抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定課件

抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定1（優(yōu)選）抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定（優(yōu)選）抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定21.文獻(xiàn)綜述

1.1流感的病原學(xué)流感病毒在病毒分類學(xué)上屬正粘病毒科－A型、B型流感病毒屬和C型流感病毒屬A型流感病毒亞型－HA:16－NA:10高致病性禽流感(HPAI)--H5andH7

1.文獻(xiàn)綜述

1.1流感的病原學(xué)31.2流感病毒檢測(cè)技術(shù)病毒的分離鑒定血清學(xué)診斷技術(shù)血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NIT）病毒中和試驗(yàn)（NT）免疫熒光技術(shù)（IFT）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）1.2流感病毒檢測(cè)技術(shù)4分子生物學(xué)診斷技術(shù)

PCR診斷技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCRNASBA法核酸探針技術(shù)

M檢測(cè)法基因芯片技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù)

PCR診斷技術(shù)52單抗的制備與鑒定

2.1研究目的與意義

流感是第一個(gè)實(shí)行全球監(jiān)控的傳染性疾病。對(duì)人及禽、畜的危害十分巨大。除禽流感外，常見的還有人流感、馬流感和豬流感等。動(dòng)物流感尤其是禽流感與人類流感和人類健康非常密切，禽流感被認(rèn)為是人流感病毒的保存和發(fā)生變異的新基因的來源，這種聯(lián)系是通過中間宿主來實(shí)現(xiàn)的。豬是人源、禽源和豬源流感病毒的唯一共同易感宿主，它能將流感病毒傳播給人。

2單抗的制備與鑒定

2.1研究目的與意義62.1研究目的與意義

流感的監(jiān)控工作是預(yù)防與控制該病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。國內(nèi)對(duì)流感病毒的臨床診斷主要是對(duì)抗體的檢測(cè)。病毒抗原檢測(cè)方面，雖然病毒的分離鑒定是診斷禽流感的一種可靠方法，但病毒的分離鑒定、動(dòng)物接種試驗(yàn)操作復(fù)雜，周期長，難以滿足對(duì)高致病性禽流感快速診斷的需要。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、核酸探針等方法則需要較好的試驗(yàn)條件和較高的人員素質(zhì)，目前還難以廣泛推廣。2.1研究目的與意義流感的監(jiān)控工作7結(jié)果見表2－2。HybridomaAscitefluids為了證實(shí)所產(chǎn)生的單克隆抗體確實(shí)是針對(duì)病毒NP蛋白保守性位點(diǎn)的，采用了多株禽流感病毒和表達(dá)的NP蛋白正篩選、陰性尿囊液及破碎的菌體負(fù)篩選的方法，篩選到了6株針對(duì)禽流感病毒NP蛋白保守性位點(diǎn)的單抗，其中2株是高效價(jià)的單抗。抗H3HA單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)結(jié)果見表2－2。FPositivecontrol免疫脾細(xì)胞的制備2單抗的制備與鑒定

2.8－氮鳥嘌呤：SIGMA公司。HMDCKcellscontrol抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定2關(guān)于抗NP蛋白單抗FPositivecontrol本研究利用雜交瘤技術(shù)獲得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3亞型禽流感病毒HA蛋白的單抗，為對(duì)禽流感病毒的進(jìn)一步研究和建立針對(duì)所有亞型禽流感病毒和H3亞型的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NIT）免疫脾細(xì)胞的制備雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)結(jié)果見表2－2。對(duì)人及禽、畜的危害十分巨大。病毒中和試驗(yàn)（NT）

流感病毒的HA蛋白具有亞型特異性，但NP蛋白卻相對(duì)保守。利用NP蛋白和HA蛋白分別有望建立一種所有亞型禽流感病毒的檢測(cè)方法和診斷流感病毒亞型的方法。而單克隆抗體由于由于特異性以及高度親和力，用于病毒學(xué)診斷時(shí)相較于多抗有許多優(yōu)點(diǎn)。本研究利用雜交瘤技術(shù)獲得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3亞型禽流感病毒HA蛋白的單抗，為對(duì)禽流感病毒的進(jìn)一步研究和建立針對(duì)所有亞型禽流感病毒和H3亞型的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。2.1研究目的與意義結(jié)果見表2－2。流感病毒的HA蛋白82.2材料方法

細(xì)胞、病毒與動(dòng)物

SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。流感病毒H9N2、H1N1由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，保存。H3N8由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒（EDS-76）、禽腺病毒1型（APMV-1）購自北京梅里亞維通公司。

