Brdu細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)Word版

整理為word格式整理為word格式整理為word格式Brdu檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作:鋪細(xì)胞，每個(gè)3.5cmdish10萬(wàn)個(gè)，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72h（細(xì)胞密度至50-60%左右）。Brdu（5-溴-2′-脫氧尿苷）加入培養(yǎng)細(xì)胞中，1mg/ml，標(biāo)記48h。(量：Brdu以鋪滿整個(gè)dish底面為準(zhǔn)。)固定：PBS洗細(xì)胞爬片3次，每次5min，在搖床上晃動(dòng)清洗，4%PFA固定30min。變性：將固定好的細(xì)胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃條件下變性5min，可放置于37℃恒溫孵箱，應(yīng)用封口膜把培養(yǎng)皿封好。（120r/m）中和：0.1mol/L的硼酸鈉（PH8.3）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m）加入1ml的0.2%TritonX-100，10min。吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。加入1ml3%的BSA封閉，室溫1h，可在搖床上晃動(dòng)。吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。10．加一抗（尿嘧啶脫氧核苷Brdu（鼠單抗）1:200），用1%BSA稀釋?zhuān)?度過(guò)夜。11．將孵好一抗的細(xì)胞爬片用PBS洗3次，每次10min。12．加二抗（羊抗鼠IgG/AlexaFluor5941:100），用1%BSA稀釋?zhuān)芄馐覝胤跤?h。（60r/min）13．將孵好二抗的細(xì)胞爬片用PBS洗3次，每次10min。14．加DAPI染細(xì)胞核，儲(chǔ)存濃度為1mg/ml，應(yīng)將DAPI完全混勻，可用手彈幾下，一般稀釋比例為1:1000（用PBS稀釋?zhuān)芄馐覝胤磻?yīng)10min。15．將DAPI染好的細(xì)胞爬片用PBS洗3次，每次10min。16．中性樹(shù)膠封片，熒光顯微鏡觀察，200×鏡下取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞和藍(lán)染的細(xì)胞核數(shù)目，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試劑配制：a.Brdu的溶解：室溫下，將250mg粉末溶于2.5ml的DMSO中，儲(chǔ)存濃度為100mg/ml分裝，每管120ul，-20℃保存。b.2mol/LHCl：取8.333mL12mol/LHCl的濃HCl，加入DDW定容至50mL。c.0.1mol/L硼酸鈉：稱(chēng)量1.907g硼砂（Na2B4·10H2O381.36g/mol），加入DDW定容至50mL，調(diào)PH=8.3。d.0.2%TritonX-100：有0.5%的Triton-100（2.5mL原液溶解于47.5mL的PBS中）整理為word格式整理為word格式整理為word格式，用PBS稀釋至0.2%。e.3%BSA：稱(chēng)量1.5gBSA，溶解于50mL的PBS中。f.1%BSA：用PBS稀釋3%BSA至1%。g.4%FPS：4%多聚甲醛。我是用DDW配制的，后來(lái)我發(fā)現(xiàn)很難溶，磁力攪拌器加熱攪拌，雖然溫度控制在60℃以下，也總是擔(dān)心多聚甲醛分解為甲醛，所以，我就總結(jié)為如下：提前配制。4%多聚甲醛溶液（pH7.2）試劑：多聚甲醛（PFA）4gDDW至100ml配制方法：稱(chēng)取4g多聚甲醛（粉末狀），置于三角燒瓶中，加入80mlDDW，放入37恒溫水浴箱，每隔1-2小時(shí)搖晃混勻，16-24小時(shí)PFA會(huì)完全溶解。補(bǔ)充DDW，調(diào)節(jié)PH值。實(shí)驗(yàn)原理：免疫染色實(shí)驗(yàn)的基本原理利用固定劑（通常是甲醛或多聚甲醛）將細(xì)胞固定，使得細(xì)胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白變性，從而使通透性進(jìn)一步加強(qiáng)。利用正常羊血清封閉，可以令許多蛋白先與血清內(nèi)的非特異性抗體結(jié)合，而特異性的抗體由于動(dòng)力學(xué)的關(guān)系可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的反應(yīng)與目的蛋白結(jié)合，這一過(guò)程可以保證抗體識(shí)別的特異性。二抗可以特異性識(shí)別一抗的Fc區(qū)域，利用二抗連接不同的熒光基團(tuán)，就可以在熒光顯微鏡下觀察到不同的熒光，從而顯示目的基因的表達(dá)情況。BrdU標(biāo)記原理細(xì)胞增殖周期包括G1、S、G2、M4個(gè)時(shí)期，其中S期是DNA合成期，細(xì)胞內(nèi)DNA進(jìn)行半保留復(fù)制，各種構(gòu)成DNA的原料摻入到DNA中。BrdU作為一種胸腺嘧啶核苷的類(lèi)似物（其化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是胸腺嘧啶的堿基嘧啶環(huán)上與5位C原子連接的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一樣可摻入到細(xì)胞合成的DNA中。當(dāng)細(xì)胞處于DNA合成期（S期）而同時(shí)又有BrdU存在時(shí),就會(huì)有BrdU摻入新合成的DNA中，只要細(xì)胞不消亡，這種BrdU就在胞核的DNA中長(zhǎng)期存留。摻入到DNA的BrdU可通過(guò)抗BrdU單克隆抗體在組織切片或細(xì)胞爬片上顯示。