重組DNA技術(shù)課件

第十八章重組DNA技術(shù)Chapter18TechniquesofRecombinantDNA第十八章重組DNA技術(shù)◆DNA分子體外重組技術(shù)和核苷酸序列分析技術(shù)標(biāo)志了基因工程時代的誕生?！?973年，HerbertBoyer和StanleyCohen首次成功實(shí)現(xiàn)DNA分子的體外重組。◆1977年，F(xiàn)rederickSanger和WalterGilbert發(fā)明了DNA測序法。◆重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnique)：指在體外重新組合DNA分子，并使它們在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中增殖的遺傳操作?！鬌NA分子體外重組技術(shù)和核苷酸序列分析技術(shù)標(biāo)志了基因工程◆遺傳工程(GeneticEngineering)：借助生物學(xué)技術(shù)，對生物遺傳物質(zhì)進(jìn)行更改和/或重新組合，以改變生物的遺傳性狀或創(chuàng)造新的生物品種的遺傳學(xué)研究技術(shù)?！暨z傳工程有廣義和狹義之別，狹義遺傳工程專指重組DNA技術(shù)(即基因工程)，廣義遺傳工程包括細(xì)胞水平的遺傳操作(也稱細(xì)胞工程)和基因工程。◆克?。菏怯⑽摹癱lone

”或“cloning

的音譯，源于希臘文“Klone”，本意為無性繁殖系，即通過無性繁殖而產(chǎn)生的完全相同的子代集合體。◆遺傳工程(GeneticEngineering)：借助重組DNA技術(shù)的基本步驟

重組DNA技術(shù)的基本步驟第一節(jié)重組DNA技術(shù)中的酶Section1EnzymesinDNARecombination第一節(jié)酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異性核苷酸序列切割DNADNA連接酶催化相鄰DNA片段的3'末端與5'末端生成磷酸二酯鍵DNA聚合酶催化合成DNA分子反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，催化合成cDNA堿性磷酸酶切除末端磷酸基末端轉(zhuǎn)移酶在3'-羥基末端進(jìn)行多聚物加尾多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5'-羥基末端磷酸化，或用來標(biāo)記探針重組DNA技術(shù)中常用工具酶酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異性核苷酸序列切割一、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)1.定義◆限制性內(nèi)切酶：又稱限制性核酸內(nèi)切酶，能識別結(jié)合雙鏈DNA分子中的特異序列，并切割DNA。2.命名

◆由三個斜體字母組成：EcoRI來源菌屬名(Escherichia)的第一個字母菌的種名(coli)R來自菌株名羅馬數(shù)字(I)代表該酶被發(fā)現(xiàn)的次序5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'BamHI5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'一、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme3.限制酶的分類根據(jù)作用特征可以分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三種類型

(1)三型限制酶的基本特征◆Ⅰ型：具有內(nèi)切酶和甲基化酶的雙重活性，作用需ATP供能，能識別和結(jié)合于特定的DNA序列位點(diǎn)，但隨機(jī)切斷在識別位點(diǎn)以外的DNA序列（通常在識別位點(diǎn)周圍400~700bp）?！簪笮停壕哂袃?nèi)切酶和甲基化酶的雙重活性，作用需ATP供能，切割位點(diǎn)距離識別位點(diǎn)約25bp。3.限制酶的分類◆Ⅰ型：具有內(nèi)切酶和甲基化酶的雙重活性，(2)Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶◆只由一條肽鏈組成，不具有甲基修飾酶活性，不需要ATP◆識別位點(diǎn)一般為4~6堿基對組成的特異性序列。◆切割后可產(chǎn)生粘性末端，也可產(chǎn)生平頭末端。5'突出的粘性末端5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'BamHI(2)Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶◆只由一條肽鏈組成，不具有甲5'···GAGCTC···3'3'···CTCGAG···5'5'···GAGCTC···3'3'···CTCGAG···5'SstI3'突出末端5'···GAGCTSmaI5'···CCCGGG···3'3'···GGGCCC···5'5'···CCCGGG···3'3'···GGGCCC···5'平頭末端SmaI5'···CCCGGG···3'3'··二、DNA連接酶(DNAligases)◆常用的連接酶為T4連接酶，既可以連接粘性末端，也可以連接平頭末端。◆溫度是影響連接反應(yīng)效率的重要因素，通常在4~26℃進(jìn)行連接反應(yīng)。二、DNA連接酶(DNAligases)◆常用的連接酶為不同類型的限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)性質(zhì)以及粘端之間的退火不同類型的限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)性質(zhì)以及粘端之間的退火第二節(jié)載體Section2Vectors第二節(jié)載體◆DNA載體：是指具有接受外源DNA片段并能導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行自主復(fù)制的特定DNA分子。◆克隆載體用于克隆基因或DNA片段的載體?！粲糜诒磉_(dá)一個基因則稱為表達(dá)載體。◆載體的特點(diǎn)：(1)含有復(fù)制起始點(diǎn)(2)體積小◆DNA載體：是指具有接受外源DNA片段并能導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)(3)不能插入到基因組中，易于分離和純化(4)含有選擇性標(biāo)記(5)含有克隆位點(diǎn)(5)具有適當(dāng)?shù)拈L度◆表達(dá)載體則除了上述特征外，還應(yīng)在所要表達(dá)的基因上游具有轉(zhuǎn)錄啟動子，下游有轉(zhuǎn)錄終止子等；很多表達(dá)載體還具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)。(3)不能插入到基因組中，易于分離和純化◆表達(dá)載體則除了一、克隆載體1.質(zhì)粒載體◆通常為天然質(zhì)粒的人工改良DNA。

