免疫學補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件

[免疫學]補體參與反應T細胞數(shù)量及其功能檢測[免疫學]補體參與反應T細胞數(shù)量及其功能檢測[免疫學]補體參與反應T細胞數(shù)量及其功能檢測實驗三補體參與的反應T細胞數(shù)量及其功能檢測PartI補體參與的反應補體的溶血反應PartIIT細胞數(shù)量及其功能檢測E花環(huán)形成試驗－－數(shù)量測定淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗：形態(tài)學方法3H—TDR摻入法MTT比色法功能[免疫學]補體參與反應T細胞數(shù)量及其功能檢測[免疫學]補體1[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件2[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件3[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件4[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件5孔號SRBC溶血素補體NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴－6滴33滴－3滴6滴43滴－－9滴

步驟1、取24孔板，按下表加入各成分；

2、將24孔板放在37℃溫箱內(nèi)15-30min，觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果:孔號SRBC溶血素補體NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴－66PartIIT細胞數(shù)量及其功能檢測PartIIT細胞數(shù)量及其功能檢測72.E花環(huán)形成試驗

原理人外周血T細胞表面具有天然的能與綿羊紅細胞(SRBC)表面糖肽相結(jié)合的受體－E受體（CD2分子），可結(jié)合SRBC形成花環(huán)樣細胞團，是T細胞特有的表面標志。

檢測T細胞數(shù)量，間接判斷機體的細胞免疫狀況。2.E花環(huán)形成試驗原理檢測T細胞數(shù)量，間接判斷機體的8材料肝素抗凝血、綿羊紅細胞(SRBC)淋巴細胞分層液、Hank’s液、1640培養(yǎng)液、0.5％戊二醛固定液、燦爛甲酚蘭染液試管、滴管、離心機、微量移液器、玻片、顯微鏡等材料9

步驟：（動作輕柔；分清滴管及槍頭?。。。湃「嗡乜鼓c等量Hank’s液稀釋混勻血3ml，用滴管貼管壁（傾斜30°）輕輕疊加于3ml分離液上（界面要清晰）→→→

配平后1800rpm離心13mins。

1.淋巴細胞懸液的制備：人淋巴細胞比重：1.070淋巴細胞分層液：1.077人紅細胞比重：1.092步驟：（動作輕柔；分清滴管及槍頭！10稀釋的血液

分層液離心前稀釋的血漿

單個核細胞分層液粒細胞紅細胞離心后稀釋的血液離心前稀釋的血漿離心后11[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件12⑵另取一支滴管，仔細吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的單個核細胞，放入盛有5mlHank’s液的試管→→→2000rpm離心5mins。

(3)棄上清（傾倒時液體不要回流），將沉淀的淋巴細胞輕彈混勻后加入Hank’s液5ml，重復離心兩次。2.棄去上清，留經(jīng)過洗滌的淋巴細胞懸液（約0.1ml）與綿羊紅細胞0.1ml

、1640營養(yǎng)液0.1ml混合（分清槍頭）→→→輕彈混勻后放于37℃溫箱15mins。＊離心時要配平⑵另取一支滴管，仔細吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的133.取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關(guān)鍵，轉(zhuǎn)速一定要慢，一啟動即關(guān)，來回數(shù)次即可）,室溫靜置2-3mins4.吸去100-150ul上清液，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，輕輕混勻靜置5mins。5.取一滴（25ul）液體滴片，加一滴燦爛甲酚蘭染液，加蓋玻片。3.取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關(guān)146.高倍鏡下觀察，計數(shù)100個淋巴細胞，計算花環(huán)形成率。淋巴細胞上結(jié)合≥3個SRBC者為E花環(huán)陽性。正常參考值：EtRFC：64.4±6.7％；

EaRFC：23.6±3.5％；

EsRFC：3.3±2.6％6.高倍鏡下觀察，計數(shù)100個淋巴細胞，計算花環(huán)形成率。淋巴15

結(jié)果T淋巴細胞SRBC結(jié)果T淋巴細胞SRBC16[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件17淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗－－

原理

T細胞在體外培養(yǎng)時，受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細胞體積增大并能進行分裂的淋巴母細胞，稱淋巴細胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低，可反映機體的細胞免疫水平，故可作為測定機體免疫功能的指標。三種方法形態(tài)學方法、3H-TdR摻入法、MTT比色法淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗－－原理18

