目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建生物醫(yī)學課件

請你找找看……什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？構(gòu)建基因文庫由什么用呢？構(gòu)建一個基因文庫都有哪些基本步驟，請概括！請你找找看……什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？一．基因文庫概述

1、概念基因文庫(library)：一套包含某生物體所有基因的DNA序列。這些序列分別與適當?shù)妮d體結(jié)合在一起。一．基因文庫概述1、概念2、基本組成包括：基因組文庫、cDNA文庫cDNA：由mRNA逆轉(zhuǎn)錄的DNA，因此不含非轉(zhuǎn)錄的基因組序列。單鏈cDNA可由DNA聚合酶轉(zhuǎn)變成雙鏈，應用于基因工程。

2、基本組成包括：基因組文庫、cDNA文庫基因組文庫GenomicDNAlibrary使用與切割載體相同的限制酶，將供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段連接到載體上，構(gòu)成一個重組DNA群體這個群體包含全基因組的遺傳信息基因組文庫GenomicDNAlibrary使用與切割cDNA文庫（cDNAlibrary）

以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補DNA(complementaryDNA，cDNA)將雙鏈cDNA與適當載體連接轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成cDNA文庫cDNA文庫（cDNAlibrary）以mRNA為?；蚪M文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有基因cDNA文庫只包括某一特定細胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時期的表達序列分離特定基因，cDNA庫比較方便研究調(diào)控序列，必須用到基因組文庫基因組文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有3、構(gòu)建目的創(chuàng)建基因文庫的目的：從特定的材料中分離目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一個庫中，采用一定的方法在庫中篩選目的基因。同時也便于基因的長期保存。3、構(gòu)建目的創(chuàng)建基因文庫的目的：從特定的材料中分離目Sanger第一步：加入復制終止劑轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成cDNA文庫找出含有目的基因的細胞盡可能高的完備性①概念：PCR全稱為_______________，是一項所有基因的DNA序列?；蚪M文庫GenomicDNAlibrary（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）可以當作正常堿基參與復制，DNA探針（probe）（一）切割：基因組DNA的分解所有基因的DNA序列。什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。在熱作用下，_____斷裂，形成___________轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成cDNA文庫基因組文庫GenomicDNAlibrarySau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增測序自動測序儀4、基因文庫的構(gòu)建流程（1）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當限制酶切割許多DNA片段與載體連接導入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導入受體菌群該生物cDNA文庫Sanger第一步：加入復制終止劑4、基因文庫的構(gòu)建流程（5、基因文庫的質(zhì)量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選5、基因文庫的質(zhì)量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不二、目的基因的克隆二、目的基因的克隆用限制酶切斷成許多片段1、直接分離法—“鳥槍法”載入運載體導入不同的受體細胞大量復制和表達找出含有目的基因的細胞限制酶將DNA切成許多片段用限制酶切斷成許多片段1、直接分離法—“鳥槍法”載入運載體鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景2、人工合成基因法：1）逆轉(zhuǎn)錄法：mRNA雙鏈DNA(即目的基因)逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNA合成2）直接合成法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因（雙鏈）化學合成2、人工合成基因法：1）逆轉(zhuǎn)錄法：mRNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶3、通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成

當基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。3、通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基4、利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段4、利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為____5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G1.目的基因受熱變性，解旋；2.引物與單鏈互補結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物Ⅱ1.目(2)利用PCR技術擴增②原理：__________DNA復制③條件：_______________________、

_______________、______________、

__________(做啟動子)。已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶、解旋酶④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n⑤結(jié)果：使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增(2)利用PCR技術擴增②原理：__________DNA復⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板b、找出含有目的基因的細胞根據(jù)待選基因相關信息確定篩選方法和條件。Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)測序自動測序儀從基因庫中篩選特定的克隆用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌ddNTPs參與下的DNA復制Sanger第一步：加入復制終止劑1、直接分離法—“鳥槍法”什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？(2)利用PCR技術擴增以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補鳥槍法克隆目的基因的局限性①概念：PCR全稱為_______________，是一項由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補鳥槍法克隆目的基因的局限性c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從不能獲得的最小長度的目的基因三、基因文庫的構(gòu)建（一）切割：基因組DNA的分解用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！找出含有目的基因的細胞三、基因文庫的構(gòu)建（一）切割：基因組D載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的

