木酚氧化為茶褐色產(chǎn)物，此產(chǎn)物在470nm有最大光吸收，因此測定470nm的吸光度變化就可得到過氧化物酶的活性。材料、儀器設(shè)備及試劑材料新鮮芍藥葉片儀器設(shè)備722型分光光度計(jì)，離心機(jī)，研缽，容量瓶試劑0.05mol/L，pH=6.0的磷酸緩沖液(用于反應(yīng)混合液的配制)注：PBS(磷酸緩沖液)配制母液：A液：0.2mol/LNa2HPO4溶液：Na2HPO4.12H2O71.62g定容至1000ml;B液：0.2mol/LNaH2PO4溶液：NaH2PO4.2H2O31.2g定容至1000ml;0.05mol/LpH=6PBS:A液取15.375ml，B液取109.6ml，將A與B液混合并用蒸餾水定容至500ml(詳見李合生版《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》P267)。愈創(chuàng)木酚30%過氧化氫實(shí)驗(yàn)步驟(1)取兩支試管，一只為對(duì)照管，一只為試驗(yàn)管。將提取的SOD酶液取1ml加入到實(shí)驗(yàn)管中，對(duì)照管加1ml蒸餾水。將兩支試管都放在室內(nèi)自然上升至室

溫(約25攝氏度，最好當(dāng)天測完)。(2)然后在對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管中分別加入3ml反應(yīng)混合液(反應(yīng)混合液包括：0.05mol/L，pH=6.0的磷酸緩沖液100ml，加愈創(chuàng)木酚56叫，待加熱完全溶解后，看不到有愈創(chuàng)木酚液滴方行。然后冷卻至室溫，加入30%過氧化氫38叫，以防H2O2分解)。然后搖勻，立即在470nm測定POD的活性(在測定中吸光值應(yīng)該不斷升高)。結(jié)果計(jì)算以每分鐘AA470變化0.01為一個(gè)POD活性單位(U)尸OQ活性[U/(g-min)]=AAxV470TWxVsx0.01xt式中：AA470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；VT為提取酶液總體積(mL)；VS為測定時(shí)所用酶液體積(mL)；W尸OQ活性[U/(g-min)]=實(shí)驗(yàn)三過氧化氫酶CAT測定(優(yōu)先1-用材0.25g，同SOD酶液)

(要用752S測定)實(shí)驗(yàn)原理過氧化氫在240nm下有強(qiáng)烈吸收，但過氧化氫酶可分解過氧化氫使反應(yīng)溶液吸光度發(fā)生改變，可根據(jù)測定吸光度的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。方法參考：趙世杰與蒼晶的書：植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(230頁)。材料、儀器設(shè)備及試劑材料新鮮植物葉片儀器設(shè)備752S型紫外可見分光光度計(jì)，離心機(jī)，研缽，容量瓶試劑0.2mol/L磷酸緩沖液(PH=7.8，0.05mol/L)30%過氧化氫過氧化氫(0.1mol/L)30%過氧化氫的摩爾濃度為9.8mol/L(1.11*1000*0.30/34=9.79mol/L)，0.1mol/L過氧化氫配制：1.02ml30%過氧化氫稀釋到100ml蒸餾水中。實(shí)驗(yàn)步驟酶液提取采用前SOD酶液酶活性測定用0.2mol/LpH7.8的磷酸緩沖液(PBS)調(diào)零。對(duì)照管(S0)：0.2ml的酶液(預(yù)先在沸水中放1分鐘，以煮死酶液，煮時(shí)用保鮮膜密封），冷卻后，再加1.5mlpH7.8的0.2mol/L磷酸緩沖液（PBS）,再加1ml的蒸餾水與0.3ml0.1mol/L的過氧化氫。測定管（S1與S2，兩個(gè)重復(fù)）：0.2ml的酶液（未煮死酶液，），加1.5mlpH7.8的0.2mol/L磷酸緩沖液（PBS），再加1ml的蒸餾水，加入0.3ml0.1mol/L的過氧化氫后立即計(jì)時(shí)，迅速倒入石英比色杯中，在波長240nm下測定吸光值，每隔1分鐘讀數(shù)1次，測定3分鐘。待3支管全部測定完后，代入公式，計(jì)算酶活性。結(jié)果計(jì)算。以1分鐘內(nèi)A240減少0.1的酶時(shí)為1個(gè)酶活單位（U）。過氧化氫酶活性=（AA240xVt）/（0.1xV1xtxW）△A240=ASo-（AS1+As2）/2Aso：加入煮死酶液的對(duì)照管的吸光值；As1與As2為2個(gè)樣品測定管的吸光度值；Vt為酶液總體積，ml（我們的體系為9ml）；V1為測定用酶液體積，ml（0.2ml）;W為樣品鮮重，g；0.1為A240每下降0.1為1個(gè)酶活性單位，U；t為加過氧化氫到最后一次讀數(shù)的時(shí)間，min（3min）。