(1)pBR322為最早發(fā)展的常用克隆載體之一，具有如下特點(diǎn)：①帶有一個復(fù)制起始位點(diǎn)②具有Ampr和Tetr二個抗性基因，可插入失活③具有較小的分子量(4.36kb)④可插入較大外源片段(~6kb)⑤拷貝數(shù)較高(可達(dá)1000~3000)一、克隆載體1.質(zhì)粒載體為最早發(fā)展的常用克隆載體之一，具有質(zhì)粒pBR322示意圖質(zhì)粒pBR322示意圖(2)pUC系列質(zhì)?！粲蓀BR322改建而成，主要特征為：①有復(fù)制起始位點(diǎn)(ori，源于pBR322)②Ampr基因(酶切位點(diǎn)不再單一)③含有LacZ'基因④含有多克隆位點(diǎn)區(qū)段◆pUC系列大多數(shù)是成對的，如pUC8/pUC9、pUC18/pUC19(2)pUC系列質(zhì)粒①有復(fù)制起始位點(diǎn)(ori，源于pBRpUC18/19質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)pUC18/19質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)◆

pUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：①具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)②適應(yīng)于組織化學(xué)篩選重組體(藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn))③pUC系列提供多克隆位點(diǎn)(MCS)2．噬菌體載體◆常用于大片段DNA的克隆，實(shí)驗(yàn)中以λ噬菌體、M13和粘粒最為常用◆pUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：2．噬菌體載體◆常用于大片段DN3.人工染色體◆人工染色體(artificialchromosomes)：由染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，是為克隆更大片段的DNA而發(fā)展的新型載體?！羧斯と旧w主要包括三種：細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)和哺乳動物人工染色體(MAC)◆YAC載體的復(fù)制元件包括：復(fù)制起點(diǎn)序列(即自主復(fù)制序列，ARS)、著絲粒(centromere,CEN)和兩個端粒(TEL)。3.人工染色體◆人工染色體(artificialchr二、表達(dá)載體根據(jù)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：原核表達(dá)載體酵母表達(dá)載體昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體植物細(xì)胞表達(dá)載體等二、表達(dá)載體根據(jù)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.原核表達(dá)載體(1)原核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：①強(qiáng)啟動子常用啟動子：Lac啟動子、Trp啟動子、T7噬菌體啟動子②轉(zhuǎn)錄終止子：T7終止子等③SD序列：提供核糖體的結(jié)合位點(diǎn)1.原核表達(dá)載體(1)原核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(2)

原核表達(dá)載體表達(dá)特點(diǎn)：①非融合型表達(dá)蛋白②融合型表達(dá)蛋白③分泌型表達(dá)蛋白(2)原核表達(dá)載體表達(dá)特點(diǎn)：XhoI(158)NotI(166)EagI(166)HindIII(173)SalI(179)SacI(190)EcoRI(192)BamHI(198)NheI(231)NdeI(238)NcoI(296)T7Promoter(370-386bp)T7Terminator(26-72bp)XhoI(158)T7PromoterT7TerminT7啟動子Lac操縱序列rbs(SD序列)T7終止子MCSNcoI(CCATGG)His標(biāo)簽His標(biāo)簽?zāi)肝稽c(diǎn)pET-28a-c(+)克隆表達(dá)區(qū)結(jié)構(gòu)特征T7啟動子Lac操縱序列rbsT7終止子MCSNcoI(HindIIIKpnISacIBamHIBstXIEcoRIBstXINotIXhoISphIXbaI2.酵母表達(dá)載體◆一般為質(zhì)粒型穿梭載體。酵母表達(dá)載體pYES2HindIII2.酵母表達(dá)載體◆一般為質(zhì)粒型穿梭載體。①選擇性標(biāo)志◆通常利用營養(yǎng)缺陷型突變作為篩選的標(biāo)記，如常用的：URA3、LEU2、HIS3和TRP1。②復(fù)制子◆通常利用啤酒酵母2μm環(huán)質(zhì)粒的復(fù)制起始序列。③常用的啟動子◆常用的酵母基因啟動子：醇脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、蔗糖酶、酸性磷酸酯酶和酵母交配因子(MFα)。(1)酵母表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)①選擇性標(biāo)志◆通常利用營養(yǎng)缺陷型突變作為篩選的標(biāo)記，如常④上游活性序列◆上游活性序列的功能類似于增強(qiáng)子，可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。⑤終止序列◆可終止轉(zhuǎn)錄，還可增加mRNA的數(shù)量和蛋白質(zhì)表達(dá)的總量。⑥特定蛋白結(jié)構(gòu)域◆如信號肽序列和核定位序列等。④上游活性序列◆上游活性序列的功能類似于增強(qiáng)子，可促進(jìn)轉(zhuǎn)(2)酵母表達(dá)載體的表達(dá)形式①直接表達(dá)②分泌性表達(dá)◆外源蛋白質(zhì)表達(dá)后積累于酵母細(xì)胞質(zhì)中，如人乙型肝炎表面抗原的表達(dá)?！敉庠吹鞍踪|(zhì)表達(dá)后在信號肽指導(dǎo)下分泌至細(xì)胞外，信號因子通常為α因子前導(dǎo)序列，Invitrogen公司的酵母表達(dá)載體pGAPZα屬于此種類型。(2)酵母表達(dá)載體的表達(dá)形式①直接表達(dá)②分泌性表達(dá)◆3.哺乳動物表達(dá)載體◆哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的優(yōu)勢是可被修飾?！舫Ｓ玫牟溉閯游锛?xì)胞表達(dá)宿主：中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)