上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)粒l-DNA考斯質(zhì)粒15kb25kb45kbYAC400

kb上述幾種載體的

用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆二、篩選：從基因庫中篩選特定的克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？根據(jù)待選基因相關信息確定篩選方法和條件。最常用的方法是利用DNA探針，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，篩選基因文庫從基因庫中篩選特定的克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸單鏈、雙鏈同位素標記、熒光標記、顏色標記DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的篩選文庫質(zhì)?；驇旌Y選細菌混合液在培養(yǎng)在平板上轉(zhuǎn)移到尼龍膜上裂解細菌變性DNA標記探針雜交漂洗放射自顯影或熒光檢測挑取對應菌落、培養(yǎng)抽提質(zhì)粒篩選文庫質(zhì)?；驇旌Y選陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一步分析、鑒定，才能最后得到目的基因測序自動測序儀功能分析預測軟件陽性克隆的分析與鑒定從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一磷酸二脂鍵磷酸二脂鍵分離特定基因，cDNA庫比較方便鳥槍法克隆目的基因的局限性超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭細菌混合液在培養(yǎng)在平板上(2)利用PCR技術擴增反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般1：3~4)。Sanger第二步：熒光檢測Sanger第二步：熒光檢測二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）基因組文庫與cDNA文庫的比較：3、通過DNA合成儀直接合成目的基因(2)利用PCR技術擴增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控4、基因文庫的構(gòu)建流程在熱作用下，_____斷裂，形成___________連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級不能獲得的最小長度的目的基因功能分析預測軟件超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力ddNTPs參與下的DNA復制DNA、cDNA、寡聚核苷酸③條件：_______________________、反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；這些序列分別與適當?shù)妮d體結(jié)合在一起。一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？原子探針顯微鏡測序法可以當作正常堿基參與復制，使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增在生物____復制___________的核酸合成技術反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般1：3~4)。載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆可以當作正常堿基參與復制，基因文庫(library)：一套包含某生物體在熱作用下，_____斷裂，形成___________1、直接分離法—“鳥槍法”_______________、______________、用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和5、基因文庫的質(zhì)量標準測序電泳圖譜分離特定基因，cDNA庫比較方便部分酶切法一般選用四對堿基識基因測序及分析基因測序及分析30序列測定的技術

雜交測序法質(zhì)譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法DNA芯片法經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化學降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術方法:序列測定的技術雜交測序法經(jīng)典方法:新技術方法:31與PCR反應類似。反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；反應過程：變性－復性－延伸－終止Sanger雙脫氧終止法與PCR反應類似。Sanger雙脫氧終止法32Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應終止劑可以當作正常堿基參與復制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般1：3~4)。Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddN33*少一個－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結(jié)構(gòu)比較*少一個－OH脫氧核甘酸34Sanger第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快Sanger第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得35ddNTPs參與下的DNA復制Sanger法測序產(chǎn)物的平均鏈長取決于ddNTP：dNTP的比例，比例高時，得到較短的產(chǎn)物；“標記／終止法”測序產(chǎn)物的平均長度可通過標記反應中dNTP濃度(高濃度能得到長的產(chǎn)物)或終止反應的ddNTP:dNTP來調(diào)整。

ddNTPs參與下的DNA復制Sanger法測序產(chǎn)物的平均鏈36Sanger第二步：熒光檢測Sanger第二步：熒光檢測37一．基因文庫概述

1、概念基因文庫(library)：一套包含某生物體所有基因的DNA序列。這些序列分別與適當?shù)妮d體結(jié)合在一起。一．基因文庫概述1、概念5、基因文庫的質(zhì)量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選5、基因文庫的質(zhì)量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景2、人工合成基因法：1）逆轉(zhuǎn)錄法：mRNA雙鏈DNA(即目的基因)逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNA合成2）直接合成法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因（雙鏈）化學合成2、人工合成基因法：1）逆轉(zhuǎn)錄法：mRNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶三、基因文庫的構(gòu)建（一）切割：基因組DNA的分解用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！三、基因文庫的構(gòu)建（一）切割：基因組DNA的分解在生物____復制___________的核酸合成技術基因文庫(library)：一套包含某生物體所有基因的DNA序列。在生物____復制___________的核酸合成技術功能分析預測軟件基因DNA的核苷酸序列4、基因文庫的構(gòu)建流程Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控DNA(complementaryDNA，cDNA)鳥槍法克隆目的基因的局限性ddNTPs參與下的DNA復制找出含有目的基因的細胞4、基因文庫的構(gòu)建流程鳥槍法克隆目的基因的局限性使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增盡可能高的完備性反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因5、基因文庫的質(zhì)量標準所有基因的DNA序列。Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和DNA、cDNA、寡聚核苷酸1、直接分離法—“鳥槍法”克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序原子探針顯微鏡測序法細菌混合液在培養(yǎng)在平板上反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般1：3~4)。同時也便于基因的長期保存。限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。5、基因文庫的質(zhì)量標準對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC載體ddNTPs參與下的DNA復制使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增Sanger第二步：熒光檢測可以當作正常堿基參與復制，Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控基因DNA的核苷酸序列的________。反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般1：3~4)。5、基因文庫的質(zhì)量標準重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選

