分子生物學(xué)第三章-dna的復(fù)制-基于dna復(fù)制原理的pcr技術(shù)課件

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）1Polymerasechainreaction

---AnimportanttechniquebasedonDNAPolymerase

Thepolymerasechainreaction(PCR)istousedtoamplifyasequenceofDNAinvitro,usingapairofprimerseachcomplementarytooneendofthetheDNAtargetsequence.理論技術(shù)Polymerasechainreaction

---A2Denaturation(變性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesdNTPsandrequiresMg++.TheprincipleofPCR:ThreedifferentstepsproceedineachPCRcycle.Denaturation(變性):Thetarget35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’DenaturationAnnealingExtension(DNApolymerase)Cycle1Cycle2Cycle35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’4Initial

DNA

8421NumberofDNAmolecules(2n):指數(shù)擴(kuò)增Initial

DNA

8421NumberofDNA5Manycycles(25-35incommon)areperformedtocompleteonePCRreaction,whichresultedinanexponentialamplification

ofthetargetDNAinwhichbothforwardandreverseprimerspair.Manycycles(25-35incommon)6DNAtemplate(模板)AnysourceofDNAthatprovidesoneormoretargetmoleculescaninprinciplebeusedasatemplateforPCR.WhateverthesourceoftemplateDNA,PCRcanonlybeappliedifsomesequenceinformationisknownsothatprimerscanbedesigned.DNAtemplate(模板)Anysourceof7分子生物學(xué)第三章-dna的復(fù)制--基于dna復(fù)制原理的pcr技術(shù)課件8Figure8-3SubstratesrequiredforDNAsynthesisFigure8-3Substratesrequired9PCRPrimersAnnealonoppositestrandsofthetargetsequence:forwardandreverseprimers（正向引物和反向引物）HavesimilarG+Ccontents(Tm)sothattheyannealtotheircomplementarysequencesatsimilartemperatures

(annealtemperature:Tm-5°C)PCRPrimersAnnealonopposite105’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC-------TCCTGTGCATTTCGCCACTAGAG-3’3’-TAAGGCTAGCGATTAGCTACCG-------AGGACACGTAAAGCGGTGATCTC-5’5’-ATTCCGATCGCTAATCGATG-3’3’-CACGTAAAGCGGTGATCTC-5’forwardprimerreverseprimer5’-CTCTAGTGGCGAAATGCAC-3’5’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC-----115’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’DenaturationAnnealingExtension(DNApolymerase)Cycle1Cycle2Cycle35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’12PCREnzymesPCREnzymes13Denaturation(變性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesdNTPsandrequiresMg2+.Denaturation(變性):Thetarget14Taqpolymerase：isolatedfromthethermophilicbacteriumThermusaquaticus(嗜熱菌）,耐熱DNA聚合酶，耐高溫Ithasno3’to5’proofreadingexonucleaseactivityHigh-accuracyDNApolymeraseisavailablecommercially(高保真酶）Taqpolymerase：isolatedfrom15PCR儀PCR儀16DiscoveryofPCRtechnique希望大家不僅僅知道“是什么”，而且也了解“為什么”和“結(jié)論是怎么得出來的”DiscoveryofPCRtechnique希望大家17如果你的研究能力一般，那么，改革本研究領(lǐng)域中大家習(xí)以為常的最基本的技術(shù)，你就有可能獲諾貝爾獎-----KaryMullis(卡里.穆利斯)如果你的研究能力一般，那么，改革本研究領(lǐng)域中大家習(xí)以為常的最18ThereplicationofDNAThereplicationofDNA19哥倫布豎立雞蛋的故事DNA分子的拷貝術(shù)，復(fù)印機(jī)哥倫布豎立雞蛋的故事20PCR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)充滿傳奇色彩KaryMullis(卡里.穆利斯)1972年獲得加州大學(xué)伯克利分校生物化學(xué)博士學(xué)位1979年進(jìn)入塞特斯公司：與DNA合成相關(guān)的工作1983年4月：PCR的最初想法高速公路的靈感230=10億想法付諸行動1983年12月：第一個PCR反應(yīng)成功1984年塞特斯公司申請PCR技術(shù)專利PCR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)充滿傳奇色彩21PCR技術(shù)引來的官司誰發(fā)明了PCR？DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)者？紙上談兵KaryMullis(卡里.穆利斯)勝訴PCR技術(shù)引來的官司22KaryMulliswonthe1993NobelPrizeinChemistryforhisinventionofthepolymerasechainreaction