猴腎細(xì)胞(COS)等◆哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體一般為穿梭型載體，含有真核細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)序列，如Invitrogen公司開發(fā)的pcDNA3.3-TOPO。3.哺乳動物表達(dá)載體◆哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的優(yōu)勢是可哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1第三節(jié)重組DNA操作的基本過程Section3ProtocolsofDNARecombination第三節(jié)DNA重組的基本過程：

1.靶基因DNA片段的制備

2.適宜載體的選擇和制備

3.DNA片段與載體的連接

4.重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞

5.含有重組DNA宿主菌的篩選

6.重組DNA分子的鑒定DNA重組的基本過程：基因組DNA質(zhì)粒載體限制酶目的基因序列重組后含有外源基因的載體DNA連接酶基因組DNA質(zhì)粒載體限目的基因序列重組后含有外源基因的載體D轉(zhuǎn)化擴(kuò)增轉(zhuǎn)化擴(kuò)增重組DNA技術(shù)的基本步驟

重組DNA技術(shù)的基本步驟一、目的DNA片段的制備◆來源與方法：基因組DNA、cDNA、PCR產(chǎn)物和化學(xué)合成的DNA。◆基因文庫(genelibrary)：也稱基因組文庫(genomelibrary)，用限制酶切割基因組DNA獲得成千上萬的在一定大小范圍內(nèi)的DNA片段，每一個DNA片段與載體分子連接，產(chǎn)生一個重組DNA分子的混合物，重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主菌后，每一個轉(zhuǎn)化細(xì)胞含有一個重組DNA分子，這些克隆的集合體被稱為基因文庫。一、目的DNA片段的制備◆來源與方法：基因組DNA、cDN基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建◆

cDNA文庫(cDNAlibrary)：提取細(xì)胞總mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，每一個cDNA分子與載體連接產(chǎn)生了一個重組DNA分子的混合物，再轉(zhuǎn)化宿主菌，每個宿主菌細(xì)胞克隆將含有一個cDNA重組分子，這些克隆的集合體被稱為cDNA文庫?！?/p>

若目的序列全部已知，可以通過人工合成的方法獲取靶序列?！?/p>

已知目的序列兩端序列時，可以通過PCR方法獲取靶序列?！鬰DNA文庫(cDNAlibrary)：提取細(xì)胞總mRcDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫的構(gòu)建二、載體的選擇與準(zhǔn)備◆選擇原則：依據(jù)重組DNA的目的，選擇適當(dāng)載體。適合的選擇標(biāo)記克隆載體表達(dá)載體細(xì)菌載體酵母載體昆蟲細(xì)胞載體哺乳動物細(xì)胞載體二、載體的選擇與準(zhǔn)備◆選擇原則：依據(jù)重組DNA的目的，選擇三、DNA分子的體外重組◆互補(bǔ)性粘性末端將使連接更容易。限制酶粘性末端連接T-載體粘性末端連接平末端連接同聚物加尾連接人工接頭連接三、DNA分子的體外重組◆互補(bǔ)性粘性末端將使連接更容易。限BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連限制酶粘性末端連接目錄BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄平末端鏈接目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3.同聚物加尾連接5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶

5′3′

3′5′

5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′

5′

3′

3′5′

5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

4.人工接頭(linker)連接人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco四、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化◆轉(zhuǎn)化(transformation)：質(zhì)粒DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌宿主，并使其獲得新表型的過程。三種方法：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和感染?！舾惺軕B(tài)細(xì)胞(competentcell)：指經(jīng)過處理后變得更容易接受外源DNA的細(xì)菌細(xì)胞。如使用CaCl2處理E.coli細(xì)胞，可獲得E.coli的感受態(tài)細(xì)胞。四、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化◆轉(zhuǎn)化(trans2.轉(zhuǎn)染◆轉(zhuǎn)染(transfection)：將重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞的過程?！艮D(zhuǎn)染細(xì)胞：接受了外源DNA分子的宿主細(xì)胞?！舴€(wěn)定轉(zhuǎn)染(stabletransfection)：進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA分子整合到宿主細(xì)胞基因組中。◆瞬時轉(zhuǎn)染(transienttransfection)：進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA分子游離于宿主染色體之外。◆轉(zhuǎn)染方法：常用磷酸鈣法和脂質(zhì)體法。2.轉(zhuǎn)染◆轉(zhuǎn)染(transfection)：將重組DNA3.感染◆感染(infection)：以病毒或噬菌體為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增，也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。3.感染◆感染(infection)：以病毒或噬菌體為載五、重組子的篩選與鑒定1.載體的抗藥性標(biāo)志抗氨芐青霉素基因(Ampr)抗四環(huán)素基因(Tetr)抗卡那霉素基因(Kanr)等2.載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇◆一般選用含有兩個以上抗藥基因的載體，外源DNA插入其中一個抗藥基因，并導(dǎo)致該基因失活。如pBR322質(zhì)粒含有Ampr基因和Tetr基因(BamHI)。五、重組子的篩選與鑒定1.載體的抗藥性標(biāo)志抗氨芐青霉素基因(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目錄(插入失活法)目錄3.α-互補(bǔ)法

(即藍(lán)白斑篩選法)質(zhì)?！?肽(無半乳糖苷酶活性)α-肽＋ω-肽(半乳糖苷酶活性)宿主↓ω-肽(無半乳糖苷酶活性)X-galX(藍(lán)色產(chǎn)物)+gal(半乳糖)3.α-互補(bǔ)法(即藍(lán)白斑篩選法)質(zhì)粒α-肽＋ω-肽宿主X-

α互補(bǔ)的檢測α互補(bǔ)的檢測組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體4.營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)篩選組氨酸缺陷無組氨酸酵母咪唑甘油磷促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體5.核酸分子雜交篩選◆通過原位雜交、Southern印跡和Northern印跡分析轉(zhuǎn)化子。根據(jù)插入序列設(shè)計探針與轉(zhuǎn)化子克隆進(jìn)行雜交有雜交信號的為陽性克隆5.核酸分子雜交篩選◆通過原位雜交、Southern印6.PCR法進(jìn)行鑒定根據(jù)插入序列設(shè)計PCR引物以轉(zhuǎn)化子的重組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳分析PCR產(chǎn)物根據(jù)PCR產(chǎn)物長度判斷陽性克隆，還可結(jié)合PCR產(chǎn)物測序進(jìn)行更精確的分析6.PCR法進(jìn)行鑒定根據(jù)插入序列設(shè)計PCR引物以轉(zhuǎn)化子的重7.DNA序列分析鑒定◆直接進(jìn)行DNA測序，精確分析陽性克隆?！魧﹃栃灾亟M轉(zhuǎn)化子的精確鑒定一般先選擇前6種方法之一進(jìn)行初步分析后，再進(jìn)行DNA測序分析。7.DNA序列分析鑒定◆直接進(jìn)行DNA測序，精確分析陽性第四節(jié)外源基因的蛋白質(zhì)表達(dá)Section4ExpressionofRecombinantGene第四節(jié)◆重組基因表達(dá)體系的創(chuàng)建過程包括：表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化等技術(shù)?！舾鶕?jù)宿主細(xì)胞的不同可分為：原核表達(dá)體系真核表達(dá)體系◆重組基因表達(dá)體系的創(chuàng)建過程包括：◆根據(jù)宿主細(xì)胞的不同可一、原核表達(dá)體系1.不同表達(dá)方式的優(yōu)缺點(diǎn)(1)非融合型表達(dá)

◆優(yōu)點(diǎn)：與真核生物體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最相似，功能最相近?！羧秉c(diǎn)：容易被細(xì)菌蛋白酶所破壞。(2)融合型表達(dá)◆優(yōu)點(diǎn)：可以抵御細(xì)菌蛋白酶的破壞，融合蛋白比天然的外源蛋白更加穩(wěn)定一、原核表達(dá)體系1.不同表達(dá)方式的優(yōu)缺點(diǎn)(1)非融合型表◆缺點(diǎn)：需要去除原核多肽。◆原核多肽切除方法：化學(xué)裂解法和酶解法。(3)分泌表達(dá)◆優(yōu)點(diǎn)：防止大腸桿菌對表達(dá)產(chǎn)物的降解，減輕大腸桿菌代謝負(fù)荷和恢復(fù)表達(dá)產(chǎn)物天然構(gòu)象?！羧秉c(diǎn)：需要去除原核多肽。(3)分泌表達(dá)◆包涵體益處：防止蛋白酶對表達(dá)蛋白的降解，有利于表達(dá)產(chǎn)物分離純化。◆包涵體缺點(diǎn)：表達(dá)蛋白不具有生物活性，必須溶解包涵體并對表達(dá)蛋白進(jìn)行復(fù)性。2.包涵體(inclusionbody)◆是大腸桿菌高效表達(dá)外源基因時形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區(qū)，與細(xì)胞質(zhì)中的其他成分有明顯的區(qū)別。◆包涵體益處：防止蛋白酶對表達(dá)蛋白的降解，有利于表達(dá)產(chǎn)物分二、真核表達(dá)體系1.酵母表達(dá)體系