SPF雞胚購自北京梅里亞維通公司。

BALB/C小鼠購自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2.2材料方法

細(xì)胞、病毒與動(dòng)物

S9培養(yǎng)基及主要試劑

RPMI-1640、HAT、HT、弗氏完全與不完全佐劑：GIBCOL公司。新生小牛血清（超級(jí)）：四季青生物工程公司。精制小牛血清：Hyclone公司。融合劑50％PEG（P7181）、羊抗鼠IgG-HRP、

8－氮鳥嘌呤：SIGMA公司。羊抗鼠IgG1、G2a－HRP：SBA公司。青、鏈霉素：華北制藥廠。培養(yǎng)基及主要試劑

RPMI-1640、HAT、HT、弗氏完全10方法

病毒粒子的大量制備與純化免疫原的制備動(dòng)物免疫

SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的活化與制備免疫脾細(xì)胞的制備細(xì)胞融合方法病毒粒子的大量制備與純化11雜交瘤細(xì)胞上清檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的克隆化（有限稀釋法）雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)單克隆抗體的生產(chǎn)、純化和效價(jià)測(cè)定單克隆抗體亞類鑒定單抗特異性鑒定間接免疫熒光法檢測(cè)單克隆抗體方法雜交瘤細(xì)胞上清檢測(cè)方法122.3結(jié)果與分析

抗NP蛋白雜交瘤細(xì)胞的篩選用間接ELISA方法進(jìn)行篩選。使用A法免疫制備了1株抗NP蛋白的單抗1D10，使用B法獲得了4株單抗（4F4、1C3、1G11、1C2），使用C法獲得了1株單抗(2E7)。各株單抗用間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果如表2－1所示，其中1D10和1G11效價(jià)最高，用于以下的試驗(yàn)。2.3結(jié)果與分析

抗NP蛋白雜交瘤細(xì)胞的篩選13抗NP雜交瘤細(xì)胞上清ELISA檢測(cè)結(jié)果(OD630)

Antigens1D104F41C31G111C22E7H1N10.8310.4080.2760.5980.1980.211H3N81.0860.5670.4011.1590.5130.456H9N20.9750.4190.3620.6870.3670.386陰性尿囊液0.1320.0400.0520.0530.095NNP1.1821.0370.4641.0110.5210.811BL21NNNNN0.057注：N表示沒有檢測(cè)；所建立的ELISA臨界值均為0.2。抗NP雜交瘤細(xì)胞上清ELISA檢測(cè)結(jié)果(OD630) Ant14抗HA蛋白雜交瘤細(xì)胞的篩選

通過血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行篩選。經(jīng)2次檢測(cè)、3次克隆后獲得3株穩(wěn)定分泌抗HA蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)數(shù)月，細(xì)胞生長良好，反復(fù)凍存復(fù)蘇后，仍保持穩(wěn)定的抗體分泌能力，分別命名為2B7、1C11、4G7?？笻A蛋白雜交瘤細(xì)胞的篩選通過血凝抑制15雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)結(jié)果見表2－2。單克隆抗體亞類鑒定

以羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP為二抗用間接ELISA鑒定了單克隆抗體的亞類。結(jié)果見表2－2。抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定課件16表2－2單克隆抗體亞型及相應(yīng)雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)AntigenCellsAntibodyisotypesThenumberofchromosomesSplenocyte40SP2/070HybridomaNP1D101G11G2aG194(89~97)83(81~86)HA2B71C114G7G2aG1G2a90(82~94)98(92~103)87(79~87)表2－2單克隆抗體亞型及相應(yīng)雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)Antig17單克隆抗體的生產(chǎn)和效價(jià)測(cè)定抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定課件18雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)HMDCKcellscontrolPCR診斷技術(shù)雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)（優(yōu)選）抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定H3N8由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。經(jīng)2次檢測(cè)、3次克隆后獲得3株穩(wěn)定分泌抗HA蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)數(shù)月，細(xì)胞生長良好，反復(fù)凍存復(fù)蘇后，仍保持穩(wěn)定的抗體分泌能力，分別命名為2B7、1C11、4G7。FPositivecontrol抗NP單抗與H1N1亞型感染MDCK的NP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對(duì)其保守性抗原位點(diǎn)的。豬是人源、禽源和豬源流感病毒的唯一共同易感宿主，它能將流感病毒傳播給人。表2－3抗NP蛋白雜交瘤上清和腹水的ELISA效價(jià)測(cè)定結(jié)果(OD630)各株單抗用間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果如表2－1所示，其中1D10和1G11效價(jià)最高，用于以下的試驗(yàn)。青、鏈霉素：華北制藥廠。BALB/C小鼠購自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。FPositivecontrol流感是第一個(gè)實(shí)行全球監(jiān)控的傳染性疾病?？笻A蛋白雜交瘤細(xì)胞的篩選FPositivecontrolHybridomasupernatantAscitefluids表2－3抗NP蛋白雜交瘤上清和腹水的ELISA效價(jià)測(cè)定結(jié)果(OD630)1D10supernatantAscitefluids1G11supernatantAscitefluidsH1N1200213×100200212×100H3N8400212×100400211×100H9N2400214×100400213×100NP200212×100200210×100雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)表2－3抗NP蛋白雜交瘤上清和腹19表2－4抗H3HA蛋白雜交瘤上清和腹水的效價(jià)測(cè)定結(jié)果2B71C114G7ELISAsupernatant3208080Ascitefluids211×10028×10027×100HIsupernatant242121Ascitefluids2122827表2－4抗H3HA蛋白雜交瘤上清和腹水的效價(jià)測(cè)定結(jié)果220單抗特異性鑒定

將抗NP單抗1D10、1G11分別用雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒包被的酶標(biāo)板作間接ELISA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果全部為陰性，說明所制備的單抗與這些病毒均無交叉反應(yīng)?？笻3HA單抗2B7、1C11、4G7分別用H1、H3、H5、H9亞型禽流感病毒及雞新城疫病毒作血凝抑制試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果三種單抗只對(duì)H3亞型流感病毒有血凝抑制效價(jià)，說明說明所制備的單抗與這些病毒均無交叉反應(yīng)。單抗特異性鑒定

將抗NP單抗1D10、21間接免疫熒光

分別以一定濃度H1、H3、H9亞型流感病毒感染MDCK細(xì)胞，固定細(xì)胞后進(jìn)行熒光染色檢測(cè)腹水。間接免疫熒光22抗NP單抗與H3N8感染MDCK的IFA檢測(cè)

FPositivecontrolGSP2/0HMDCKcellscontrolA1G11B1D10抗NP單抗與H3N8感染MDCK的IFA檢測(cè)

FPos23抗H3HA單抗與H3N8感染MDCK的IFA檢測(cè)

FPositivecontrolGSP2/0HMDCKcellscontrolE4G7D1C11C2B7抗H3HA單抗與H3N8感染MDCK的IFA檢測(cè)

F24抗NP單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)

A1G11B1D10FPositivecontrolGSP2/0HMDCKcellscontrol抗NP單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)A125抗H3HA單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)

