液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱課件

液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱1選HPLC參數(shù)時的基本考慮溶解度-選擇流動相的條件分子量-在樣品預(yù)處理或GPC分析時有用樣品的基質(zhì)-考慮如何前處理在基質(zhì)中樣品的含量檢測特性-有否紫外吸收?熒光?找出樣品中不同組份之間的差異摸索條件的重要線索選HPLC參數(shù)時的基本考慮溶解度-選擇流動相的條件2極性問題極性問題3液相色譜的分離機(jī)理正相反相體積排除離子交換其他不同的分離模式是不同的機(jī)理液相色譜的分離機(jī)理正相4吸附色譜的分離機(jī)理隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小在色譜柱上的保留由長到短吸附色譜的分離機(jī)理隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小5吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。洗脫次序∶一般為正相，即：極性低的先被洗脫常用的流動相∶非極性有機(jī)溶劑，如己烷乙酸等為添加劑常用固定相∶硅膠、氧化鋁等。吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。6分配色譜的分離機(jī)理分配色譜的分離機(jī)理7分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流動相：有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水應(yīng)用添加劑，成為離子對、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)反相色譜固定相多為鍵合相?分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離8鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑消除硅羥基的不良影響缺點∶pH值不能小于3同樣填料，各種牌號色譜柱不盡相同鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺9體積排除色譜的分離機(jī)理體積排除色譜的分離機(jī)理10凝膠色譜概述凝膠滲透（GPC）、凝膠過濾（GFC）分離基于分子在溶液中的體積大小洗脫次序：大分子先被洗脫流動相不參與分離，只起溶劑作用分離效率低色譜行為容易預(yù)測凝膠色譜概述凝膠滲透（GPC）、凝膠過濾（GFC）11GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分離GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分離12液相色譜柱及分離機(jī)理的關(guān)系從色譜方法上分正相/反相離子交換分子體積排除親合從柱子類型上分分配/吸附離子交換凝膠親合液相色譜柱及分離機(jī)理的關(guān)系從色譜方法上分從柱子類型上分13液相色譜的方法開發(fā)（二）梯度方法液相色譜的方法開發(fā)（二）梯度方法14梯度洗脫的特點優(yōu)點單位時間的分離能力增加檢測靈敏度提高缺點儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測方式柱需再生定量分析的重復(fù)性較低梯度洗脫的特點優(yōu)點15如不用梯度：分離不理想如不用梯度：分離不理想16梯度條件的優(yōu)化梯度條件的優(yōu)化17檢測器檢測器18對檢測器的要求高靈敏度可重現(xiàn)的設(shè)置合適的帶寬快速或可變的時間常數(shù)寬的線性響應(yīng)容易使用及保養(yǎng)自我診斷功能對檢測器的要求高靈敏度19檢測器的種類檢測器的種類20衡量檢測器的指標(biāo)靈敏度∶S=△R/△Q△R是檢測器響應(yīng)值的增量△Q是樣品量的增量噪音∶沒有樣品時檢測器的最大輸出信號漂移∶檢測器在一段時間內(nèi)響應(yīng)值的變化線性動態(tài)范圍∶最大線性相應(yīng)與最小檢出限之比最小檢測限∶樣品產(chǎn)生兩或三倍于噪音信號時的濃度信噪比∶S/N注意∶最小檢測限不是一個單純的檢測器指標(biāo)。它實際上是評價整個色譜系統(tǒng)的指標(biāo)，包括了色譜系統(tǒng)、分離機(jī)理、色譜柱在內(nèi)的綜合性指標(biāo)，信噪比亦如此衡量檢測器的指標(biāo)靈敏度∶S=△R/△Q21紫外-可見光檢測器基于樣品池(S)中的樣品對光產(chǎn)生吸收，有信號差如是可變波長檢測器，還有分光系統(tǒng)(光珊)紫外-可見光檢測器基于樣品池(S)中的樣品對光產(chǎn)生吸收，有信22Beer'sLaw-BEER定律光能量∶P0=透過溶劑的光能量P=透過樣品的光能量光通量(透過率%)∶T=P/P0吸光度∶A=-log(T)=log(P0/P)吸光度=單位吸光度×流動池長度×溶液濃度即∶A=abcBeer'sLaw-BEER定律光能量∶23同紫外檢測器靈敏度有關(guān)的因素信號強(qiáng)度(S)從BEER定律可看出樣品的種類樣品濃度及進(jìn)樣的體積檢測池的長度所使用的波長，檢測器的