(1)酵母表達(dá)體系具有諸多優(yōu)點(diǎn)：①可以對蛋白進(jìn)行多種翻譯后修飾②培養(yǎng)簡單③自身分泌蛋白少，是理想的分泌型表達(dá)系統(tǒng)④具有較高的安全性，如啤酒酵母表達(dá)體系⑤分離純化的過程比較簡單(2)酵母表達(dá)體系實(shí)例干擾素、人表皮生長因子、人乙型肝炎表面抗原和核心抗原等。二、真核表達(dá)體系1.酵母表達(dá)體系①可以對蛋白進(jìn)行多種翻譯2.哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系

◆優(yōu)點(diǎn)：①可表達(dá)克隆的cDNA，也可表達(dá)真核基因組DNA。②表達(dá)蛋白可被適當(dāng)修飾?！羧秉c(diǎn)：①操作技術(shù)難②費(fèi)時③成本高2.哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系◆缺點(diǎn)：三、重組蛋白質(zhì)分析鑒定檢查內(nèi)容分析方法鑒定標(biāo)準(zhǔn)分子量SDS銀染一條帶等電點(diǎn)等電點(diǎn)聚焦電泳銀染一條帶，掃描95%以上純度HPLC層析一個峰(95%以上)WesternBlot有一條活性蛋白帶結(jié)構(gòu)分析氨基酸組成分析各種氨基酸比例符合設(shè)計氨基酸序列分析N-末端15個氨基酸符合要求肽譜圖符合定點(diǎn)降解生物學(xué)活性細(xì)胞或動物實(shí)驗(yàn)符合比活性和特定生物學(xué)檢測指標(biāo)重組蛋白質(zhì)的鑒定方法及標(biāo)準(zhǔn)三、重組蛋白質(zhì)分析鑒定檢查內(nèi)容分析方法鑒定標(biāo)準(zhǔn)分子量SDS-四、重組蛋白質(zhì)藥物制備◆生物制藥領(lǐng)域的上游技術(shù)包括基因克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)；下游技術(shù)包括蛋白質(zhì)的分離純化?！糁亟M胰島素是第一個投放到市場的重組蛋白質(zhì)藥物?！粢葝u素的重組表達(dá)以禮萊(Lilly)公司的E.coli表達(dá)體系和諾和諾德(NovoNordisk)的酵母表達(dá)系統(tǒng)為代表。四、重組蛋白質(zhì)藥物制備◆生物制藥領(lǐng)域的上游技術(shù)包括基因克隆本章小結(jié)：1.重組DNA技術(shù)、廣義遺傳工程和狹義遺傳工程、克隆、限制性內(nèi)切酶、Ⅱ型限制酶。2.

載體、載體的條件、克隆載體（質(zhì)粒載體pBR322的特點(diǎn)）、表達(dá)載體（原核表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與表達(dá)特點(diǎn)）。3.重組DNA操作的基本過程4.重組子的篩選和鑒定（載體的抗藥性篩選，載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇，α-互補(bǔ)法或藍(lán)白斑篩選，營養(yǎng)缺陷性的互補(bǔ)篩選）本章小結(jié)：演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！第十八章重組DNA技術(shù)Chapter18TechniquesofRecombinantDNA第十八章重組DNA技術(shù)◆DNA分子體外重組技術(shù)和核苷酸序列分析技術(shù)標(biāo)志了基因工程時代的誕生?！?973年，HerbertBoyer和StanleyCohen首次成功實(shí)現(xiàn)DNA分子的體外重組?！?977年，F(xiàn)rederickSanger和WalterGilbert發(fā)明了DNA測序法?！糁亟MDNA技術(shù)(recombinantDNAtechnique)：指在體外重新組合DNA分子，并使它們在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中增殖的遺傳操作?！鬌NA分子體外重組技術(shù)和核苷酸序列分析技術(shù)標(biāo)志了基因工程◆遺傳工程(GeneticEngineering)：借助生物學(xué)技術(shù)，對生物遺傳物質(zhì)進(jìn)行更改和/或重新組合，以改變生物的遺傳性狀或創(chuàng)造新的生物品種的遺傳學(xué)研究技術(shù)?！暨z傳工程有廣義和狹義之別，狹義遺傳工程專指重組DNA技術(shù)(即基因工程)，廣義遺傳工程包括細(xì)胞水平的遺傳操作(也稱細(xì)胞工程)和基因工程。◆克?。菏怯⑽摹癱lone

”或“cloning

的音譯，源于希臘文“Klone”，本意為無性繁殖系，即通過無性繁殖而產(chǎn)生的完全相同的子代集合體?！暨z傳工程(GeneticEngineering)：借助重組DNA技術(shù)的基本步驟