FPositivecontrolGSP2/0HMDCKcellscontrolC2B7D1C11E4G7抗H3HA單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)26FPositivecontrolGSP2/0HMDCKcellscontrolA1G11B1D10抗NP單抗與H1N1亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)FPositivecontrolGSP2/0HMDC27GSP2/0FPositivecontrolHMDCKcellscontrolC2B7D1C11E4G7抗H3HA單抗與H1N1亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)GSP2/0FPositivecontrolHMDC28本研究所制備的3株高效價(jià)的抗HA蛋白的單抗用H1、H3、H5、H9亞型禽流感病毒及雞新城疫病毒作血凝抑制試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果三種單抗只對(duì)H3亞型禽流感病毒有血凝抑制效價(jià)抗H3HA單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)新生小牛血清（超級(jí)）：四季青生物工程公司。本研究利用雜交瘤技術(shù)獲得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3亞型禽流感病毒HA蛋白的單抗，為對(duì)禽流感病毒的進(jìn)一步研究和建立針對(duì)所有亞型禽流感病毒和H3亞型的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。Ascitefluids單克隆抗體的生產(chǎn)和效價(jià)測(cè)定ThenumberofchromosomesHMDCKcellscontrolSP2/0骨髓瘤細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。以羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP為二抗用間接ELISA鑒定了單克隆抗體的亞類。FPositivecontrolFPositivecontrol而單克隆抗體由于由于特異性以及高度親和力，用于病毒學(xué)診斷時(shí)相較于多抗有許多優(yōu)點(diǎn)。－A型、B型流感病毒屬和C型流感病毒屬青、鏈霉素：華北制藥廠。除禽流感外，常見的還有人流感、馬流感和豬流感等。8－氮鳥嘌呤：SIGMA公司。3關(guān)于抗H3N8HA蛋白單抗以羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP為二抗用間接ELISA鑒定了單克隆抗體的亞類。各株單抗用間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果如表2－1所示，其中1D10和1G11效價(jià)最高，用于以下的試驗(yàn)。3關(guān)于抗H3N8HA蛋白單抗雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)結(jié)果見表2－2。NP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對(duì)其保守性抗原位點(diǎn)的。各株單抗用間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果如表2－1所示，其中1D10和1G11效價(jià)最高，用于以下的試驗(yàn)。FPositivecontrol流感的監(jiān)控工作是預(yù)防與控制該病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。Thenumberofchromosomes間接免疫熒光法檢測(cè)單克隆抗體病毒中和試驗(yàn)（NT）血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)對(duì)人及禽、畜的危害十分巨大。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。對(duì)人及禽、畜的危害十分巨大。HMDCKcellscontrol（優(yōu)選）抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定對(duì)人及禽、畜的危害十分巨大。H3N8由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。Splenocyte40而單克隆抗體由于由于特異性以及高度親和力，用于病毒學(xué)診斷時(shí)相較于多抗有許多優(yōu)點(diǎn)。Antibodyisotypes3關(guān)于抗H3N8HA蛋白單抗BALB/C小鼠購自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。3討論3.1單抗制備中需注意的問題動(dòng)物的免疫細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞的克隆雜交瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇污染的預(yù)防和排除本研究所制備的3株高效價(jià)的抗HA蛋白的單抗用H1、H3、H5293.2關(guān)于抗NP蛋白單抗由于禽流感病毒NP蛋白相對(duì)保守，因此可以使用抗NP蛋白的抗體來檢測(cè)所有亞型的禽流感病毒。

NP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對(duì)其保守性抗原位點(diǎn)的。

3.2關(guān)于抗NP蛋白單抗303.2關(guān)于抗NP蛋白單抗

為了證實(shí)所產(chǎn)生的單克隆抗體確實(shí)是針對(duì)病毒NP蛋白保守性位點(diǎn)的，采用了多株禽流感病毒和表達(dá)的NP蛋白正篩選、陰性尿囊液及破碎的菌體負(fù)篩選的方法，篩選到了6株針對(duì)禽流感病毒NP蛋白保守性位點(diǎn)的單抗，其中2株是高效價(jià)的單抗。

3.2關(guān)于抗NP蛋白單抗

為了證實(shí)所31

本實(shí)驗(yàn)所制備的2株高效價(jià)的抗NP蛋白的單抗用雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒檢測(cè)，均無交叉反應(yīng)，具有很好的特異性。3.2關(guān)于抗NP蛋白單抗

本實(shí)驗(yàn)所制備的2株高效價(jià)的抗NP蛋白的單32

本研究所獲得的針對(duì)禽流感病毒NP蛋白的單克隆抗體為禽流感的診斷，甚至是A型流感病毒的診斷提供了高質(zhì)量的試劑。本實(shí)驗(yàn)室已在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了雙夾心ELISA方法檢測(cè)不同亞型的禽流感病毒的研究，并已經(jīng)研制出了相關(guān)試劑盒應(yīng)用于臨床檢測(cè)，為實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室診斷的標(biāo)準(zhǔn)化、開展流行病學(xué)調(diào)查研究奠定了很好的基礎(chǔ)。3.2關(guān)于抗NP蛋白單抗

