dna復(fù)制起始 謝貽冬課件

基因復(fù)制起始24復(fù)制起始模型建立復(fù)制起始的概念病毒原核生物：大腸桿菌真核生物復(fù)制起始在細胞周期的調(diào)控DNA復(fù)制的引發(fā)復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一富含AT的部位叫做復(fù)制起始點(originofreplication)常用ori或O表示。DNA復(fù)制起始☆原核生物染色體、病毒和核外DNA通常只有一個復(fù)制起點?！钫婧松锶旧w有多個復(fù)制起點，彼此相隔約3-10萬bp。DNA復(fù)制起始至少需以下三個步驟:起始蛋白識別一個或一個以上的順式作用元件DNA雙鏈局部解旋

選擇適宜位點進行引物合成及開始聚合反應(yīng)二、原核生物的復(fù)制起始大腸桿菌的復(fù)制起點為oriC，由245個堿基對組成，這些序列在多數(shù)細菌中高度保守，關(guān)鍵序列是3個13bp和4個bpd的重復(fù)序列參與復(fù)制起始的9個蛋白和酶蛋白質(zhì)亞基數(shù)目功能DnaA1識別起點序列，在起點特異性位置解開雙鏈DnaB6解開DNA雙鏈DnaC6幫助DnaB結(jié)合于起點HU2類組蛋白，DNA結(jié)合蛋白，促進起始引物合成酶（DnaG）1合成RNA引物單鏈結(jié)合蛋白（SSB）4結(jié)合DNA單鏈RNA聚合酶5促進DnaA活性DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓撲酶Ⅱ）4釋放DNA解鏈過程中產(chǎn)生的曲張力Dam甲基化酶1使起點GATC序列的腺嘌呤甲基化復(fù)制起始的過程因為DNA聚合酶只能延長而不能開始新鏈合成，所以DnaB蛋白活化引物合成酶，先合成一小段以RNA為起始的引物（10-15bp），并最終被切除并由DNA取代。復(fù)制時，在原點通過解旋、解鏈和SSB蛋白結(jié)合等過程，這個復(fù)制點因形狀象叉子，稱復(fù)制叉。三、真核細胞的DNA復(fù)制起始復(fù)制器的選擇：G1期A區(qū)主要由11bp的ARS共有序列(ACS)—5’(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)3’組成,為復(fù)制起始所必需.B區(qū)由2一3個部分重復(fù)的亞區(qū)(B1,B2等)組成，位于A區(qū)3’端,不具遺傳保守性.復(fù)制起始位點的激活：S期起始識別復(fù)合物(ORC)以ATP依賴的方式特異識別ACS區(qū)和B1區(qū)并與之結(jié)合.復(fù)制起始位點的激活（S）Cdk和Dbf4磷酸化pre-RC，促使DNA解旋DNA聚合酶和輔助因子與復(fù)制起始位點的結(jié)合，并合成RNA引物裝載滑動夾，聚合酶切換，開始合成前導(dǎo)鏈