重組DNA技術(shù)的基本步驟第一節(jié)重組DNA技術(shù)中的酶Section1EnzymesinDNARecombination第一節(jié)酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異性核苷酸序列切割DNADNA連接酶催化相鄰DNA片段的3'末端與5'末端生成磷酸二酯鍵DNA聚合酶催化合成DNA分子反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，催化合成cDNA堿性磷酸酶切除末端磷酸基末端轉(zhuǎn)移酶在3'-羥基末端進(jìn)行多聚物加尾多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5'-羥基末端磷酸化，或用來標(biāo)記探針重組DNA技術(shù)中常用工具酶酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異性核苷酸序列切割一、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)1.定義◆限制性內(nèi)切酶：又稱限制性核酸內(nèi)切酶，能識別結(jié)合雙鏈DNA分子中的特異序列，并切割DNA。2.命名

◆由三個斜體字母組成：EcoRI來源菌屬名(Escherichia)的第一個字母菌的種名(coli)R來自菌株名羅馬數(shù)字(I)代表該酶被發(fā)現(xiàn)的次序5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'BamHI5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'一、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme3.限制酶的分類根據(jù)作用特征可以分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三種類型

(1)三型限制酶的基本特征◆Ⅰ型：具有內(nèi)切酶和甲基化酶的雙重活性，作用需ATP供能，能識別和結(jié)合于特定的DNA序列位點(diǎn)，但隨機(jī)切斷在識別位點(diǎn)以外的DNA序列（通常在識別位點(diǎn)周圍400~700bp）?！簪笮停壕哂袃?nèi)切酶和甲基化酶的雙重活性，作用需ATP供能，切割位點(diǎn)距離識別位點(diǎn)約25bp。3.限制酶的分類◆Ⅰ型：具有內(nèi)切酶和甲基化酶的雙重活性，(2)Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶◆只由一條肽鏈組成，不具有甲基修飾酶活性，不需要ATP◆識別位點(diǎn)一般為4~6堿基對組成的特異性序列?！羟懈詈罂僧a(chǎn)生粘性末端，也可產(chǎn)生平頭末端。5'突出的粘性末端5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'BamHI(2)Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶◆只由一條肽鏈組成，不具有甲5'···GAGCTC···3'3'···CTCGAG···5'5'···GAGCTC···3'3'···CTCGAG···5'SstI3'突出末端5'···GAGCTSmaI5'···CCCGGG···3'3'···GGGCCC···5'5'···CCCGGG···3'3'···GGGCCC···5'平頭末端SmaI5'···CCCGGG···3'3'··二、DNA連接酶(DNAligases)◆常用的連接酶為T4連接酶，既可以連接粘性末端，也可以連接平頭末端?！魷囟仁怯绊戇B接反應(yīng)效率的重要因素，通常在4~26℃進(jìn)行連接反應(yīng)。二、DNA連接酶(DNAligases)◆常用的連接酶為不同類型的限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)性質(zhì)以及粘端之間的退火不同類型的限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)性質(zhì)以及粘端之間的退火第二節(jié)載體Section2Vectors第二節(jié)載體◆DNA載體：是指具有接受外源DNA片段并能導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行自主復(fù)制的特定DNA分子?！艨寺≥d體用于克隆基因或DNA片段的載體?！粲糜诒磉_(dá)一個基因則稱為表達(dá)載體?！糨d體的特點(diǎn)：(1)含有復(fù)制起始點(diǎn)(2)體積小◆DNA載體：是指具有接受外源DNA片段并能導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)(3)不能插入到基因組中，易于分離和純化(4)含有選擇性標(biāo)記(5)含有克隆位點(diǎn)(5)具有適當(dāng)?shù)拈L度◆表達(dá)載體則除了上述特征外，還應(yīng)在所要表達(dá)的基因上游具有轉(zhuǎn)錄啟動子，下游有轉(zhuǎn)錄終止子等；很多表達(dá)載體還具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)。(3)不能插入到基因組中，易于分離和純化◆表達(dá)載體則除了一、克隆載體1.質(zhì)粒載體◆通常為天然質(zhì)粒的人工改良DNA。

(1)pBR322為最早發(fā)展的常用克隆載體之一，具有如下特點(diǎn)：①帶有一個復(fù)制起始位點(diǎn)②具有Ampr和Tetr二個抗性基因，可插入失活③具有較小的分子量(4.36kb)④可插入較大外源片段(~6kb)⑤拷貝數(shù)較高(可達(dá)1000~3000)一、克隆載體1.質(zhì)粒載體為最早發(fā)展的常用克隆載體之一，具有質(zhì)粒pBR322示意圖質(zhì)粒pBR322示意圖(2)pUC系列質(zhì)?！粲蓀BR322改建而成，主要特征為：①有復(fù)制起始位點(diǎn)(ori，源于pBR322)②Ampr基因(酶切位點(diǎn)不再單一)③含有LacZ'基因④含有多克隆位點(diǎn)區(qū)段◆pUC系列大多數(shù)是成對的，如pUC8/pUC9、pUC18/pUC19(2)pUC系列質(zhì)粒①有復(fù)制起始位點(diǎn)(ori，源于pBRpUC18/19質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)pUC18/19質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)◆

pUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：①具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)②適應(yīng)于組織化學(xué)篩選重組體(藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn))③pUC系列提供多克隆位點(diǎn)(MCS)2．噬菌體載體◆常用于大片段DNA的克隆，實(shí)驗(yàn)中以λ噬菌體、M13和粘粒最為常用◆pUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：2．噬菌體載體◆常用于大片段DN3.人工染色體◆人工染色體(artificialchromosomes)：由染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，是為克隆更大片段的DNA而發(fā)展的新型載體?！羧斯と旧w主要包括三種：細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)和哺乳動物人工染色體(MAC)◆YAC載體的復(fù)制元件包括：復(fù)制起點(diǎn)序列(即自主復(fù)制序列，ARS)、著絲粒(centromere,CEN)和兩個端粒(TEL)。3.人工染色體◆人工染色體(artificialchr二、表達(dá)載體根據(jù)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：原核表達(dá)載體酵母表達(dá)載體昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體植物細(xì)胞表達(dá)載體等二、表達(dá)載體根據(jù)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.原核表達(dá)載體(1)原核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：①強(qiáng)啟動子常用啟動子：Lac啟動子、Trp啟動子、T7噬菌體啟動子②轉(zhuǎn)錄終止子：T7終止子等③SD序列：提供核糖體的結(jié)合位點(diǎn)1.原核表達(dá)載體(1)原核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(2)

原核表達(dá)載體表達(dá)特點(diǎn)：①非融合型表達(dá)蛋白②融合型表達(dá)蛋白③分泌型表達(dá)蛋白(2)原核表達(dá)載體表達(dá)特點(diǎn)：XhoI(158)NotI(166)EagI(166)HindIII(173)SalI(179)SacI(190)EcoRI(192)BamHI(198)NheI(231)NdeI(238)NcoI(296)T7Promoter(370-386bp)T7Terminator(26-72bp)XhoI(158)T7PromoterT7TerminT7啟動子Lac操縱序列rbs(SD序列)T7終止子MCSNcoI(CCATGG)His標(biāo)簽His標(biāo)簽?zāi)肝稽c(diǎn)pET-28a-c(+)克隆表達(dá)區(qū)結(jié)構(gòu)特征T7啟動子Lac操縱序列rbsT7終止子MCSNcoI(HindIIIKpnISacIBamHIBstXIEcoRIBstXINotIXhoISphIXbaI2.酵母表達(dá)載體◆一般為質(zhì)粒型穿梭載體。酵母表達(dá)載體pYES2HindIII2.酵母表達(dá)載體◆一般為質(zhì)粒型穿梭載體。①選擇性標(biāo)志◆通常利用營養(yǎng)缺陷型突變作為篩選的標(biāo)記，如常用的：URA3、LEU2、HIS3和TRP1。②復(fù)制子◆通常利用啤酒酵母2μm環(huán)質(zhì)粒的復(fù)制起始序列。③常用的啟動子◆常用的酵母基因啟動子：醇脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、蔗糖酶、酸性磷酸酯酶和酵母交配因子(MFα)。(1)酵母表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)①選擇性標(biāo)志◆通常利用營養(yǎng)缺陷型突變作為篩選的標(biāo)記，如常④上游活性序列◆上游活性序列的功能類似于增強(qiáng)子，可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。⑤終止序列◆可終止轉(zhuǎn)錄，還可增加mRNA的數(shù)量和蛋白質(zhì)表達(dá)的總量。⑥特定蛋白結(jié)構(gòu)域◆如信號肽序列和核定位序列等。④上游活性序列◆上游活性序列的功能類似于增強(qiáng)子，可促進(jìn)轉(zhuǎn)(2)酵母表達(dá)載體的表達(dá)形式①直接表達(dá)②分泌性表達(dá)◆外源蛋白質(zhì)表達(dá)后積累于酵母細(xì)胞質(zhì)中，如人乙型肝炎表面抗原的表達(dá)?！敉庠吹鞍踪|(zhì)表達(dá)后在信號肽指導(dǎo)下分泌至細(xì)胞外，信號因子通常為α因子前導(dǎo)序列，Invitrogen公司的酵母表達(dá)載體pGAPZα屬于此種類型。(2)酵母表達(dá)載體的表達(dá)形式①直接表達(dá)②分泌性表達(dá)◆3.哺乳動物表達(dá)載體◆哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的優(yōu)勢是可被修飾?！舫Ｓ玫牟溉閯游锛?xì)胞表達(dá)宿主：中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)

猴腎細(xì)胞(COS)等◆哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體一般為穿梭型載體，含有真核細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)序列，如Invitrogen公司開發(fā)的pcDNA3.3-TOPO。3.哺乳動物表達(dá)載體◆哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的優(yōu)勢是可哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1第三節(jié)重組DNA操作的基本過程Section3ProtocolsofDNARecombination第三節(jié)DNA重組的基本過程：