心靈的裸舞-自傳KaryMulliswonthe1993Nobel23分子生物學(xué)第三章-dna的復(fù)制--基于dna復(fù)制原理的pcr技術(shù)課件24MypresentresearchworkDegeneratePCRcanbeusedtoclonegenecodingforenzyme簡并引物PCR----結(jié)合自己的研究工作PCRapplication-example1MypresentresearchworkPCRap25Codon:degenerateAnticodon:wobble密碼子的簡并性Codon:degenerate密碼子的簡并性26Manyaminoacidsarespecifiedbymorethanonecodon-degeneracy(簡并性).Codonsspecifyingthesameaminoacidarecalledsynonyms(同義密碼子).GManyaminoacidsarespecified27Degenerateprimers(簡并引物):

anoligopoolderivedfromaproteinsequence.His-Phe-Pro-Phe-Met-Lyscangenerateaprimer5’-CAYTTYCCNTTYATGAAR-3’Y=Pyrimidine(CorT)N=anybaseR=purine(AorG)Degenerateprimers(簡并引物):28DegeneratePCR(簡并PCR)Myresearchwork:molecularbiologyresearchoflaccase(漆酶)producedinfungi--白腐真菌漆酶的分子生物學(xué)研究DegeneratePCR(簡并PCR)Myresea29白腐真菌白腐真菌（whiterotfungi)白腐真菌是一類使木材呈白色腐朽的絲狀真菌的總稱（主要是擔(dān)子菌）已知的唯一能在純系培養(yǎng)中有效地將木質(zhì)素徹底降解為CO2和H2O的一類微生物白腐真菌白腐真菌（whiterotfungi)白腐真菌是30木質(zhì)素：以芳香族為基本結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜聚合物

Science,2007,315(5813):804-807

對與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)相似的異生物質(zhì)污染物也具有強(qiáng)大的降解能力木質(zhì)素：以芳香族為基本結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜聚合物Science,31木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）

錳過氧化物酶（MnP）

漆酶（Lac）白腐真菌木質(zhì)素降解酶系非立體選擇性和非特異性

木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）白腐真菌木質(zhì)素降解酶系非立體選擇性32漆酶（Laccase）含銅的多酚氧化酶,白腐真菌降解木質(zhì)素的重要酶具有廣泛的底物作用范圍和獨(dú)特的生物降解功能環(huán)境生物技術(shù)BiotechnologyAdvances24(2006)500–513漆酶（Laccase）含銅的多酚氧化酶,白腐真菌降解木質(zhì)素的33UsedegeneratePCR(簡并PCR)toclonelaccasegeneUsedegeneratePCR(簡并PCR)to34Copper-bindingregionishighlyconservedCopper-bindingregionI:His-Trp-His-Gly-Phe-Phe-GlnCopper-bindingregionIV:His-Cys-His-Ile-Asp-Phe-HisCopper-bindingregionishighl35簡并引物PCR獲得1.6kb漆酶基因特異性序列基因組步移技術(shù)獲得2118bp漆酶全長結(jié)構(gòu)基因RACE和RT-PCR克隆得到了1566bp漆酶基因全長cDNA序列122kb1kb----我們自己的研究工作簡并引物PCR獲得1.6kb漆酶基因特異性序列基因組步移技術(shù)36Question:BydegeneratePCR,onlythepartialsequenceofonegenecanbeobtained,Howcanwegettheentiregene?Chromosomewalking(染色體步移技術(shù))

Question:BydegeneratePCR,on37LongDistance

inversePCRTechniqueforEfficientCloningofFlankingSequencesAdjacenttoKnownDNAFragmentsinversePCR(反向PCR)LongDistanceinversePCRTech38Reversetranscriptase(RT)-PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測基因的轉(zhuǎn)錄量PCRapplication-example2Reversetranscriptase(RT)-PCR39Reversetranscriptase(RT)-PCR逆轉(zhuǎn)錄PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18