時間常數(shù)噪音(N)流動相所使用的波長，燈的能量檢測器的時間常數(shù)非檢測器因素-電噪音，泵脈動等同紫外檢測器靈敏度有關(guān)的因素信號強(qiáng)度(S)24紫外檢測器的溶劑影響不同種類溶劑有其截止波長溶劑的質(zhì)量好壞對其截止波長有影響為何溶劑質(zhì)量不好?含紫外吸收的雜質(zhì)溶解在其中的氧氣緩沖液溶質(zhì)的紫外吸收紫外檢測器的溶劑影響不同種類溶劑有其截止波長25示差折光檢測器DifferentialRefractiveIndexDetector示差折光檢測器DifferentialRefractive26示差檢測器的注意事項不能做梯度實驗最大的池耐壓是100psi流速范圍是0.3-10ml/min.示差檢測器的注意事項不能做梯度實驗27液相色譜的定性及定量技術(shù)液相色譜的定性及定量技術(shù)28色譜峰定性鑒別每個色譜峰通過比較保留值(通常是保留時間)的方法，找到各色譜峰所對應(yīng)的組份大多數(shù)情況下用比較保留時間來定性 即所謂：保留時間相同，可能是同樣的組份保留時間不同，肯定不是同樣的組份色譜峰定性鑒別每個色譜峰29用保留時間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測組份的位置用保留時間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測組份的位置30進(jìn)一步的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)加入同時用其他方法其他色譜方法（改變機(jī)理，如：用不同的色譜柱）其他檢測器PDA，光譜圖比較、譜庫檢索MS，質(zhì)譜圖解析、譜庫檢索其他儀器方法進(jìn)一步的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)加入31定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分使分析條件的分離度（R）大于：1.5色譜峰的定性，峰一致性測定檢測限及定量限：確定靈敏度及線性范圍用標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢查方法的準(zhǔn)確度及精確度用標(biāo)樣定期檢查方法定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分32痕量分析如信/噪比不夠，定量的精確度會受影響，因此要：分析前濃縮樣品選擇高靈敏度檢測器用衍生法使色譜體系最優(yōu)化使用短的微徑柱（減少樣品的稀釋）使用高效色譜柱使k'值盡可能小增加進(jìn)樣體積和濃度使用低流速（N增加）采用梯度淋洗痕量分析如信/噪比不夠，定量的精確度會受影響，因此要：33常用的定量方法峰面積百分比法由于檢測技術(shù)的影響，在液相色譜中不常用外標(biāo)法在液相色譜中用的最多內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確，但是麻煩在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的最多常用的定量方法峰面積百分比法34外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣35外標(biāo)法定量（二）實際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量（二）實際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線36外標(biāo)法定量（三）計算公式特點無需各組份都被檢出、洗脫需要標(biāo)樣標(biāo)樣及樣品測定的條件要一致進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確外標(biāo)法定量（三）計算公式37內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣38內(nèi)標(biāo)法定量（二）實際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量（二）實際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線39內(nèi)標(biāo)法定量（三）計算公式：特點：無需各組份都被檢出、洗脫需要標(biāo)樣，需要內(nèi)標(biāo)樣結(jié)果與進(jìn)樣體積無關(guān)內(nèi)標(biāo)法定量（三）計算公式：40內(nèi)標(biāo)法定量（四）對內(nèi)標(biāo)物的要求化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測組分相似(同系物、異構(gòu)體)在樣品中不存在不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)保留值與待測組分接近濃度（響應(yīng)值）與待測組分相當(dāng)其色譜峰與其他色譜峰分離好內(nèi)標(biāo)法定量（四）對內(nèi)標(biāo)物的要求41峰面積百分比法定量公式：特點：各組分要全部流出、全部被檢測，并對檢測器的響應(yīng)值一樣簡單，液相色譜目前很難做到這點與進(jìn)樣量無關(guān)不需標(biāo)樣簡單峰面積百分比法定量公式：42可接收的檢測范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，高或低于這些點都可能引起計算錯誤可接收的檢測范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，43定量校正曲線曲線A：因在零濃度時仍有色譜峰，

