低氧聯(lián)合NaCl脅迫下蠶豆發(fā)芽富集γ

低氧聯(lián)合NaCl脅迫下蠶豆發(fā)芽富集Y-氨基丁酸培養(yǎng)條件優(yōu)楊潤(rùn)強(qiáng);陳惠;顧振新【摘要】以蠶豆（啟豆2號(hào)）為原料，研究了低氧聯(lián)合NaCl脅迫下培養(yǎng)條件對(duì)Y-氨基丁酸（GABA）富集的影響。結(jié)果顯示：非脅迫培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)pH和脅迫培養(yǎng)時(shí)間顯著影響發(fā)芽蠶豆GABA積累。蠶豆發(fā)芽富集GABA最佳培養(yǎng)條件是非脅迫培養(yǎng)1.5d、培養(yǎng)液pH3.5和低氧聯(lián)合NaCl脅迫4d，在此條件下其GABA含量可達(dá)1.06mg/gDW,為原料蠶豆的7.57倍。%Thecultureconditionof丫-aminobutyricacidaccumulationingerminatingfavabean（QiBean2）seedsunderhypoxiacombinedwithNaClwasinvestigated.Theresultsshowedthatnon-stressculturetime,pHandstresstimeimpactedtheaccumulationofGABAsignificantly.Theoptimumconditionwasculturingfor1.5days,pH3.5andstressfor4days.TheGABAcontentwas1.06mg/gDWandwas7.57-foldofthatinun-germinatedlavabean.【期刊名稱】《食品與發(fā)酵工業(yè)》【年(卷)，期】2012(038)005【總頁(yè)數(shù)】4頁(yè)(P77-80)【關(guān)鍵詞】蠶豆;發(fā)芽；Y-氨基丁酸;富集;低氧脅迫；NaC1脅迫【作者】楊潤(rùn)強(qiáng);陳惠;顧振新【作者單位】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京210095；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類(lèi)】S718.43蠶豆富含蛋白質(zhì)、淀粉、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等，是人體良好的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。發(fā)芽是改善豆類(lèi)種子營(yíng)養(yǎng)成分和降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的有效方法。發(fā)芽能提高豆類(lèi)生理活性物質(zhì)的含量，如發(fā)芽可提高蠶豆中L-二羥苯丙氨酸(L-DOPA)和總酚［1］,尤其Y-氨基丁酸(GABA)含量［2］。GABA是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，具有降血壓、降血脂等生理功能。植物在熱擊、冷害、機(jī)械損傷、鹽脅迫和低氧等逆境脅迫條件下，均能強(qiáng)烈激活谷氨酸脫羧酶(GAD)和二胺氧化酶(DAO)活性，促進(jìn)GABA的合成［3］。低氧脅迫下，植物細(xì)胞中H+濃度提高，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化，為GABA的合成提供了條件［4］。鹽脅迫可使細(xì)胞中Ca2+濃度升高，促使鈣調(diào)蛋白(CaM)表達(dá)水平提高，GAD被Ca2+/CaM激活，從而促進(jìn)GABA積累［5］。本文采用低氧聯(lián)合NaCl脅迫的方式處理發(fā)芽蠶豆，探討了培養(yǎng)條件對(duì)蠶豆發(fā)芽富集GABA的影響。通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、pH和脅迫時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)條件，為開(kāi)發(fā)功能性蠶豆食品提供科學(xué)依據(jù)。蠶豆品種:啟豆2號(hào)，購(gòu)自江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。蠶豆種子于2011年收獲后密閉保存于4°C下聚乙烯容器中，備用。稱取一定量蠶豆，用蒸餾水清洗后，1%的次氯酸鈉消毒30min，蒸餾水洗凈殘留的次氯酸鈉。于蒸餾水中30C浸泡8h，取出吸干表面水分，置于鋪有2層紗布的托盤(pán)(長(zhǎng)、寬、高分別為20cm、15cm和5cm)中，上面覆蓋2層濕紗布，于33±1C避光培養(yǎng)。非脅迫培養(yǎng):取30±2g經(jīng)8h浸泡處理的蠶豆，置于鋪有2層紗布的托盤(pán)(長(zhǎng)、寬、高分別為20cm、15cm和5cm)中，上面覆蓋2層濕紗布，分別避光培養(yǎng)0、0.5、1、1.5、2、2.5和3d后，測(cè)定GABA含量。pH:取30±2g經(jīng)前期培養(yǎng)的蠶豆，置于具塞培養(yǎng)瓶中，加入pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5的60mmol/LNaCl溶液250mL，參考Li等［6］的方法［(33±1)1，通氣量為1.2L/min］避光培養(yǎng)4d。