上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)粒l-DNA考斯質(zhì)粒15kb25kb45kbYAC400

kb在生物____復制___________的核酸合成技術Sau請你找找看……什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？構(gòu)建基因文庫由什么用呢？構(gòu)建一個基因文庫都有哪些基本步驟，請概括！請你找找看……什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？一．基因文庫概述

1、概念基因文庫(library)：一套包含某生物體所有基因的DNA序列。這些序列分別與適當?shù)妮d體結(jié)合在一起。一．基因文庫概述1、概念2、基本組成包括：基因組文庫、cDNA文庫cDNA：由mRNA逆轉(zhuǎn)錄的DNA，因此不含非轉(zhuǎn)錄的基因組序列。單鏈cDNA可由DNA聚合酶轉(zhuǎn)變成雙鏈，應用于基因工程。

2、基本組成包括：基因組文庫、cDNA文庫基因組文庫GenomicDNAlibrary使用與切割載體相同的限制酶，將供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段連接到載體上，構(gòu)成一個重組DNA群體這個群體包含全基因組的遺傳信息基因組文庫GenomicDNAlibrary使用與切割cDNA文庫（cDNAlibrary）

以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補DNA(complementaryDNA，cDNA)將雙鏈cDNA與適當載體連接轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成cDNA文庫cDNA文庫（cDNAlibrary）以mRNA為?；蚪M文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有基因cDNA文庫只包括某一特定細胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時期的表達序列分離特定基因，cDNA庫比較方便研究調(diào)控序列，必須用到基因組文庫基因組文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有3、構(gòu)建目的創(chuàng)建基因文庫的目的：從特定的材料中分離目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一個庫中，采用一定的方法在庫中篩選目的基因。同時也便于基因的長期保存。3、構(gòu)建目的創(chuàng)建基因文庫的目的：從特定的材料中分離目Sanger第一步：加入復制終止劑轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成cDNA文庫找出含有目的基因的細胞盡可能高的完備性①概念：PCR全稱為_______________，是一項所有基因的DNA序列?；蚪M文庫GenomicDNAlibrary（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）可以當作正常堿基參與復制，DNA探針（probe）（一）切割：基因組DNA的分解所有基因的DNA序列。什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。在熱作用下，_____斷裂，形成___________轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成cDNA文庫基因組文庫GenomicDNAlibrarySau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增測序自動測序儀4、基因文庫的構(gòu)建流程（1）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當限制酶切割許多DNA片段與載體連接導入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導入受體菌群該生物cDNA文庫Sanger第一步：加入復制終止劑4、基因文庫的構(gòu)建流程（5、基因文庫的質(zhì)量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選5、基因文庫的質(zhì)量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不二、目的基因的克隆二、目的基因的克隆用限制酶切斷成許多片段1、直接分離法—“鳥槍法”載入運載體導入不同的受體細胞大量復制和表達找出含有目的基因的細胞限制酶將DNA切成許多片段用限制酶切斷成許多片段1、直接分離法—“鳥槍法”載入運載體鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景2、人工合成基因法：1）逆轉(zhuǎn)錄法：mRNA雙鏈DNA(即目的基因)逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNA合成2）直接合成法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因（雙鏈）化學合成2、人工合成基因法：1）逆轉(zhuǎn)錄法：mRNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶3、通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成

當基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。3、通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基4、利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段4、利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為____5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G1.目的基因受熱變性，解旋；2.引物與單鏈互補結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物Ⅱ1.目(2)利用PCR技術擴增②原理：__________DNA復制③條件：_______________________、