可能有雜質(zhì)未分開曲線B：在此濃度內(nèi)，檢測器的響應(yīng)

值是非線性的曲線C：可接受的理想狀態(tài)，實際情

況應(yīng)是∶其延長線到零點曲線D：表明有樣品的損失，可能是色譜柱的非特征吸附，也可能是樣品制備時的損失定量校正曲線曲線A：44高效液相色譜儀的使用、保養(yǎng)

及注意事項高效液相色譜儀的使用、保養(yǎng)

及注意事45色譜柱的使用及保養(yǎng)流動相的轉(zhuǎn)換特別是GPC柱流速(壓力)的變化幅度溫度的變化幅度專用色譜柱∶樣品及溶劑的要求色譜柱的使用及保養(yǎng)流動相的轉(zhuǎn)換46色譜柱的清洗對所做的樣品要有充分的了解用對該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗色譜柱的清洗對所做的樣品要有充分的了解47色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機(jī)械震動防止細(xì)菌生長注意存放的溫度色譜柱的存放存放前的處理48在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)除去樣品及流動相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù)防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過濾器自裝填料保護(hù)柱預(yù)裝保護(hù)柱在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)49在線過濾器防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點：基本不影響柱效保護(hù)柱可避免化學(xué)污染。在線過濾器50色譜泵的保養(yǎng)流動相要過濾常用緩沖液時，停泵前要用水沖洗，并用水沖洗柱塞桿清洗孔擰緊排液閥時，不要太用力，以不滲液為準(zhǔn)更換流動相時，要保證兩種溶劑的互溶性如不互溶，要用一種中間溶劑過渡，要防止沉淀進(jìn)液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染；色譜泵的保養(yǎng)流動相要過濾51紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析52流動相方面

除去微粒純度的要求超純水，梯度實驗時水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流動相對樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例流動相方面

除去微粒53對流動相的要求:除色譜柱對流動相對的要求外，還有∶與檢測器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細(xì)菌的生長流動相及樣品的預(yù)處理

對流動相的要求:除色譜柱對流動相對的要求外，還有∶流動相及樣54流動相的脫氣流動相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動減小保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化流動相的脫氣流動相脫氣的目的55流動相脫氣的方法加熱簡單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時，也有脫氣的效果超聲波簡單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機(jī)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度流動相脫氣的方法加熱56樣品方面除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動相，一定要用流動相試溶解度，防止其在流動相中析出了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用樣品方面除去微粒及雜質(zhì)57樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于色譜柱及儀器的保護(hù)樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的58樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時間的比例樣品預(yù)處理所用時間遠(yuǎn)大于色譜分離的時間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實驗的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)影響實驗結(jié)果好壞的最重要因素