實(shí)驗(yàn)四抗壞血酸過氧化物酶（APX）活力測定（優(yōu)先1-用材0.25g，同SOD酶液，要用752S測定）（紫外比色法）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)和掌握用分光光度法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活力的方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】抗壞血酸過氧化物酶（APX）是葉綠體中專一清除H2O2的酶，它催化還原型抗壞血酸（AsA）與H2O2反應(yīng)，使AsA氧化成單脫氫抗壞血酸（MDAsA）。因此，在酶提取液中加入AsA,可測定APX活性。隨著AsA被氧化，溶液的OD290值下降，根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)OD290的減少值，計(jì)算APX活性。【實(shí)驗(yàn)器材與試劑】實(shí)驗(yàn)材料：水稻等植物葉片。實(shí)驗(yàn)試劑:50mmol/LpH7.0磷酸緩沖液（附表2）母液：A液：0.2mol/LNa2HPO4溶液：Na2HPO4.12H2O71.62g定容至1000ml;B液：0.2mol/LNaH2PO4溶液：NaH2PO4.2H2O31.2g定容至1000ml;0.05mol/LpH=7.0PBS：A液取125*0.61=76.25ml，B液取125*0.39=48.75ml，將A與B液混合并用蒸餾水定容至500ml（詳見李合生版《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》P267）。15mmol/LAsA溶液（稱52.896mg抗壞血酸，用蒸餾水配成20mL溶液），0.3mmol/LH0.3mmol/LH2O2（吸取30l30%H2O2,配置成10mL，得30mmol/LH2O2,吸取該溶液1mL，配成100mL，即為0.3mmol/LH2O2）。實(shí)驗(yàn)儀器：紫外分光光度計(jì)、分析天平、冰凍離心機(jī)、微量進(jìn)樣器、研缽等?！緦?shí)驗(yàn)步驟】酶液的配置采用SOD酶液。酶活性的測定在3mL反應(yīng)體系中，加入50mmol/LpH7.0磷酸緩沖液1.8mL，15mmol/LAsA0.1mL，酶液0.1mL，0.3mmol/LH2O21mL。以不加酶液（以磷酸緩沖液代替）為空白，測定3min內(nèi)OD290變化。以一分鐘內(nèi)OD290減少0.01定義為一個(gè)酶活力單位（1U）。結(jié)果計(jì)算APX活性（U?min-1?g-iFW）=AA290xV1/（0.01xV2xtxW）式中：AOD290--在一段時(shí)間內(nèi)OD290的變化量；V1--提取酶液總體積（mL）；V2--測定用酶液體積（mL）；t--反應(yīng)時(shí)間（min）；W--樣品鮮重（g）。測得樣品中蛋白質(zhì)含量后，APX活性也可以用“U-min-1-mg-i蛋白質(zhì)”表示。實(shí)驗(yàn)五可溶性蛋白的測定（優(yōu)先1-用材0.25g，同SOD酶液）1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取6支試管，按下表加入各試劑。試劑-管號(hào)012345100四g/ml牛血清白蛋白溶液00.20.40.60.81.0蒸餾水/mL1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)液/mL5.05.05.05.05.05.0牛血清蛋白的配制：取0.025g（25mg）牛血清蛋白（BSA在冰箱里找），蒸餾水溶解定容至100ml（250四g/ml），再從100ml中取40ml稀釋定容至100ml（100四g/ml）。考馬斯亮藍(lán)G250的配制：取50mg（0.0500）考馬斯亮藍(lán)溶于22.5ml純乙醇中，加50ml85%磷酸（買的磷酸即85%溶液），用蒸餾水定容至500ml，儲(chǔ)藏于棕色瓶中，保質(zhì)期一個(gè)月。加入考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長下比色測定，記錄a595。