本研究所獲得的針對(duì)禽流感病毒NP蛋白的單33單克隆抗體的生產(chǎn)和效價(jià)測(cè)定Ascitefluids本實(shí)驗(yàn)所制備的2株高效價(jià)的抗NP蛋白的單抗用雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒檢測(cè)，均無交叉反應(yīng)，具有很好的特異性。雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)（優(yōu)選）抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定--H5andH7AscitefluidsNP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對(duì)其保守性抗原位點(diǎn)的。Splenocyte40青、鏈霉素：華北制藥廠。豬是人源、禽源和豬源流感病毒的唯一共同易感宿主，它能將流感病毒傳播給人?？筃P單抗與H1N1亞型感染MDCK的以羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP為二抗用間接ELISA鑒定了單克隆抗體的亞類。精制小牛血清：Hyclone公司。HMDCKcellscontrol表2－3抗NP蛋白雜交瘤上清和腹水的ELISA效價(jià)測(cè)定結(jié)果(OD630)BALB/C小鼠購自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。FPositivecontrolAntibodyisotypesHMDCKcellscontrol由于禽流感病毒NP蛋白相對(duì)保守，因此可以使用抗NP蛋白的抗體來檢測(cè)所有亞型的禽流感病毒。NP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對(duì)其保守性抗原位點(diǎn)的。2關(guān)于抗NP蛋白單抗Splenocyte40NP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對(duì)其保守性抗原位點(diǎn)的。流感是第一個(gè)實(shí)行全球監(jiān)控的傳染性疾病。除禽流感外，常見的還有人流感、馬流感和豬流感等。結(jié)果見表2－2。由于禽流感病毒NP蛋白相對(duì)保守，因此可以使用抗NP蛋白的抗體來檢測(cè)所有亞型的禽流感病毒。FPositivecontrol8－氮鳥嘌呤：SIGMA公司。神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NIT）單克隆抗體的生產(chǎn)、純化和效價(jià)測(cè)定NP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對(duì)其保守性抗原位點(diǎn)的。HMDCKcellscontrolHMDCKcellscontrol抗H3HA單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)抗H3HA單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)抗NP雜交瘤細(xì)胞上清ELISA檢測(cè)結(jié)果(OD630)由于禽流感病毒NP蛋白相對(duì)保守，因此可以使用抗NP蛋白的抗體來檢測(cè)所有亞型的禽流感病毒。豬是人源、禽源和豬源流感病毒的唯一共同易感宿主，它能將流感病毒傳播給人。supernatantAscitefluids由于禽流感病毒NP蛋白相對(duì)保守，因此可以使用抗NP蛋白的抗體來檢測(cè)所有亞型的禽流感病毒。3.3關(guān)于抗H3N8HA蛋白單抗

本研究所制備的3株高效價(jià)的抗HA蛋白的單抗用H1、H3、H5、H9亞型禽流感病毒及雞新城疫病毒作血凝抑制試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果三種單抗只對(duì)H3亞型禽流感病毒有血凝抑制效價(jià)說明所制備的單抗與這些病毒均無交叉反應(yīng)，具有很好的特異性。單克隆抗體的生產(chǎn)和效價(jià)測(cè)定NP蛋白并非完全保守，因此要保證所34抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定35（優(yōu)選）抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定（優(yōu)選）抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定361.文獻(xiàn)綜述

1.1流感的病原學(xué)流感病毒在病毒分類學(xué)上屬正粘病毒科－A型、B型流感病毒屬和C型流感病毒屬A型流感病毒亞型－HA:16－NA:10高致病性禽流感(HPAI)--H5andH7

1.文獻(xiàn)綜述

1.1流感的病原學(xué)371.2流感病毒檢測(cè)技術(shù)病毒的分離鑒定血清學(xué)診斷技術(shù)血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NIT）病毒中和試驗(yàn)（NT）免疫熒光技術(shù)（IFT）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）1.2流感病毒檢測(cè)技術(shù)38分子生物學(xué)診斷技術(shù)

PCR診斷技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCRNASBA法核酸探針技術(shù)

M檢測(cè)法基因芯片技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù)

PCR診斷技術(shù)392單抗的制備與鑒定

2.1研究目的與意義

流感是第一個(gè)實(shí)行全球監(jiān)控的傳染性疾病。對(duì)人及禽、畜的危害十分巨大。除禽流感外，常見的還有人流感、馬流感和豬流感等。動(dòng)物流感尤其是禽流感與人類流感和人類健康非常密切，禽流感被認(rèn)為是人流感病毒的保存和發(fā)生變異的新基因的來源，這種聯(lián)系是通過中間宿主來實(shí)現(xiàn)的。豬是人源、禽源和豬源流感病毒的唯一共同易感宿主，它能將流感病毒傳播給人。