是決定性的步驟樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時間的比例59樣品預(yù)處理常用的方法高速離心過濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-固萃取/液-液萃取Sep-Pak樣品處理小柱其他樣品預(yù)處理常用的方法高速離心60去除微粒過濾過濾膜/過濾裝置有機(jī)(0.5m)/無機(jī)(0.45m)膜片可更換一次性使用的膜“Cartridge”使用方便簡單，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000g去除微粒過濾61進(jìn)樣的注意事項手柄處于Load和Inject之間時，由于暫時堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位，過高的壓力在柱頭上引起損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動閥，不能停留在中途。在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。進(jìn)樣的注意事項手柄處于Load和Inject之間時，由于暫時62HPLC用水可以通過以下幾個方面來得到：1專門的純水機(jī)或超純水機(jī)；2去離子水重蒸；3二次或三次重蒸水；4采用類似家用的純水機(jī)；5市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水；6其它途徑；HPLC用水可以通過以下幾個方面來得到：1專門的純水機(jī)或超63常用緩沖液及其pH值常用緩沖液及其pH值64洗針溶劑的注意事項洗針溶劑根據(jù)流動相的不同應(yīng)有不同：洗針溶劑的注意事項洗針溶劑根據(jù)流動相的不同應(yīng)有不同65液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱66選HPLC參數(shù)時的基本考慮溶解度-選擇流動相的條件分子量-在樣品預(yù)處理或GPC分析時有用樣品的基質(zhì)-考慮如何前處理在基質(zhì)中樣品的含量檢測特性-有否紫外吸收?熒光?找出樣品中不同組份之間的差異摸索條件的重要線索選HPLC參數(shù)時的基本考慮溶解度-選擇流動相的條件67極性問題極性問題68液相色譜的分離機(jī)理正相反相體積排除離子交換其他不同的分離模式是不同的機(jī)理液相色譜的分離機(jī)理正相69吸附色譜的分離機(jī)理隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小在色譜柱上的保留由長到短吸附色譜的分離機(jī)理隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小70吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。洗脫次序∶一般為正相，即：極性低的先被洗脫常用的流動相∶非極性有機(jī)溶劑，如己烷乙酸等為添加劑常用固定相∶硅膠、氧化鋁等。吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。71分配色譜的分離機(jī)理分配色譜的分離機(jī)理72分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流動相：有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水應(yīng)用添加劑，成為離子對、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)反相色譜固定相多為鍵合相?分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離73鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑消除硅羥基的不良影響缺點∶pH值不能小于3同樣填料，各種牌號色譜柱不盡相同鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺74體積排除色譜的分離機(jī)理體積排除色譜的分離機(jī)理75凝膠色譜概述凝膠滲透（GPC）、凝膠過濾（GFC）分離基于分子在溶液中的體積大小洗脫次序：大分子先被洗脫流動相不參與分離，只起溶劑作用分離效率低色譜行為容易預(yù)測凝膠色譜概述凝膠滲透（GPC）、凝膠過濾（GFC）76GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分離GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分離77液相色譜柱及分離機(jī)理的關(guān)系從色譜方法上分正相/反相離子交換分子體積排除親合從柱子類型上分分配/吸附離子交換凝膠親合液相色譜柱及分離機(jī)理的關(guān)系從色譜方法上分從柱子類型上分78液相色譜的方法開發(fā)（二）梯度方法液相色譜的方法開發(fā)（二）梯度方法79梯度洗脫的特點優(yōu)點單位時間的分離能力增加檢測靈敏度提高缺點儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測方式柱需再生定量分析的重復(fù)性較低梯度洗脫的特點優(yōu)點80如不用梯度：分離不理想如不用梯度：分離不理想81梯度條件的優(yōu)化梯度條件的優(yōu)化82檢測器檢測器83對檢測器的要求高靈敏度可重現(xiàn)的設(shè)置合適的帶寬快速或可變的時間常數(shù)寬的線性響應(yīng)容易使用及保養(yǎng)自我診斷功能對檢測器的要求高靈敏度84檢測器的種類檢測器的種類85衡量檢測器的指標(biāo)靈敏度∶S=△R/△Q△R是檢測器響應(yīng)值的增量△Q是樣品量的增量噪音∶沒有樣品時檢測器的最大輸出信號漂移∶檢測器在一段時間內(nèi)響應(yīng)值的變化線性動態(tài)范圍∶最大線性相應(yīng)與最小檢出限之比最小檢測限∶樣品產(chǎn)生兩或三倍于噪音信號時的濃度信噪比∶S/N注意∶最小檢測限不是一個單純的檢測器指標(biāo)。它實際上是評價整個色譜系統(tǒng)的指標(biāo)，包括了色譜系統(tǒng)、分離機(jī)理、色譜柱在內(nèi)的綜合性指標(biāo)，信噪比亦如此衡量檢測器的指標(biāo)靈敏度∶S=△R/△Q86紫外-可見光檢測器基于樣品池(S)中的樣品對光產(chǎn)生吸收，有信號差如是可變波長檢測器，還有分光系統(tǒng)(光珊)紫外-可見光檢測器基于樣品池(S)中的樣品對光產(chǎn)生吸收，有信87Beer'sLaw-BEER定律光能量∶P0=透過溶劑的光能量P=透過樣品的光能量光通量(透過率%)∶T=P/P0吸光度∶A=-log(T)=log(P0/P)吸光度=單位吸光度×流動池長度×溶液濃度即∶A=abcBeer'sLaw-BEER定律光能量∶88同紫外檢測器靈敏度有關(guān)的因素信號強(qiáng)度(S)從BEER定律可看出樣品的種類樣品濃度及進(jìn)樣的體積檢測池的長度所使用的波長，檢測器的