脅迫培養(yǎng):取30±2g置于具塞培養(yǎng)瓶中，加入含有60mmol/L的NaCl溶液的檸檬酸緩沖液(pH3.5),于(33±1)°C下低氧脅迫0、1、2、3、4、5和6d。以培養(yǎng)時(shí)間、脅迫時(shí)間和pH為3個(gè)影響因素，各取3水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，研究發(fā)芽蠶豆中GABA含量變化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表。游離氨基酸:采用水合茚三酮顯色法測(cè)定［8］。稱取1.0g鮮重的發(fā)芽蠶豆于研缽，加5mL7%的乙酸研磨成漿。按照Bai等［7］的方法對(duì)樣品進(jìn)行純化。漿液靜置提取1h,6000r/min離心15min取上清液，加入5ml無(wú)水乙醇，在0~4C放置2h，以沉淀多糖和雜蛋白;之后6000r/min離心20min。上清液在0.1MPa,45C條件下真空干燥，殘余物溶于2mL1MNaHCO3(pH9.0)緩沖溶液，4000r/min離心10min，上清液備用。GABA測(cè)定采用高壓液相色譜HPLC(Agilent1200,USA),色譜柱為ZORBAXEclipseAAAreversed-phasecolumn(3.5pm),4.6x150mm,條件參照Yang等［8］的方法。取1mL(pH9.0)氨基酸溶液，加入2mg/mL的二甲氨基苯磺酰氯的丙酮溶液1mL,于67C保溫10min后用冰浴終止反應(yīng)，然后使用DAD檢測(cè)器于425nm紫外檢測(cè)。流動(dòng)相A為乙睛，流動(dòng)相B為0.045MCH3COONa(pH4)緩沖液，上樣量為20pL,流速為1mL/min，分離時(shí)間30min，柱度30C。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果換算成干基重，以平均值士SD表示，數(shù)據(jù)采用SPSS(18.0)軟件處理，設(shè)置顯著性水平為P<0.05。如圖1所示，隨非脅迫培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蠶豆中GABA含量呈先增加后減少的趨勢(shì)，培養(yǎng)1.5d時(shí)，發(fā)芽蠶豆中GABA含量達(dá)到最大值（1.02mg/gDW），為0d的3.43倍。因此，選擇培養(yǎng)時(shí)間1.5d為后續(xù)試驗(yàn)的非脅迫培養(yǎng)時(shí)間。由圖2可知，隨著發(fā)芽蠶豆培養(yǎng)液pH值的升高，GABA含量呈先下降后上升的變化趨勢(shì)。培養(yǎng)液pH值為3.0時(shí)，蠶豆GABA含量最高;但由于此pH條件下蠶豆發(fā)芽率很低，蠶豆生命活動(dòng)很弱，從而容易腐爛或有異味。因此，選擇pH值3.5作為后續(xù)試驗(yàn)緩沖液pH值。脅迫時(shí)間對(duì)GABA含量的影響見(jiàn)圖3。GABA含量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)先逐漸增加后趨于平衡。當(dāng)脅迫4d時(shí)，GABA含量達(dá)到最大值（1.02mg/gDW），此后，其含量趨于平衡。因此，選擇4d為后續(xù)試驗(yàn)所需的脅迫時(shí)間。選取單因素試驗(yàn)得到的發(fā)芽蠶豆富集GABA最佳培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)pH和脅迫時(shí)間為中間值，以培養(yǎng)時(shí)間（0.5d、1.5d和2.5d）、培養(yǎng)pH（3.5、4.0和4.5）和脅迫時(shí)間（2d、4d和6⑴進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1極差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)發(fā)芽蠶豆中GABA含量影響的主次順序?yàn)镃、A、B，即培養(yǎng)脅迫時(shí)間〉培養(yǎng)時(shí)間＞pH。比較各水平的K值可知，發(fā)芽蠶豆富集GABA的最佳培養(yǎng)條件為A2B1C2，即培養(yǎng)時(shí)間1.5d、培養(yǎng)pH3.5和脅迫時(shí)間4d（表中第4組）。植物受到低氧、冷激、干旱、鹽脅迫和機(jī)械傷害等逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)GABA含量顯著增加[9],其中低氧和鹽脅迫是富集GABA最安全有效的方法。但由于低氧和鹽脅迫均為逆境，若直接將植物種子置于其中，勢(shì)必長(zhǎng)勢(shì)不佳，因此最有效的方法是先將植物種子正常培養(yǎng)一段時(shí)間，之后置于低氧和鹽脅迫等逆境中進(jìn)行脅迫培養(yǎng)。因此，本研究采用此培養(yǎng)方法研究低氧聯(lián)合NaCl脅迫下培養(yǎng)條件對(duì)蠶豆GABA富集的影響。植物中GAD的最適反應(yīng)pH值通常在5.5~6.0之間[10],說(shuō)明植物體內(nèi)GAD在微酸性環(huán)境下活性高。Carroll等［11］研究表明，酸性環(huán)境激活了胡蘿卜細(xì)胞的GAD活性，導(dǎo)致GABA積累，當(dāng)胞質(zhì)pH恢復(fù)正常后GAD活性降低。Crawford等［12］研究發(fā)現(xiàn)，夕卜源加入透膜性弱酸15s后，蘆筍葉肉細(xì)胞出現(xiàn)GABA的積累。