primeranneal5‘-CapAAA(A)n3‘5‘ReversetranscriptiondNTP,RT5‘-CapAAA(A)n5‘cDNA:mRNAhybridRegularPCRReversetranscriptase(RT)-PCR40RT-PCRapplicationClonecDNAofspecificgeneDetectingtheexpressionlevelofgeneRT-PCRapplicationClonecDNAo41Studythistechniquefromexperiment(實(shí)戰(zhàn)中學(xué)習(xí))DetectingtheexpressionlevelofgenebyRT-PCRmRNAcDNART-PCRproductStudythistechniquefromexpe42Rightpanel:PCRamplificationoftheclonedlac1cDNAusingthecyclenumberobtainedfromtheleftpanelValidationofsemiquantitativeRT-PCRassaysforexpressionleveloflac1(laccasegene)Leftpanel:KineticsofPCRamplificationwiththeelectrophoreticimageshownatthetop.Thecyclenumber(28)thatgenerateshalfmaximalreactionwasusedtoanalysetheexpressionofthegene.Rightpanel:PCRamplification43Eur.J.Biochem.(2004)271,318–328RT-PCRanalysisoftranscriptionoflac1inducedbydifferentconcentrationsofcopperlac1:laccasegenegpd:house-keepinggeneTheexpressionlevelswerenormalizedbyusingtherelativemRNAratio(lac1/gpd)-semiquantitativeRT-PCREur.J.Biochem.(2004)271,344各種芳香化合物對laccase基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控效果是不同的RT-PCRanalysisoftranscriptionpatternsoflac1inducedbydifferentaromaticcompoundsveratricacidferulicacid(阿魏酸)2,5-xylidinevanillin芳香化合物Eur.J.Biochem.(2004)271,318–328各種芳香化合物對laccase基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控效果是不同的R45RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR）:EffectsofvariouscopperconcentrationsonlccmRNAMeasurethelaccaseactivity:EffectsofvariouscopperconcentrationsonlaccaseactivityRT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR）:Measurethelac46PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）47Polymerasechainreaction

---AnimportanttechniquebasedonDNAPolymerase

Thepolymerasechainreaction(PCR)istousedtoamplifyasequenceofDNAinvitro,usingapairofprimerseachcomplementarytooneendofthetheDNAtargetsequence.理論技術(shù)Polymerasechainreaction

---A48Denaturation(變性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesdNTPsandrequiresMg++.TheprincipleofPCR:ThreedifferentstepsproceedineachPCRcycle.Denaturation(變性):Thetarget495’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’DenaturationAnnealingExtension(DNApolymerase)Cycle1Cycle2Cycle35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’50Initial

DNA

8421NumberofDNAmolecules(2n):指數(shù)擴(kuò)增Initial

DNA

8421NumberofDNA51Manycycles(25-35incommon)areperformedtocompleteonePCRreaction,whichresultedinanexponentialamplification

ofthetargetDNAinwhichbothforwardandreverseprimerspair.Manycycles(25-35incommon)52DNAtemplate(模板)AnysourceofDNAthatprovidesoneormoretargetmoleculescaninprinciplebeusedasatemplateforPCR.WhateverthesourceoftemplateDNA,PCRcanonlybeappliedifsomesequenceinformationisknownsothatprimerscanbedesigned.DNAtemplate(模板)Anysourceof53分子生物學(xué)第三章-dna的復(fù)制--基于dna復(fù)制原理的pcr技術(shù)課件54Figure8-3SubstratesrequiredforDNAsynthesisFigure8-3Substratesrequired55PCRPrimersAnnealonoppositestrandsofthetargetsequence:forwardandreverseprimers（正向引物和反向引物）HavesimilarG+Ccontents(Tm)sothattheyannealtotheircomplementarysequencesatsimilartemperatures

(annealtemperature:Tm-5°C)PCRPrimersAnnealonopposite565’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC-------TCCTGTGCATTTCGCCACTAGAG-3’3’-TAAGGCTAGCGATTAGCTACCG-------AGGACACGTAAAGCGGTGATCTC-5’5’-ATTCCGATCGCTAATCGATG-3’3’-CACGTAAAGCGGTGATCTC-5’forwardprimerreverseprimer5’-CTCTAGTGGCGAAATGCAC-3’5’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC-----575’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’DenaturationAnnealingExtension(DNApolymerase)Cycle1Cycle2Cycle35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’58PCREnzymesPCREnzymes59Denaturation(變性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesdNTPsandrequiresMg2+.Denaturation(變性):Thetarget60Taqpolymerase：isolatedfromthethermophilicbacteriumThermusaquaticus(嗜熱菌）,耐熱DNA聚合酶，耐高溫Ithasno3’to5’proofreadingexonucleaseactivityHigh-accuracyDNApolymeraseisavailablecommercially(高保真酶）Taqpolymerase：isolatedfrom61PCR儀PCR儀62DiscoveryofPCRtechnique希望大家不僅僅知道“是什么”，而且也了解“為什么”和“結(jié)論是怎么得出來的”DiscoveryofPCRtechnique希望大家63如果你的研究能力一般，那么，改革本研究領(lǐng)域中大家習(xí)以為常的最基本的技術(shù)，你就有可能獲諾貝爾獎-----KaryMullis(卡里.穆利斯)如果你的研究能力一般，那么，改革本研究領(lǐng)域中大家習(xí)以為常的最64ThereplicationofDNAThereplicationofDNA65哥倫布豎立雞蛋的故事DNA分子的拷貝術(shù)，復(fù)印機(jī)哥倫布豎立雞蛋的故事66PCR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)充滿傳奇色彩KaryMullis(卡里.穆利斯)1972年獲得加州大學(xué)伯克利分校生物化學(xué)博士學(xué)位1979年進(jìn)入塞特斯公司：與DNA合成相關(guān)的工作1983年4月：PCR的最初想法高速公路的靈感230=10億想法付諸行動1983年12月：第一個PCR反應(yīng)成功1984年塞特斯公司申請PCR技術(shù)專利PCR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)充滿傳奇色彩67PCR技術(shù)引來的官司誰發(fā)明了PCR？DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)者？紙上談兵KaryMullis(卡里.穆利斯)勝訴PCR技術(shù)引來的官司68KaryMulliswonthe1993NobelPrizeinChemistryforhisinventionofthepolymerasechainreaction