時間常數(shù)噪音(N)流動相所使用的波長，燈的能量檢測器的時間常數(shù)非檢測器因素-電噪音，泵脈動等同紫外檢測器靈敏度有關(guān)的因素信號強(qiáng)度(S)89紫外檢測器的溶劑影響不同種類溶劑有其截止波長溶劑的質(zhì)量好壞對其截止波長有影響為何溶劑質(zhì)量不好?含紫外吸收的雜質(zhì)溶解在其中的氧氣緩沖液溶質(zhì)的紫外吸收紫外檢測器的溶劑影響不同種類溶劑有其截止波長90示差折光檢測器DifferentialRefractiveIndexDetector示差折光檢測器DifferentialRefractive91示差檢測器的注意事項不能做梯度實驗最大的池耐壓是100psi流速范圍是0.3-10ml/min.示差檢測器的注意事項不能做梯度實驗92液相色譜的定性及定量技術(shù)液相色譜的定性及定量技術(shù)93色譜峰定性鑒別每個色譜峰通過比較保留值(通常是保留時間)的方法，找到各色譜峰所對應(yīng)的組份大多數(shù)情況下用比較保留時間來定性 即所謂：保留時間相同，可能是同樣的組份保留時間不同，肯定不是同樣的組份色譜峰定性鑒別每個色譜峰94用保留時間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測組份的位置用保留時間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測組份的位置95進(jìn)一步的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)加入同時用其他方法其他色譜方法（改變機(jī)理，如：用不同的色譜柱）其他檢測器PDA，光譜圖比較、譜庫檢索MS，質(zhì)譜圖解析、譜庫檢索其他儀器方法進(jìn)一步的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)加入96定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分使分析條件的分離度（R）大于：1.5色譜峰的定性，峰一致性測定檢測限及定量限：確定靈敏度及線性范圍用標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢查方法的準(zhǔn)確度及精確度用標(biāo)樣定期檢查方法定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分97痕量分析如信/噪比不夠，定量的精確度會受影響，因此要：分析前濃縮樣品選擇高靈敏度檢測器用衍生法使色譜體系最優(yōu)化使用短的微徑柱（減少樣品的稀釋）使用高效色譜柱使k'值盡可能小增加進(jìn)樣體積和濃度使用低流速（N增加）采用梯度淋洗痕量分析如信/噪比不夠，定量的精確度會受影響，因此要：98常用的定量方法峰面積百分比法由于檢測技術(shù)的影響，在液相色譜中不常用外標(biāo)法在液相色譜中用的最多內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確，但是麻煩在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的最多常用的定量方法峰面積百分比法99外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣100外標(biāo)法定量（二）實際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量（二）實際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線101外標(biāo)法定量（三）計算公式特點無需各組份都被檢出、洗脫需要標(biāo)樣標(biāo)樣及樣品測定的條件要一致進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確外標(biāo)法定量（三）計算公式102內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣103內(nèi)標(biāo)法定量（二）實際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量（二）實際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線104內(nèi)標(biāo)法定量（三）計算公式：特點：無需各組份都被檢出、洗脫需要標(biāo)樣，需要內(nèi)標(biāo)樣結(jié)果與進(jìn)樣體積無關(guān)內(nèi)標(biāo)法定量（三）計算公式：105內(nèi)標(biāo)法定量（四）對內(nèi)標(biāo)物的要求化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測組分相似(同系物、異構(gòu)體)在樣品中不存在不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)保留值與待測組分接近濃度（響應(yīng)值）與待測組分相當(dāng)其色譜峰與其他色譜峰分離好內(nèi)標(biāo)法定量（四）對內(nèi)標(biāo)物的要求106峰面積百分比法定量公式：特點：各組分要全部流出、全部被檢測，并對檢測器的響應(yīng)值一樣簡單，液相色譜目前很難做到這點與進(jìn)樣量無關(guān)不需標(biāo)樣簡單峰面積百分比法定量公式：107可接收的檢測范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，高或低于這些點都可能引起計算錯誤可接收的檢測范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，108定量校正曲線曲線A：因在零濃度時仍有色譜峰，