以各管相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（mg）為橫坐標(biāo)、A595為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品測定用空白（1ml蒸餾水+5ml考馬斯亮藍(lán)G-250）調(diào)零。試管中加自制蛋白質(zhì)樣品1.0mL（SOD提取酶液），再加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻，放置2min后，在595nm波長下比色，記錄A595。根據(jù)所測a595從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量。3、結(jié)果計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量（mg/g）=C*VT/（Vs*WF*1000）式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值，四g；VT為提取液總體積（我們用的為9ml）；Vs為測定時(shí)加樣量；WF為樣品鮮重。注意事項(xiàng)：（1）如果測定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5?20min內(nèi)測定吸光度，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。比色反應(yīng)需在1h內(nèi)完成。（2）測定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，實(shí)驗(yàn)證明此復(fù)合物的吸附量是可以忽略的。測定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。（3）利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計(jì)的正確使用，重復(fù)測定吸光度時(shí)，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品最好是從低濃度到高濃度測定，防止誤差。實(shí)驗(yàn)六光合色素含量測定（優(yōu)先2-用材0.025g）葉綠體色素溶液各組成成分在可見光譜中具有不同的特征吸收峰。葉綠體色素的提取常用丙酮和乙醇有機(jī)溶劑。葉綠體色素80%丙酮提取液中葉綠素a和b及類胡蘿卜素分別在663nm、646nm和470nm波長下有最大吸收峰，據(jù)此所測得的吸光度值代人不同的經(jīng)驗(yàn)公式（見結(jié)果計(jì)算），計(jì)算出葉綠體色素丙酮提取液中葉綠素a和b的濃度及其葉綠素總濃度和類胡蘿卜素的總濃度，并依據(jù)所使用的單位植物組織（鮮重、干重或面積），求算出色素的含量。［實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菡莆辗止夤舛确▽?duì)植物葉綠體色素提取液中葉綠素a和b的濃度及其葉綠素總濃度和類胡蘿卜素的總濃度測定與計(jì)算方法，以及植物材料中各種色素含量的求算方法。［器材和試劑］植物材料新鮮（或烘干）植物葉片，如菠菜葉片等。實(shí)驗(yàn)器材分光光度計(jì)、天平、研缽、剪刀、漏斗、濾紙、棕色容量瓶、吸水紙、擦鏡紙和滴管。實(shí)驗(yàn)試劑80%丙酮（80ml體積的丙酮定容到100ml蒸餾水中）［操作步驟］色素的提取稱取新鮮（或干材料）的洗凈擦干的植物葉片0.025g（上下相差0.003g），去中脈剪碎后置于帶刻度試管中，用80%丙酮定容至5ml，密封，避光放置48h。吸光度的測定將色素提取液重新混勻。取光徑1cm的比色杯，注入上述色素丙酮提取液，以80%丙酮作為空白對(duì)照，在波長663、646和470nm下測定吸光度。結(jié)果計(jì)算依據(jù)下列丙酮提取液中色素濃度計(jì)算公式，分別計(jì)算出葉綠素a上的濃度及其葉綠素總濃度和類胡蘿卜素的濃度。Ca=12.21*A663-2.81*A646（葉綠素a的濃度）Cb=20.13*A646-5.03*A663（葉綠素b的濃度）Cc=(1000*A470-3.27Ca-104Cb)/229(類胡蘿卜素總濃度)求得色素濃度后，代入下面公式：光合色素含量=色素濃度*提取液體積*稀釋倍數(shù)/樣品鮮重(mg/g)［注意事項(xiàng)］光對(duì)葉綠素有破壞作用，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在弱光下進(jìn)行，且應(yīng)盡量在短時(shí)間內(nèi)研磨。色素提取液若混有其他物質(zhì)而造成渾濁，將影響吸光度的測定，應(yīng)重新過濾或離心。