_______________、______________、

__________(做啟動子)。已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶、解旋酶④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n⑤結(jié)果：使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增(2)利用PCR技術擴增②原理：__________DNA復⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板b、找出含有目的基因的細胞根據(jù)待選基因相關信息確定篩選方法和條件。Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)測序自動測序儀從基因庫中篩選特定的克隆用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌ddNTPs參與下的DNA復制Sanger第一步：加入復制終止劑1、直接分離法—“鳥槍法”什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？(2)利用PCR技術擴增以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補鳥槍法克隆目的基因的局限性①概念：PCR全稱為_______________，是一項由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補鳥槍法克隆目的基因的局限性c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從不能獲得的最小長度的目的基因三、基因文庫的構(gòu)建（一）切割：基因組DNA的分解用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！找出含有目的基因的細胞三、基因文庫的構(gòu)建（一）切割：基因組D載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的

上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)粒l-DNA考斯質(zhì)粒15kb25kb45kbYAC400

kb上述幾種載體的

用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆二、篩選：從基因庫中篩選特定的克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？根據(jù)待選基因相關信息確定篩選方法和條件。最常用的方法是利用DNA探針，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，篩選基因文庫從基因庫中篩選特定的克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸單鏈、雙鏈同位素標記、熒光標記、顏色標記DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的篩選文庫質(zhì)粒基因庫篩選細菌混合液在培養(yǎng)在平板上轉(zhuǎn)移到尼龍膜上裂解細菌變性DNA標記探針雜交漂洗放射自顯影或熒光檢測挑取對應菌落、培養(yǎng)抽提質(zhì)粒篩選文庫質(zhì)?；驇旌Y選陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一步分析、鑒定，才能最后得到目的基因測序自動測序儀功能分析預測軟件陽性克隆的分析與鑒定從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一磷酸二脂鍵磷酸二脂鍵分離特定基因，cDNA庫比較方便鳥槍法克隆目的基因的局限性超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭細菌混合液在培養(yǎng)在平板上(2)利用PCR技術擴增反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般1：3~4)。Sanger第二步：熒光檢測Sanger第二步：熒光檢測二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）基因組文庫與cDNA文庫的比較：3、通過DNA合成儀直接合成目的基因(2)利用PCR技術擴增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控4、基因文庫的構(gòu)建流程在熱作用下，_____斷裂，形成___________連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級不能獲得的最小長度的目的基因功能分析預測軟件超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力ddNTPs參與下的DNA復制DNA、cDNA、寡聚核苷酸③條件：_______________________、反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；這些序列分別與適當?shù)妮d體結(jié)合在一起。一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？原子探針顯微鏡測序法可以當作正常堿基參與復制，使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增在生物____復制___________的核酸合成技術反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般1：3~4)。載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆可以當作正常堿基參與復制，基因文庫(library)：一套包含某生物體在熱作用下，_____斷裂，形成___________1、直接分離法—“鳥槍法”_______________、______________、用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和5、基因文庫的質(zhì)量標準測序電泳圖譜分離特定基因，cDNA庫比較方便部分酶切法一般選用四對堿基識基因測序及分析基因測序及分析73序列測定的技術

雜交測序法質(zhì)譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法DNA芯片法經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化學降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術方法:序列測定的技術雜交測序法經(jīng)典方法:新技術方法:74與PCR反應類似。反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；反應過程：變性－復性－延伸－終止Sanger雙脫氧終止法與PCR反應類似。Sanger雙脫氧終止法75Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應終止劑可以當作正常堿基參與復制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般1：3~4)。Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddN76*少一個－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結(jié)構(gòu)比較*少一個－OH脫氧核甘酸77Sanger第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快Sanger第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得78ddNTPs參與下的DNA復制Sanger法測序產(chǎn)物的平均鏈長取決于ddNTP：dNTP的比例，比例高時，得到較短的產(chǎn)物；“標記／終止法”測序產(chǎn)物的平均長度可通過標記反應中dNTP濃度(高濃度能得到長的產(chǎn)物)或終止反應的ddNTP:dNTP來調(diào)整。

ddNTPs參與下的DNA復制Sanger法測序產(chǎn)物的平均鏈79Sanger第二步：熒光檢測Sanger第二步：熒光檢測80一．基因文庫概述

1、概念基因文庫(library)：一套包含某生物體所有基因的DNA序列。這些序列分別與適當?shù)妮d體結(jié)合在一起。一．基因文庫概述1、概念5、基因文庫的