根據(jù)胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構(gòu)造與核仁的有無。成熟小淋巴細胞：核染色深、沒有核仁，胞漿少、染色為輕度嗜堿性；過渡型淋巴細胞：大于小淋巴細胞、核染色比較疏松，胞漿比較多，但是出現(xiàn)核仁；淋巴母細胞：體積增大，形態(tài)不規(guī)則，核變大、核質(zhì)染色疏松，有核仁1－2個，胞漿豐富，常出現(xiàn)胞漿空泡；其他細胞：中性粒細胞在培養(yǎng)72消失后，絕大部分衰變或死亡呈碎片。形態(tài)學方法：〔鏡下觀察〕

－－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗根據(jù)胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構(gòu)造19淋巴細胞轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化的淋巴細胞轉(zhuǎn)化的淋巴細胞＋未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞×100％正常參考值：80％紅細胞未轉(zhuǎn)化淋巴細胞轉(zhuǎn)化的淋巴細胞淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗瑞氏染色10×40

淋巴細胞轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化的淋巴細胞轉(zhuǎn)化的淋巴細胞＋未轉(zhuǎn)化的淋巴細20[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件213H—TDR摻入法

－－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗T細胞受到PHA或特異性抗原刺激后，發(fā)生有絲分裂，細胞進入S期，此時在細胞培養(yǎng)液中加入氚標記的胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TDR)，可以被細胞攝入而摻入DNA中，通過β-液體閃爍計數(shù)器測定3H-TDR的摻入量，判斷細胞的增殖程度。3H—TDR摻入法

－－－22MTT比色法

－－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗

MTT為一種黃色可溶性物質(zhì)，細胞活化增殖時通過線粒體能量代謝，將MTT代謝成藍紫色的甲臢，沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，形成甲臢的量與細胞活化增殖的程度呈正比。甲臢經(jīng)鹽酸異丙醇溶解后呈紫藍色，置于酶標儀下根據(jù)顯色程度即可知道甲臢量并反映細胞活化程度。

MTT比色法

－－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗23

MTT

Formazan

InsolubleMTTFormazanInsoluble241.補體溶血反應的原理、步驟、結(jié)果及分析。2.E花環(huán)形成試驗的原理、步驟、繪制鏡下觀察結(jié)果。3.繪制淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（形態(tài)學法）鏡下觀察結(jié)果。實驗報告1.補體溶血反應的原理、步驟、結(jié)果及分析。實驗報告25第4次實驗課內(nèi)容免疫標記技術(shù)：ELISA免疫病理實驗實驗課考試第4次實驗課內(nèi)容免疫標記技術(shù)：ELISA2641、學問是異常珍貴的東西，從任何源泉吸收都不可恥。——阿卜·日·法拉茲

42、只有在人群中間，才能認識自己?！聡?/p>

43、重復別人所說的話，只需要教育；而要挑戰(zhàn)別人所說的話，則需要頭腦。——瑪麗·佩蒂博恩·普爾

44、卓越的人一大優(yōu)點是：在不利與艱難的遭遇里百折不饒?！惗喾?/p>

45、自己的飯量自己知道。——蘇聯(lián)41、學問是異常珍貴的東西，從任何源泉吸收都不可恥。——阿卜27[免疫學]補體參與反應T細胞數(shù)量及其功能檢測[免疫學]補體參與反應T細胞數(shù)量及其功能檢測[免疫學]補體參與反應T細胞數(shù)量及其功能檢測實驗三補體參與的反應T細胞數(shù)量及其功能檢測PartI補體參與的反應補體的溶血反應PartIIT細胞數(shù)量及其功能檢測E花環(huán)形成試驗－－數(shù)量測定淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗：形態(tài)學方法3H—TDR摻入法MTT比色法功能[免疫學]補體參與反應T細胞數(shù)量及其功能檢測[免疫學]補體28[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件29[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件30[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件31[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件32孔號SRBC溶血素補體NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴－6滴33滴－3滴6滴43滴－－9滴

步驟1、取24孔板，按下表加入各成分；

2、將24孔板放在37℃溫箱內(nèi)15-30min，觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果:孔號SRBC溶血素補體NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴－633PartIIT細胞數(shù)量及其功能檢測PartIIT細胞數(shù)量及其功能檢測342.E花環(huán)形成試驗

原理人外周血T細胞表面具有天然的能與綿羊紅細胞(SRBC)表面糖肽相結(jié)合的受體－E受體（CD2分子），可結(jié)合SRBC形成花環(huán)樣細胞團，是T細胞特有的表面標志。