后隨鏈模板足夠長時啟動后隨鏈的合成裂殖酵母的復(fù)制起始是完全不同于釀酒酵母裂殖酵母的復(fù)制起始有一個大小為500–1500bp的序列，是釀酒酵母的5–10倍。裂殖酵母起始區(qū)缺乏一個明顯的共識序列，但它們包含兩個或更多的重要序列，些非常重要的富含A-T的序列經(jīng)常是不對稱的，A在一條鏈，T在另一條鏈，這是ars3001，ars3002，和ars2004起始區(qū)基因缺失造成的。裂殖酵母的起始區(qū)也有ARS活動，使含一個起始區(qū)的質(zhì)粒可在其中保持穩(wěn)定并復(fù)制。裂殖酵母中有500–1000強弱不一的復(fù)制起始點，分布在三條染色體上。除了基本的ORC結(jié)合位點，裂殖酵母的起始區(qū)包含另一種重要位點，是SAP1蛋白結(jié)合位點。SAP1最初被確定為是一個蛋白被綁定到一個序列的交配型開關(guān)，在復(fù)制叉穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要的作用。SAP1結(jié)合在裂殖酵母ars3001一個重要區(qū)域，綁定到一個序列（A/T）4tN（C/g）（A/T）10–11（C/G）（A/T）4tN。像ORC一樣，在起始區(qū)可能有多個親和力不同的SAP1結(jié)合位點。復(fù)制起始在細胞周期的調(diào)控DNA復(fù)制起始在細胞周期中存在兩個調(diào)控點M/G1過渡時建立復(fù)制前染色質(zhì)狀態(tài)G1/S過渡時參與復(fù)制起始的蛋白質(zhì)因子接受周期依賴的調(diào)節(jié),直接引發(fā)DNA合成.(復(fù)制起始復(fù)合體組裝)復(fù)制前染色質(zhì)狀態(tài)相關(guān)因子：微小染色體維持基因家族MCM和CDC6、周期蛋白及其依賴的激酶。酵母體系中,M-S期核內(nèi)的MCM5/CDC46作用于復(fù)制起始點,與ORC、ARS相互作用.CDC6的表達在M/G,期達到高峰,它在細胞周期的早期與ORC相互作用,提高起始點活性.哺乳類細胞中,在整個間期MCM基因產(chǎn)物都存在于核內(nèi),但它的G1期磷酸化水平與G2期明顯不同.MCM突變株ARS活性降低,復(fù)制難以起始.在芽殖酵母中，ORC作為加載墊將Cdc6聚集在G1期的早期。然后，ORC和CDC6一起激活CDT1–MCM形成前復(fù)制復(fù)合體。MCM加載出現(xiàn)重復(fù)，意味著每個起始點都裝上了幾個MCM分子，作為復(fù)制叉出現(xiàn)損傷或障礙時的備份，以順利完成復(fù)制。MCM加載到DNA不再需要ORC和CDC6輔助的輔助。在裂殖酵母，前復(fù)制復(fù)合體也需要ORC，Cdc18、CDT1、MCM和一個必不可少的額外蛋白SAP1。ORC和SAP1共同作用才能激活CDT1SAP1是一個新發(fā)現(xiàn)的復(fù)制起始蛋白直接參與前復(fù)制復(fù)合物組裝，參與pre-RCs對Cdc18的加載。Cdt1和Cdc18加載到起始區(qū)后，這兩種蛋白質(zhì)共同負載MCM，與起始區(qū)結(jié)合完成前復(fù)制復(fù)合物的組裝。DNA復(fù)制起始的引發(fā)酵母體系在生長因子等刺激下,G1期周期蛋白1、2和3活躍表達和積累，使細胞得以通過起始點（START）.起始點與S期間有兩點聯(lián)系:1、B型周期蛋白5和6依賴起始點的表達.它們可與周期蛋白依賴的激酶CDC28,CDK抑制因子P40形成復(fù)合物.2、該復(fù)合物被依賴起始點的P40降解激活.CDC28可使RP-A、CDC7等磷酸化.CDC7活化后在晚G1期磷酸化，調(diào)節(jié)ORC、MCM或其他蛋白質(zhì),激活DNA復(fù)制哺乳動物細胞內(nèi)不止一種CDC(CDK)和周期蛋白參與這一過程G0期哺乳類細胞受生長因子刺激后,周期蛋白D出現(xiàn)早于周期蛋白E.周期蛋白D和它的mRNA不穩(wěn)定.去除生長因子后,水平迅速下降.周期蛋白D可與CDK2、CDK4、CDK5結(jié)合,在細胞周期內(nèi)發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用:a.刺激Gl期進行.b.確保DNA不提前復(fù)制.周期蛋白E的水平在G1/s過渡期最高.周期蛋白E可以結(jié)合并磷酸化修飾CDK2,作用于復(fù)制起始因子,誘導(dǎo)細胞進入S期.期蛋白E-CDKZ可使視網(wǎng)膜母細胞瘤敏