心靈的裸舞-自傳KaryMulliswonthe1993Nobel69分子生物學(xué)第三章-dna的復(fù)制--基于dna復(fù)制原理的pcr技術(shù)課件70MypresentresearchworkDegeneratePCRcanbeusedtoclonegenecodingforenzyme簡并引物PCR----結(jié)合自己的研究工作PCRapplication-example1MypresentresearchworkPCRap71Codon:degenerateAnticodon:wobble密碼子的簡并性Codon:degenerate密碼子的簡并性72Manyaminoacidsarespecifiedbymorethanonecodon-degeneracy(簡并性).Codonsspecifyingthesameaminoacidarecalledsynonyms(同義密碼子).GManyaminoacidsarespecified73Degenerateprimers(簡并引物):

anoligopoolderivedfromaproteinsequence.His-Phe-Pro-Phe-Met-Lyscangenerateaprimer5’-CAYTTYCCNTTYATGAAR-3’Y=Pyrimidine(CorT)N=anybaseR=purine(AorG)Degenerateprimers(簡并引物):74DegeneratePCR(簡并PCR)Myresearchwork:molecularbiologyresearchoflaccase(漆酶)producedinfungi--白腐真菌漆酶的分子生物學(xué)研究DegeneratePCR(簡并PCR)Myresea75白腐真菌白腐真菌（whiterotfungi)白腐真菌是一類使木材呈白色腐朽的絲狀真菌的總稱（主要是擔(dān)子菌）已知的唯一能在純系培養(yǎng)中有效地將木質(zhì)素徹底降解為CO2和H2O的一類微生物白腐真菌白腐真菌（whiterotfungi)白腐真菌是76木質(zhì)素：以芳香族為基本結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜聚合物

Science,2007,315(5813):804-807

對與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)相似的異生物質(zhì)污染物也具有強(qiáng)大的降解能力木質(zhì)素：以芳香族為基本結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜聚合物Science,77木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）

錳過氧化物酶（MnP）

漆酶（Lac）白腐真菌木質(zhì)素降解酶系非立體選擇性和非特異性

木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）白腐真菌木質(zhì)素降解酶系非立體選擇性78漆酶（Laccase）含銅的多酚氧化酶,白腐真菌降解木質(zhì)素的重要酶具有廣泛的底物作用范圍和獨(dú)特的生物降解功能環(huán)境生物技術(shù)BiotechnologyAdvances24(2006)500–513漆酶（Laccase）含銅的多酚氧化酶,白腐真菌降解木質(zhì)素的79UsedegeneratePCR(簡并PCR)toclonelaccasegeneUsedegeneratePCR(簡并PCR)to80Copper-bindingregionishighlyconservedCopper-bindingregionI:His-Trp-His-Gly-Phe-Phe-GlnCopper-bindingregionIV:His-Cys-His-Ile-Asp-Phe-HisCopper-bindingregionishighl81簡并引物PCR獲得1.6kb漆酶基因特異性序列基因組步移技術(shù)獲得2118bp漆酶全長結(jié)構(gòu)基因RACE和RT-PCR克隆得到了1566bp漆酶基因全長cDNA序列122kb1kb----我們自己的研究工作簡并引物PCR獲得1.6kb漆酶基因特異性序列基因組步移技術(shù)82Question:BydegeneratePCR,onlythepartialsequenceofonegenecanbeobtained,Howcanwegettheentiregene?Chromosomewalking(染色體步移技術(shù))

Question:BydegeneratePCR,on83LongDistance

inversePCRTechniqueforEfficientCloningofFlankingSequencesAdjacenttoKnownDNAFragmentsinversePCR(反向PCR)LongDistanceinversePCRTech84Reversetranscriptase(RT)-PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測基因的轉(zhuǎn)錄量PCRapplication-example2Reversetranscriptase(RT)-PCR85Reversetranscriptase(RT)-PCR逆轉(zhuǎn)錄PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18

primeranneal5‘