1.靶基因DNA片段的制備

2.適宜載體的選擇和制備

3.DNA片段與載體的連接

4.重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞

5.含有重組DNA宿主菌的篩選

6.重組DNA分子的鑒定DNA重組的基本過程：基因組DNA質(zhì)粒載體限制酶目的基因序列重組后含有外源基因的載體DNA連接酶基因組DNA質(zhì)粒載體限目的基因序列重組后含有外源基因的載體D轉(zhuǎn)化擴(kuò)增轉(zhuǎn)化擴(kuò)增重組DNA技術(shù)的基本步驟

重組DNA技術(shù)的基本步驟一、目的DNA片段的制備◆來源與方法：基因組DNA、cDNA、PCR產(chǎn)物和化學(xué)合成的DNA。◆基因文庫(genelibrary)：也稱基因組文庫(genomelibrary)，用限制酶切割基因組DNA獲得成千上萬的在一定大小范圍內(nèi)的DNA片段，每一個DNA片段與載體分子連接，產(chǎn)生一個重組DNA分子的混合物，重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主菌后，每一個轉(zhuǎn)化細(xì)胞含有一個重組DNA分子，這些克隆的集合體被稱為基因文庫。一、目的DNA片段的制備◆來源與方法：基因組DNA、cDN基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建◆

cDNA文庫(cDNAlibrary)：提取細(xì)胞總mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，每一個cDNA分子與載體連接產(chǎn)生了一個重組DNA分子的混合物，再轉(zhuǎn)化宿主菌，每個宿主菌細(xì)胞克隆將含有一個cDNA重組分子，這些克隆的集合體被稱為cDNA文庫。◆

若目的序列全部已知，可以通過人工合成的方法獲取靶序列。◆

已知目的序列兩端序列時，可以通過PCR方法獲取靶序列?！鬰DNA文庫(cDNAlibrary)：提取細(xì)胞總mRcDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫的構(gòu)建二、載體的選擇與準(zhǔn)備◆選擇原則：依據(jù)重組DNA的目的，選擇適當(dāng)載體。適合的選擇標(biāo)記克隆載體表達(dá)載體細(xì)菌載體酵母載體昆蟲細(xì)胞載體哺乳動物細(xì)胞載體二、載體的選擇與準(zhǔn)備◆選擇原則：依據(jù)重組DNA的目的，選擇三、DNA分子的體外重組◆互補(bǔ)性粘性末端將使連接更容易。限制酶粘性末端連接T-載體粘性末端連接平末端連接同聚物加尾連接人工接頭連接三、DNA分子的體外重組◆互補(bǔ)性粘性末端將使連接更容易。限BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連限制酶粘性末端連接目錄BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄平末端鏈接目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3.同聚物加尾連接5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶

5′3′

3′5′

5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′

5′

3′

3′5′

5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

4.人工接頭(linker)連接人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco四、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化◆轉(zhuǎn)化(transformation)：質(zhì)粒DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌宿主，并使其獲得新表型的過程。三種方法：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和感染。◆感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)：指經(jīng)過處理后變得更容易接受外源DNA的細(xì)菌細(xì)胞。如使用CaCl2處理E.coli細(xì)胞，可獲得E.coli的感受態(tài)細(xì)胞。四、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化◆轉(zhuǎn)化(trans2.轉(zhuǎn)染◆轉(zhuǎn)染(transfection)：將重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞的過程?！艮D(zhuǎn)染細(xì)胞：接受了外源DNA分子的宿主細(xì)胞。◆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stabletransfection)：進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA分子整合到宿主細(xì)胞基因組中?！羲矔r轉(zhuǎn)染(transienttransfection)：進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA分子游離于宿主染色體之外?！艮D(zhuǎn)染方法：常用磷酸鈣法和脂質(zhì)體法。2.轉(zhuǎn)染◆轉(zhuǎn)染(transfection)：將重組DNA3.感染◆感染(infection)：以病毒或噬菌體為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增，也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。3.感染◆感染(infection)：以病毒或噬菌體為載五、重組子的篩選與鑒定1.載體的抗藥性標(biāo)志抗氨芐青霉素基因(Ampr)抗四環(huán)素基因(Tetr)抗卡那霉素基因(Kanr)等2.載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇◆一般選用含有兩個以上抗藥基因的載體，外源DNA插入其中一個抗藥基因，并導(dǎo)致該基因失活。如pBR322質(zhì)粒含有Ampr基因和Tetr基因(BamHI)。五、重組子的篩選與鑒定1.載體的抗藥性標(biāo)志抗氨芐青霉素基因(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目錄(插入失活法)目錄3.α-互補(bǔ)法

(即藍(lán)白斑篩選法)質(zhì)?！?肽(無半乳糖苷酶活性)α-肽＋ω-肽(半乳糖苷酶活性)宿主↓ω-肽(無半乳糖苷酶活性)X-galX(藍(lán)色產(chǎn)物)+gal(半乳糖)3.α-互補(bǔ)法(即藍(lán)白斑篩選法)質(zhì)粒α-肽＋ω-肽宿主X-

α互補(bǔ)的檢測α互補(bǔ)的檢測組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體4.營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)篩選組氨酸缺陷無組氨酸酵母咪唑甘油磷促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體5.核酸分子雜交篩選◆通過原位雜交、Southern印跡和