堿性磷酸酶的分離純化及比活性與米氏常數(shù)測定

堿性磷酸酶的分離純化及比活性與米氏常數(shù)測定一、實驗原理.堿性磷酸酶的分離純化. 機械破碎法制備肝勻漿低濃度乙酸鈉：低滲破膜低濃度乙酸鎂：保護和穩(wěn)定AKP.有機溶劑沉淀法分離純化AKP加入不同有機溶劑重復離心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白質33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP.比活性測定.比活性的定義米單位重量的蛋白質樣品中所含的酶活性單位。米通常用每毫克蛋白質具有的酶活性單位來表示。米用以鑒定酶的純化程度，是酶分離提純完成的評價指標之一。.測定樣品的比活性必須測定：米每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。米每毫升樣品中的蛋白質毫克數(shù)。優(yōu)質范文3.磷酸苯二鈉法測定堿性磷酸酶活性反應原理H+HO-P-ONaNa

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+H￡—NC=0KjMCNnH￡—N-C—N%《一氨基安替比林H+HO-P-ONaNa

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+H￡—NC=0KjMCNnH￡—N-C—N%《一氨基安替比林H.C-N(3),米氏常數(shù)測定Km即為米氏常數(shù)，Vmax為最大反應速度*如上式表示，米氏常數(shù)是反應速度為最大值的一半時的底物濃度，因此，米氏常數(shù)的單位為1^14。當反應速度等于最大速度一半時，即V=1/2Vmax,Km=[S]*吸光度表示不同底物濃度時的酶反應速度。以吸光度的倒數(shù)作縱坐標，以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標，按Lineweaver-Burk作圖法可求出Km值。優(yōu)質范文

圖雙倒數(shù)作圖法圖雙倒數(shù)作圖法二.器材721分光光度計 臺式離心機 恒溫水浴鍋 微量移液器托盤天平 勻漿器 試管三.試劑0.5mol/L醋酸鎂溶液稱取醋酸鎂5.3625g溶于蒸餾水中，稀釋至50ml.0.1mol/L醋酸鈉溶液0.1mol/L醋酸鈉溶液稱取醋酸鈉0.0820g溶于蒸鐳水優(yōu)質范文中，稀釋至10ml.0.01mol/L醋酸鎂---醋酸鈉溶液 取0.5mol/L醋酸鎂溶液2ml及0.1mol/L醋酸鈉溶溶液101^,混合均勻后加蒸餾水稀釋至100ml.丙酮（分析純）.95%乙醇（分析純）.Tris緩沖液（Ph8.8）稱取Tris6.05g,用蒸餾水溶解成50ml,為0.1mol/LTris液，取0.1mol/LTris液10ml,加0.5mol/L醋酸鎂2ml,加蒸餾水80ml,再用1%醋酸調pH至8.8,然后用蒸餾水稀釋至100ml.0.01mol/L基質液 稱取磷酸苯二鈉（c6H5PO4Na2.2H2o）0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分別溶于煮沸冷卻后的蒸餾水中；兩液混合并蒸餾水稀釋至501^,加0.2ml氯仿防腐，盛于棕色瓶中，冰箱內保存，可用一星期；臨用時與等量0.1mol/LpH10的碳酸鹽緩沖液混合即可.0.1mol/LpH10的碳酸鹽緩沖液 稱取無水碳酸鈉0.318g及碳酸氫鈉0.168g溶于蒸餾水,稀釋至50ml.堿性溶液 量取0.5mol/L氫氧化鈉溶液與0.5mol/L碳酸氫鈉溶液各20ml,混合后加蒸餾水至100ml.優(yōu)質范文0.5%鐵氧化鉀溶液 稱取鐵氧化鉀0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸餾水中，溶解后兩液混合均勻，再加蒸餾水至50ml,置棕色瓶中暗處保存.0.1mol/L醋酸鎂溶液 稱取醋酸鎂0.2145g溶于蒸餾水中，稀釋至10ml.酚標準液(0.1mg/ml).四.實驗步驟. “堿性磷酸酶分離純化”實驗操作優(yōu)質范文

21兔肝剪碎置于玻璃勻漿管巾，加0.01m』L醋酸鎂anniol/LMV酸納溶液6血,在勻漿器上勻漿J0000甲明1分機肝勻聚倒人刻度離心管.記錄體網(wǎng)A液）（約8ml）0吸出A液0Jml置于另一試管中，在此試管中加4.9mlpH&81昧緩沖液（fV管），待測比活性用。然后在A液中加2ml正丁醇，用玻棒充分攪拌34分鐘.隨后室溫放置30分鐘彈層握紙過濾,取漉液，加等體積等丙酮，混勻,2000rpm離心5分鐘.上清液（棄去）沉淀I加05moVL解假鐵4ml（B液）,記錄體積0取B液（）.1nil置于另1一試管中，加4.9mlpH8.8Tris緩沖液（B噌），待測比活性用。rn沉淀（棄去）上清液+95%冷乙醒至60%（狗43nJ）,混勻,2500ipm離心5分鐘口i~~}上清液（棄去）沉淀加05moVL錯酸鎂3加溶解，記錄體積（C液）口取C液0」ml置于另一試管中，加2.0mlpH8.8Tris一沖液（C噌），待側血活性用：加冷丙嗣至33%（約L5n）l）2000卬川離心5分鐘口沉淀（棄去）上清液加冷丙隅至50%（約L5ml）.3500rpm離心10分鐘.上清液（棄去）沉淀加5mlpH