2單抗的制備與鑒定

2.1研究目的與意義402.1研究目的與意義

流感的監(jiān)控工作是預(yù)防與控制該病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。國內(nèi)對(duì)流感病毒的臨床診斷主要是對(duì)抗體的檢測(cè)。病毒抗原檢測(cè)方面，雖然病毒的分離鑒定是診斷禽流感的一種可靠方法，但病毒的分離鑒定、動(dòng)物接種試驗(yàn)操作復(fù)雜，周期長，難以滿足對(duì)高致病性禽流感快速診斷的需要。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、核酸探針等方法則需要較好的試驗(yàn)條件和較高的人員素質(zhì)，目前還難以廣泛推廣。2.1研究目的與意義流感的監(jiān)控工作41結(jié)果見表2－2。HybridomaAscitefluids為了證實(shí)所產(chǎn)生的單克隆抗體確實(shí)是針對(duì)病毒NP蛋白保守性位點(diǎn)的，采用了多株禽流感病毒和表達(dá)的NP蛋白正篩選、陰性尿囊液及破碎的菌體負(fù)篩選的方法，篩選到了6株針對(duì)禽流感病毒NP蛋白保守性位點(diǎn)的單抗，其中2株是高效價(jià)的單抗?？笻3HA單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)結(jié)果見表2－2。FPositivecontrol免疫脾細(xì)胞的制備2單抗的制備與鑒定

2.8－氮鳥嘌呤：SIGMA公司。HMDCKcellscontrol抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定2關(guān)于抗NP蛋白單抗FPositivecontrol本研究利用雜交瘤技術(shù)獲得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3亞型禽流感病毒HA蛋白的單抗，為對(duì)禽流感病毒的進(jìn)一步研究和建立針對(duì)所有亞型禽流感病毒和H3亞型的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NIT）免疫脾細(xì)胞的制備雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)結(jié)果見表2－2。對(duì)人及禽、畜的危害十分巨大。病毒中和試驗(yàn)（NT）

流感病毒的HA蛋白具有亞型特異性，但NP蛋白卻相對(duì)保守。利用NP蛋白和HA蛋白分別有望建立一種所有亞型禽流感病毒的檢測(cè)方法和診斷流感病毒亞型的方法。而單克隆抗體由于由于特異性以及高度親和力，用于病毒學(xué)診斷時(shí)相較于多抗有許多優(yōu)點(diǎn)。本研究利用雜交瘤技術(shù)獲得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3亞型禽流感病毒HA蛋白的單抗，為對(duì)禽流感病毒的進(jìn)一步研究和建立針對(duì)所有亞型禽流感病毒和H3亞型的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。2.1研究目的與意義結(jié)果見表2－2。流感病毒的HA蛋白422.2材料方法

細(xì)胞、病毒與動(dòng)物

SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。流感病毒H9N2、H1N1由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，保存。H3N8由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒（EDS-76）、禽腺病毒1型（APMV-1）購自北京梅里亞維通公司。

SPF雞胚購自北京梅里亞維通公司。

BALB/C小鼠購自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2.2材料方法

細(xì)胞、病毒與動(dòng)物

S43培養(yǎng)基及主要試劑

RPMI-1640、HAT、HT、弗氏完全與不完全佐劑：GIBCOL公司。新生小牛血清（超級(jí)）：四季青生物工程公司。精制小牛血清：Hyclone公司。融合劑50％PEG（P7181）、羊抗鼠IgG-HRP、

8－氮鳥嘌呤：SIGMA公司。羊抗鼠IgG1、G2a－HRP：SBA公司。青、鏈霉素：華北制藥廠。培養(yǎng)基及主要試劑

RPMI-1640、HAT、HT、弗氏完全44方法

病毒粒子的大量制備與純化免疫原的制備動(dòng)物免疫

SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的活化與制備免疫脾細(xì)胞的制備細(xì)胞融合方法病毒粒子的大量制備與純化45雜交瘤細(xì)胞上清檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的克隆化（有限稀釋法）雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)單克隆抗體的生產(chǎn)、純化和效價(jià)測(cè)定單克隆抗體亞類鑒定單抗特異性鑒定間接免疫熒光法檢測(cè)單克隆抗體方法雜交瘤細(xì)胞上清檢測(cè)方法462.3結(jié)果與分析

抗NP蛋白雜交瘤細(xì)胞的篩選用間接ELISA方法進(jìn)行篩選。使用A法免疫制備了1株抗NP蛋白的單抗1D10，使用B法獲得了4株單抗（4F4、1C3、1G11、1C2），使用C法獲得了1株單抗(2E7)。各株單抗用間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果如表2－1所示，其中1D10和1G11效價(jià)最高，用于以下的試驗(yàn)。2.3結(jié)果與分析

抗NP蛋白雜交瘤細(xì)胞的篩選47抗NP雜交瘤細(xì)胞上清ELISA檢測(cè)結(jié)果(OD630)