色素吸光度測定前，應(yīng)按儀器說明及標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a、b對(duì)分光光度計(jì)的波長進(jìn)行校正，否則影印葉綠素含量的測定精度。實(shí)驗(yàn)七電導(dǎo)率(優(yōu)先3-用材0.025g)從對(duì)照及不同處理中分別稱取生長一致的鮮苗0.05甘(苗子多的話建議0.10g)，剪成長度為0.5cm的小段，3個(gè)重復(fù)。用去離子水充分沖洗干凈后，用吸水紙吸干水分，置于20ml，試管中(電導(dǎo)儀測試棒應(yīng)該可以伸進(jìn)去接觸到液面，先試一下，然后提前選好試管)，并加10ml去離子水，搖勻、密封，室溫放置24h，用數(shù)字電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率E1；然后置沸水浴中煮30min，冷卻后測定電導(dǎo)率E2;同時(shí)測定其背景電導(dǎo)值E0。按下式計(jì)算電導(dǎo)率(P):P=(E］-E0)/(E2-E0)*100%。實(shí)驗(yàn)八可溶性糖的測定(優(yōu)先4-用材0?05-0?1g)試劑1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液：將分析純蔗糖在80°C下烘至恒重，精確稱取1.000g。加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入0.5ml濃硫酸，定容至刻度(10000pg/ml)。100pg/ml蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液：精確吸取1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1ml加入100ml容量瓶中，加水定容(100pg/ml)。蒽酮乙酸乙酯試劑：取分析純蒽酮1.0g，溶于50ml乙酸乙酯中，用時(shí)加熱溶解。標(biāo)準(zhǔn)曲線：精確吸取1%的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1ml加入100ml容量瓶中，得終濃度為100pg/ml。取20ml刻度試管，從0-5進(jìn)行編號(hào)，按下表加入溶液與蒸餾水。試劑管號(hào)試劑管號(hào)01234100pg/ml蔗糖液（ml）00.20.40.60.81.0水（ml）21.81.61.41.21.0相當(dāng)于蔗糖量（pg）020406080100按順序向試管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯試劑和5ml濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，逐管均準(zhǔn)確保溫1min，取出后自然冷卻至室溫，以空白作參比，在630nm波長下測其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程。2、測定方法取新鮮植物樣品，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.05g（葉片多的話可取0.10甘），放入帶刻度試管中，加入8mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液過濾入25mL容量瓶中，反復(fù)沖洗試管及殘?jiān)?，定容至刻度。顯色測定：吸取0.5ml糖提取液于20ml刻度試管中（重復(fù)2次），加入蒸餾水1.5ml，按順序向試管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯試劑和5ml濃硫酸，充分振蕩，保鮮膜封口后立即將試管放入沸水浴中，均準(zhǔn)確保溫1min，取出后自然冷卻至室溫，以空白作參比（0.5ml蒸餾水+1.5ml蒸餾水+0.5ml蒽酮乙酸乙酯試劑+5ml濃硫酸），在630nm波長下測其吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測液的含糖量。3、結(jié)果計(jì)算可溶性糖含量（mg/g）=C*V/（a*m*106）式中C一標(biāo)準(zhǔn)方程求得糖量（曜）；a—吸取樣品液體積（ml）；V—提取液量（ml）；m—稱樣質(zhì)量（g）。附注（1）加濃h2so4時(shí)應(yīng)緩慢加入，以免產(chǎn)生大量熱量而爆沸，灼傷皮膚，如出現(xiàn)上述情況，應(yīng)迅速用自來水沖洗。