檢測T細胞數(shù)量，間接判斷機體的細胞免疫狀況。2.E花環(huán)形成試驗原理檢測T細胞數(shù)量，間接判斷機體的35材料肝素抗凝血、綿羊紅細胞(SRBC)淋巴細胞分層液、Hank’s液、1640培養(yǎng)液、0.5％戊二醛固定液、燦爛甲酚蘭染液試管、滴管、離心機、微量移液器、玻片、顯微鏡等材料36

步驟：（動作輕柔；分清滴管及槍頭！?。。湃「嗡乜鼓c等量Hank’s液稀釋混勻血3ml，用滴管貼管壁（傾斜30°）輕輕疊加于3ml分離液上（界面要清晰）→→→

配平后1800rpm離心13mins。

1.淋巴細胞懸液的制備：人淋巴細胞比重：1.070淋巴細胞分層液：1.077人紅細胞比重：1.092步驟：（動作輕柔；分清滴管及槍頭！37稀釋的血液

分層液離心前稀釋的血漿

單個核細胞分層液粒細胞紅細胞離心后稀釋的血液離心前稀釋的血漿離心后38[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件39⑵另取一支滴管，仔細吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的單個核細胞，放入盛有5mlHank’s液的試管→→→2000rpm離心5mins。

(3)棄上清（傾倒時液體不要回流），將沉淀的淋巴細胞輕彈混勻后加入Hank’s液5ml，重復離心兩次。2.棄去上清，留經(jīng)過洗滌的淋巴細胞懸液（約0.1ml）與綿羊紅細胞0.1ml

、1640營養(yǎng)液0.1ml混合（分清槍頭）→→→輕彈混勻后放于37℃溫箱15mins。＊離心時要配平⑵另取一支滴管，仔細吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的403.取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關(guān)鍵，轉(zhuǎn)速一定要慢，一啟動即關(guān)，來回數(shù)次即可）,室溫靜置2-3mins4.吸去100-150ul上清液，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，輕輕混勻靜置5mins。5.取一滴（25ul）液體滴片，加一滴燦爛甲酚蘭染液，加蓋玻片。3.取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關(guān)416.高倍鏡下觀察，計數(shù)100個淋巴細胞，計算花環(huán)形成率。淋巴細胞上結(jié)合≥3個SRBC者為E花環(huán)陽性。正常參考值：EtRFC：64.4±6.7％；

EaRFC：23.6±3.5％；

EsRFC：3.3±2.6％6.高倍鏡下觀察，計數(shù)100個淋巴細胞，計算花環(huán)形成率。淋巴42

結(jié)果T淋巴細胞SRBC結(jié)果T淋巴細胞SRBC43[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件44淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗－－

原理

T細胞在體外培養(yǎng)時，受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細胞體積增大并能進行分裂的淋巴母細胞，稱淋巴細胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低，可反映機體的細胞免疫水平，故可作為測定機體免疫功能的指標。三種方法形態(tài)學方法、3H-TdR摻入法、MTT比色法淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗－－原理45

根據(jù)胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構(gòu)造與核仁的有無。成熟小淋巴細胞：核染色深、沒有核仁，胞漿少、染色為輕度嗜堿性；過渡型淋巴細胞：大于小淋巴細胞、核染色比較疏松，胞漿比較多，但是出現(xiàn)核仁；淋巴母細胞：體積增大，形態(tài)不規(guī)則，核變大、核質(zhì)染色疏松，有核仁1－2個，胞漿豐富，常出現(xiàn)胞漿空泡；其他細胞：中性粒細胞在培養(yǎng)72消失后，絕大部分衰變或死亡呈碎片。形態(tài)學方法：〔鏡下觀察〕

－－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗根據(jù)胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構(gòu)造46淋巴細胞轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化的淋巴細胞轉(zhuǎn)化的淋巴細胞＋未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞×100％正常參考值：80％紅細胞未轉(zhuǎn)化淋巴細胞轉(zhuǎn)化的淋巴細胞淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗瑞氏染色10×40

淋巴細胞轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化的淋巴細胞轉(zhuǎn)化的淋巴細胞＋未轉(zhuǎn)化的淋巴細47[免疫學]補體參與反應-T細胞數(shù)量及其功能檢測課件483H—TDR摻入法

－－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗T細胞受到PHA或特異性抗原刺激后，發(fā)生有絲分裂，細胞進入S期，此時在細胞培養(yǎng)液中加入氚標記的胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TDR)，可以被細胞攝入而摻入DNA中，通過β-液體閃爍計數(shù)器測