Antigens1D104F41C31G111C22E7H1N10.8310.4080.2760.5980.1980.211H3N81.0860.5670.4011.1590.5130.456H9N20.9750.4190.3620.6870.3670.386陰性尿囊液0.1320.0400.0520.0530.095NNP1.1821.0370.4641.0110.5210.811BL21NNNNN0.057注：N表示沒有檢測(cè)；所建立的ELISA臨界值均為0.2?？筃P雜交瘤細(xì)胞上清ELISA檢測(cè)結(jié)果(OD630) Ant48抗HA蛋白雜交瘤細(xì)胞的篩選

通過血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行篩選。經(jīng)2次檢測(cè)、3次克隆后獲得3株穩(wěn)定分泌抗HA蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)數(shù)月，細(xì)胞生長良好，反復(fù)凍存復(fù)蘇后，仍保持穩(wěn)定的抗體分泌能力，分別命名為2B7、1C11、4G7。抗HA蛋白雜交瘤細(xì)胞的篩選通過血凝抑制49雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)結(jié)果見表2－2。單克隆抗體亞類鑒定

以羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP為二抗用間接ELISA鑒定了單克隆抗體的亞類。結(jié)果見表2－2?？沽鞲胁《締慰寺】贵w的制備與鑒定課件50表2－2單克隆抗體亞型及相應(yīng)雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)AntigenCellsAntibodyisotypesThenumberofchromosomesSplenocyte40SP2/070HybridomaNP1D101G11G2aG194(89~97)83(81~86)HA2B71C114G7G2aG1G2a90(82~94)98(92~103)87(79~87)表2－2單克隆抗體亞型及相應(yīng)雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)Antig51單克隆抗體的生產(chǎn)和效價(jià)測(cè)定抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定課件52雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)HMDCKcellscontrolPCR診斷技術(shù)雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)（優(yōu)選）抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定H3N8由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。經(jīng)2次檢測(cè)、3次克隆后獲得3株穩(wěn)定分泌抗HA蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)數(shù)月，細(xì)胞生長良好，反復(fù)凍存復(fù)蘇后，仍保持穩(wěn)定的抗體分泌能力，分別命名為2B7、1C11、4G7。FPositivecontrol抗NP單抗與H1N1亞型感染MDCK的NP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對(duì)其保守性抗原位點(diǎn)的。豬是人源、禽源和豬源流感病毒的唯一共同易感宿主，它能將流感病毒傳播給人。表2－3抗NP蛋白雜交瘤上清和腹水的ELISA效價(jià)測(cè)定結(jié)果(OD630)各株單抗用間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果如表2－1所示，其中1D10和1G11效價(jià)最高，用于以下的試驗(yàn)。青、鏈霉素：華北制藥廠。BALB/C小鼠購自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。FPositivecontrol流感是第一個(gè)實(shí)行全球監(jiān)控的傳染性疾病?？笻A蛋白雜交瘤細(xì)胞的篩選FPositivecontrolHybridomasupernatantAscitefluids表2－3抗NP蛋白雜交瘤上清和腹水的ELISA效價(jià)測(cè)定結(jié)果(OD630)1D10supernatantAscitefluids1G11supernatantAscitefluidsH1N1200213×100200212×100H3N8400212×100400211×100H9N2400214×100400213×100NP200212×100200210×100雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)表2－3抗NP蛋白雜交瘤上清和腹53表2－4抗H3HA蛋白雜交瘤上清和腹水的效價(jià)測(cè)定結(jié)果2B71C114G7ELISAsupernatant3208080Ascitefluids211×10028×10027×100HIsupernatant242121Ascitefluids2122827表2－4抗H3HA蛋白雜交瘤上清和腹水的效價(jià)測(cè)定結(jié)果254單抗特異性鑒定

將抗NP單抗1D10、1G11分別用雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒包被的酶標(biāo)板作間接ELISA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果全部為陰性，說明所制備的單抗與這些病毒均無交叉反應(yīng)。抗H3HA單抗2B7、1C11、4G7分別用H1、H3、H5、H9亞型禽流感病毒及雞新城疫病毒作血凝抑制試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果三種單抗只對(duì)H3亞型流感病毒有血凝抑制效價(jià)，說明說明所制備的單抗與這些病毒均無交叉反應(yīng)。單抗特異性鑒定

將抗NP單抗1D10、55間接免疫熒光

分別以一定濃度H1、H3、H9亞型流感病毒感染MDCK細(xì)胞，固定細(xì)胞后進(jìn)行熒光染色檢測(cè)腹水。間接免疫熒光56抗NP單抗與H3N8感染MDCK的IFA檢測(cè)