（2）水浴加熱時(shí)用保鮮膜封口，多封幾圈，以免加熱熱氣沖開。實(shí)驗(yàn)九硫代巴比妥酸法測定丙二醛的含量（優(yōu)先5-用材0.25g）實(shí)驗(yàn)原理植物器官衰老時(shí)，或在逆行環(huán)境下，往往會(huì)發(fā)生膜質(zhì)過氧化作用，丙二醛（MDA）是其產(chǎn)物之一，通常利用它作為膜質(zhì)過氧化的指標(biāo)，表示細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度和植物對(duì)逆性條件反應(yīng)的強(qiáng)弱。丙二醛（MDA）在高溫、酸性的條件下能與0.67%的硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成有色的三甲基復(fù)合物。該復(fù)合物在532nm的波長處有最大的光吸收，在600nm的波長處有最小的光吸收，該復(fù)合物的吸光系數(shù)為155[mmol/（L.cm）]，可按公式：A532—A600T55000xCxL算出MDA濃度C(^molZL)，進(jìn)一步算出單位重量鮮組織中MDA含量(pmol/g)。式中，A532和A600分別表示532nm和600nm處的吸光度值。L為比色杯厚度(cm)需要指出的是，植物組織中糖類物質(zhì)對(duì)MDA-TBA反應(yīng)有干擾作用。為消除這種干擾，經(jīng)試驗(yàn)，可用下列公式消除由蔗糖引起的誤差。C(^mol/L)=6.45(A532—A600)—0.56A450(2)A450、A532、A600分別代表離心后的溶液在450nm、532nm、600nm波長下的吸光度值，進(jìn)一步算出其在植物組織中的含量。實(shí)驗(yàn)儀器、材料、試劑實(shí)驗(yàn)儀器研缽，恒溫水浴鍋，分光光度計(jì)，冷凍離心機(jī)，天平，刻度試管。材料植物新鮮葉片試劑5%三氯乙酸(TCA)：稱取5.0g的三氯乙酸溶于蒸餾水并用其定容至100mL0.67%硫代巴比妥酸(TBA)：稱取硫代巴比妥酸0.67g溶于10%TCA溶液中(70度水浴加熱，提前配，避光保存，即棕色瓶中)，并用其定容至100mL。實(shí)驗(yàn)步驟酶液的提取稱取0.25g的芍藥葉片，加入提取液5%三氯乙酸(TCA)研磨均勻后，定容至5ml，3000r/min下離心10分鐘。吸取上清液2ml并加入2ml0.67%硫代巴比妥酸(TBA)搖勻，在沸水中煮沸30分鐘，冷卻后再離心一次。4)以2ml的提取液和2ml反應(yīng)液0.67%硫代巴比妥酸(TBA)的混合液為對(duì)照，分別在450nm、532nm、600nm的波長下測定吸光度值并記錄數(shù)據(jù)。按公式C(pmol/L)=6.45(A532—A600)—0.56A450(2)計(jì)算植物樣品提取液中丙二醛的濃度。實(shí)驗(yàn)十脯氨酸含量的測定(優(yōu)先6-用材0.25g)原理用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出(或用回歸方程計(jì)算)脯氨酸的含量。材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：待測植物（水稻、小麥、玉米、高粱、大豆等）葉片。（二）儀器設(shè)備：1）722型分光光度計(jì)；2）研缽；3）100ml小燒杯；4）容量瓶；5）大試管；6）普通試管；7）移液管；8）注射器；9）水浴鍋；10）漏斗；11）漏斗架；12）濾紙；13）剪刀。（三）試劑1）酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中（0.025*6*98/0.85/1.69=10.23ml，10.23ml85%的磷酸定容到25ml容量瓶中），攪拌加熱（70°C）溶解，貯于冰箱中（現(xiàn)在現(xiàn)配，放置超24h即重配）；2）3%磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml；3）冰醋酸；4）甲苯。實(shí)驗(yàn)步驟1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）在分析天平上精確稱取25mg（0.0250g）脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每ml含脯氨酸100四g。（2）系列脯氨酸濃度的配制：取6個(gè)50ml容量瓶，分別盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1，2，3，4，5及6四g/ml。（3）取