BrdU抗體比較大，由于DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的位阻，BrdU抗體無(wú)法直接與雙鏈上的BrdU結(jié)合，必須先用使DNA部分變性，這樣變性了的DNA單鏈上的BrdU才能與BrdU抗體結(jié)合，因此做BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)一定要變性，當(dāng)然變性的方法包括酸解，熱解等，但是要注意變性的程度也很重要。建議采用EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)方法，無(wú)需變性，無(wú)需酶解，無(wú)需抗體，小分子染色，3小時(shí)完成實(shí)驗(yàn)。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替T滲入正在復(fù)制的DNA分子，通過(guò)基于EdU與Apollo?熒光染料的特異性反應(yīng)檢測(cè)DNA復(fù)制活性，通快速、更靈敏、更準(zhǔn)確。EdU檢測(cè)染料只有BrdU抗體大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)很容易擴(kuò)散，無(wú)需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測(cè)，可有效避免樣品損傷，在細(xì)胞和組織水平能更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖等現(xiàn)象。該方法能對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行迅速而穩(wěn)定的測(cè)量,而且標(biāo)記BrdU的細(xì)胞只要不受到紫外線照射，對(duì)細(xì)胞本身沒(méi)有功能損害。該技術(shù)可應(yīng)用到跟蹤檢測(cè)移植細(xì)胞的存活、分化和功能狀態(tài)。3.DAPI染色原理DAPI為4’，6二脒基-2-苯吲哚(4’，6—diamidino-2—phenylindole)，能與雙鏈DNA小槽，特別是AT堿基結(jié)合，也可插入少于3個(gè)連續(xù)AT堿基對(duì)的DNA序列中。當(dāng)它與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)20倍，而與單鏈DNA結(jié)合則無(wú)熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，因此是一種簡(jiǎn)易、快速和敏感地檢測(cè)DNA的方法。DAPI的熒光強(qiáng)度雖較Hoechst低，但熒光穩(wěn)定性?xún)?yōu)于Hoechst；其特異性較溴化乙啶(ethidliumbromide，EB)和碘化丙啶(propidiumiodide，P1)高。DAPI的中文名稱(chēng)是4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚，是一種常用的熒光染料，其作用機(jī)理與溴化乙錠（EB）等染色劑的機(jī)理類(lèi)似：它們與DNA雙螺旋的凹槽部分可以發(fā)生相互作用，從而與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激發(fā)波長(zhǎng)是356nm，使得DAPI成為了一種常用的熒光檢測(cè)信號(hào)。整理為word格式整理為word格式整理為word格式ANALYSISOFCELLCYCLE1.INTRODUCTIONCellcycleandapoptosisareveryimportantfunctionalparameterstoassessthecellularmetabolism,physiologyandpathology.Severaltechniqueshavebeendevelopedtoquantitatetheseparametersutilizingthedifferentialstainingoffluorescentdyes.Wearedescribingfourdifferentflowcytometricmethods,twoforthediscriminationofcellcyclephases(AandB)andtwoforthesimultaneousassessmentofcellcycleandapoptosis(CandD).A)Bromodeoxyuridine/PropidiumIodideTheclassicalmethodfortheanalysisofcellcycledistributionistheflowcytometricmeasurementofDNAcontentwhichcansimultaneouslydeterminetheincorporationofBromodeoxyuridine(BrdU).TheprocedurerequiresthatDNAispartiallydenaturedtoexposeincorporatedBrdUtoaspecificantibody.DenaturationisnecessarybecauseantibodiesdevelopedsofarbindonlytoBrdUinsingle-strandDNA.TheremainingundenaturedDNAisthenstainedwithPropidiumIodide(PI).Greenfluorescencefromthefluorescein-conjugatedantibodyisameasureofBrdUincorporation.RedfluorescencefromthePIisameasureofDNA.Theprotocoldescribedhereuseshigh-molarityHClforthedenaturationofDNA.Furthermore,thismethodmaybeutilizedeitherforunfixedorforfixedcellsinsuspension.B)Cyclins/PropidiumIodideCyclinsarekeycomponentsofthecellcycleprogressionmachinery.Inparticular,theexpressionofcyclinsD,E,AandB1providesnewcellcyclelandmarksthatcanbeusedtosubdividecellcycleintoseveraldistinctsubcompartments.Inthisprocedurecyclinsexpressionisdetectableusingspecificmonoclonalantibodies(mAbs),andisanalysedinrespecttoDNAcontent.Generally,thepeakofexpressionofcyclinD1canbedetectedinearlyG1,thepeakofcyclinEistypicalofG1/Stransition,thepeakofcyclinAcanbedetectedduringG2/MphasesandcyclinB1istypicaloflateG2/M.Usingthismethod,comparedtotheabovementionedprotocol,itispossibletodistinguishG0fromG1andG2fromMphases.However,itisnecessarytokeepinmindthatnotallcelltypesbehaveinthesamemanner(forexample,cyclinD1isdetectablenotonlyinG0/G1butalsoinG2/M,evenifinaveryfewcelltypes).C)TUNEL/PropidiumIodideOneofthemostusedprotocolforthedeterminationofapoptosisinthedifferentphasesofcellcycleistheenzymaticinsitulabelingofapoptosis-inducedDNAstrandbreaks(TUNEL).Terminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)havebeenusedfortheincorporationoffluorescein-labelednucleotidestoDNAstrandsbreaksinsitu.DNAcontentisrevealedbyredfluorescencefromPI.Inordertohavemoredetails,seetheChaptersrelatedtoTUNELtechnique.整理為word格式整理為word格式整理為word格式D)F-Actin/PropidiumIodideTheanalysisofapoptoticcellsandestimationoftheircellcyclespecificityisalsopossibleusingarecentmethod.ThisisbasedonidentificationofapoptoticcellswhichhavemodifiedtheircytoskletonandtheirDNAcontent.Inspecific,paraformaldehyde(PFA)fixationfollowedbystainingofF-actinwithfluorescein-conjugatedphalloidinandofDNAwithPI,areused.Furthermore,thisproceduremaybeutilizedalsoforadherentcells.A)BrdU/PIPROTOCOLA.2.1MaterialsBrdU(A2),washingbuffer(A1),HCl4M,Boraxbuffer(A1),anti-BrdUantibody(A2),goat-anti-mouse-FITCantibody(A2),PIbuffer(A1).A.2.2.Methodology1.Cells(1x106/mL)areincubatedwithBrdU10mMatfinalconcentration,for30minat37°Cincontrolledatmosphere.2.Washtwiceat500gfor1minusingthewashingbuffer.3.Resuspendin0.5mLofwashingbufferand0.5mLofHCl4M.4.Mixaccuratelyandincubatefor30minatroomtemperature.5.Washonceasinstep2.6.Resuspendin1mLofBoraxbuffer.7.Asinstep5.8.Resuspendin200mLofwashingbufferandlabelwith5mLofmAbant-BrdU.9.Incubatefor1hourat4°Cinthedark.10.Asinstep5.11.Resuspendin200mLofwashingbufferandlabelwith4mLofgoat-anti-mouseFITC-conjugatedantibody.12.Incubatefor30minat4°Cinthedark.13.Asinstep5.14.Resuspendin200mLofwashingbufferand200mLofPIbuffer.15.Incubatefor15-30minat4°Cinthedark.16.Analysewithflowcytometerequippedwitha488nmargonlaser.A.3.COMMENTARYA.3.1BackgroundinformationInthisprocedurefixedcellsby4%PFAinPhosphateBufferSaline(PBS)canbeutilized.InthiscasetowashcellsonceinPBSbeforetostartatstep1isnecessary.Moreover,bothdirectandindirectimmunofluorescencecanbeused.TheBrdUincorporationismoreevidentusingtheindirectm