FPositivecontrolGSP2/0HMDCKcellscontrolA1G11B1D10抗NP單抗與H3N8感染MDCK的IFA檢測(cè)

FPos57抗H3HA單抗與H3N8感染MDCK的IFA檢測(cè)

FPositivecontrolGSP2/0HMDCKcellscontrolE4G7D1C11C2B7抗H3HA單抗與H3N8感染MDCK的IFA檢測(cè)

F58抗NP單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)

A1G11B1D10FPositivecontrolGSP2/0HMDCKcellscontrol抗NP單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)A159抗H3HA單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)

FPositivecontrolGSP2/0HMDCKcellscontrolC2B7D1C11E4G7抗H3HA單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)60FPositivecontrolGSP2/0HMDCKcellscontrolA1G11B1D10抗NP單抗與H1N1亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)FPositivecontrolGSP2/0HMDC61GSP2/0FPositivecontrolHMDCKcellscontrolC2B7D1C11E4G7抗H3HA單抗與H1N1亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)GSP2/0FPositivecontrolHMDC62本研究所制備的3株高效價(jià)的抗HA蛋白的單抗用H1、H3、H5、H9亞型禽流感病毒及雞新城疫病毒作血凝抑制試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果三種單抗只對(duì)H3亞型禽流感病毒有血凝抑制效價(jià)抗H3HA單抗與AIVH9亞型感染MDCK的IFA檢測(cè)新生小牛血清（超級(jí)）：四季青生物工程公司。本研究利用雜交瘤技術(shù)獲得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3亞型禽流感病毒HA蛋白的單抗，為對(duì)禽流感病毒的進(jìn)一步研究和建立針對(duì)所有亞型禽流感病毒和H3亞型的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。Ascitefluids單克隆抗體的生產(chǎn)和效價(jià)測(cè)定ThenumberofchromosomesHMDCKcellscontrolSP2/0骨髓瘤細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。以羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP為二抗用間接ELISA鑒定了單克隆抗體的亞類。FPositivecontrolFPositivecontrol而單克隆抗體由于由于特異性以及高度親和力，用于病毒學(xué)診斷時(shí)相較于多抗有許多優(yōu)點(diǎn)。－A型、B型流感病毒屬和C型流感病毒屬青、鏈霉素：華北制藥廠。除禽流感外，常見的還有人流感、馬流感和豬流感等。8－氮鳥嘌呤：SIGMA公司。3關(guān)于抗H3N8HA蛋白單抗以羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP為二抗用間接ELISA鑒定了單克隆抗體的亞類。各株單抗用間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果如表2－1所示，其中1D10和1G11效價(jià)最高，用于以下的試驗(yàn)。3關(guān)于抗H3N8HA蛋白單抗雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)結(jié)果見表2－2。NP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對(duì)其保守性抗原位點(diǎn)的。各株單抗用間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果如表2－1所示，其中1D10和1G11效價(jià)最高，用于以下的試驗(yàn)。FPositivecontrol流感的監(jiān)控工作是預(yù)防與控制該病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。Thenumberofchromosomes間接免疫熒光法檢測(cè)單克隆抗體病毒中和試驗(yàn)（NT）血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)對(duì)人及禽、畜的危害十分巨大。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。對(duì)人及禽、畜的危害十分巨大。HMDCKcellscontrol（優(yōu)選）抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定對(duì)人及禽、畜的危害十分巨大。H3N8由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。Splenocyte40而單克隆抗體由于由于特異性以及高度親和力，用于病毒學(xué)診斷時(shí)相較于多抗有許多優(yōu)點(diǎn)。Antibodyisotypes3關(guān)于抗H3N8HA蛋白單抗BALB/C小鼠購自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。3討論3.1單抗制備中需注意的問題動(dòng)物的免疫細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞的克隆雜交瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇污染的預(yù)防和排除本研究所制備的3株高效價(jià)的抗HA蛋白的單抗用H1、H3、H5633.2關(guān)于抗NP蛋白單抗由于禽流感病毒NP蛋白相對(duì)保守，因此可以使用抗NP蛋白的抗體來檢測(cè)所有亞型的禽流感病毒。

NP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對(duì)其保守性抗原位點(diǎn)的。

3.2關(guān)于抗NP蛋白單抗643.2關(guān)于抗NP蛋白單抗

為了證實(shí)所產(chǎn)