可能有雜質(zhì)未分開曲線B：在此濃度內(nèi)，檢測器的響應(yīng)

值是非線性的曲線C：可接受的理想狀態(tài)，實際情

況應(yīng)是∶其延長線到零點曲線D：表明有樣品的損失，可能是色譜柱的非特征吸附，也可能是樣品制備時的損失定量校正曲線曲線A：109高效液相色譜儀的使用、保養(yǎng)

及注意事項高效液相色譜儀的使用、保養(yǎng)

及注意事110色譜柱的使用及保養(yǎng)流動相的轉(zhuǎn)換特別是GPC柱流速(壓力)的變化幅度溫度的變化幅度專用色譜柱∶樣品及溶劑的要求色譜柱的使用及保養(yǎng)流動相的轉(zhuǎn)換111色譜柱的清洗對所做的樣品要有充分的了解用對該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗色譜柱的清洗對所做的樣品要有充分的了解112色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機(jī)械震動防止細(xì)菌生長注意存放的溫度色譜柱的存放存放前的處理113在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)除去樣品及流動相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù)防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過濾器自裝填料保護(hù)柱預(yù)裝保護(hù)柱在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)114在線過濾器防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點：基本不影響柱效保護(hù)柱可避免化學(xué)污染。在線過濾器115色譜泵的保養(yǎng)流動相要過濾常用緩沖液時，停泵前要用水沖洗，并用水沖洗柱塞桿清洗孔擰緊排液閥時，不要太用力，以不滲液為準(zhǔn)更換流動相時，要保證兩種溶劑的互溶性如不互溶，要用一種中間溶劑過渡，要防止沉淀進(jìn)液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染；色譜泵的保養(yǎng)流動相要過濾116紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析117流動相方面

除去微粒純度的要求超純水，梯度實驗時水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流動相對樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例流動相方面

除去微粒118對流動相的要求:除色譜柱對流動相對的要求外，還有∶與檢測器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細(xì)菌的生長流動相及樣品的預(yù)處理

對流動相的要求:除色譜柱對流動相對的要求外，還有∶流動相及樣119流動相的脫氣流動相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動減小