這些實(shí)驗(yàn)為植物細(xì)胞質(zhì)pH值變化影響GABA合成提供了證據(jù)。由于植物體內(nèi)L-Glu脫羧，造成反應(yīng)體系pH升高，偏離了GAD的最適pH，使GABA富集速度下降。將反應(yīng)置于緩沖體系中，可以穩(wěn)定反應(yīng)的pH值，提高GABA產(chǎn)量。白青云［13］研究表明，緩沖液類(lèi)型影響GABA富集，檸檬酸緩沖液培養(yǎng)的粟谷生長(zhǎng)情況良好，而醋酸緩沖液粟谷芽生長(zhǎng)受到抑制。粟谷富集GABA的最適pH值為5.8，與GAD的最適pH值相近。李巖［6］則采用pH3.19的檸檬酸-磷酸緩沖液富集蠶豆GABA。本研究選擇更安全可靠的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行GABA的富集研究。結(jié)果表明，培養(yǎng)pH3.5時(shí)，蠶豆生長(zhǎng)良好，GABA的富集量達(dá)到1.02mg/gDW。此pH值明顯低于大豆(pH4.1)［14］、糙米(pH5.6)［15］和粟谷(pH5.8)［16］。這是由于蠶豆子葉厚實(shí)、籽粒較大，因此外界環(huán)境中pH值必須足夠低才能維持體內(nèi)低pH條件。低氧聯(lián)合NaCl脅迫下，培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)pH和脅迫時(shí)間顯著影響發(fā)芽蠶豆GABA積累，并且三者對(duì)GABA含量影響的順序是:培養(yǎng)pH＞培養(yǎng)時(shí)間〉脅迫時(shí)間。KeywordsFavabean,germination,y-aminobutyricacid,accumulation,hypoxiastress,NaClstress【相關(guān)文獻(xiàn)】［1］RandhirR,ShettyP,ShettyK.L-DOPAandtotalphenolicstimulationindarkgerminatedfavabeaninresponsetopeptideandphytochemicalelicitors［J］.ProcessBiochemistry,2002,37(11):1247-1256.［2］Martinez-VillaluengaC,KuoYH,LambeinF,etal.Kineticsoffreeproteinaminoacids,freenon-proteinaminoacidsandtrigonellineinsoybean(GlycinemaxL.)andlupin(LupinusangustifoliusL.)sprouts[J].EuropeanFoodResearchandTechnology,2006,224(2):177-186.XingSG,JunYB,HauZW,etal.Higheraccumulationofgamma-aminobutyricacidinducedbysaltstressthroughstimulatingtheactivityofdiarnineoxidasesinGlycinemax(L.)Merr.roots[J].PlantPhysiologyandBiochemistry,2007,45(8):560-566.PerataP,VernieriP,ArmelliniD,etal.Immunologicaldetectionofacetaldehyde-proteinadductsinethanol-treatedcarrotcells[J].PlantPhysiology,1992,98(3):913-918.KinnersleyAM,TuranoFJ.Gammaaminobutyricacid(GABA)andplantresponsestostress[J].CriticalReviewsinPlantSciences,2000,19(6):479-509.LiY,BaiQ,JinX,WenH,etal.Effectsofcultivarandcultureconditionsony-aminobutyricacidaccumulationingerminatedfavabeans(ViciafabaL.)[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,2010,90(1):52-57.BaiQ,FanG,GuZ,etal.Effectsofcultureconditionsongamma-aminobutyricacidaccumulationduringgerminationoffoxtailmillet(SetariaitalicaL.)[J].EuropeanFoodResearchandTechnology,2008,228(2):169-175.YangR,ChenH,GuZ.Factorsinfluencingdiamineoxidaseactivityandy-aminobutyricacidcontentoffavabean(ViciafabaL.)duringgermination[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2011,59(21):11616-11620.KramerD,BreitensteinB,KleinwaechterM,etal.Stressmetabolismingreencoffeebeans(CoffeaarabicaL.):expressionofdehydrinsandaccumulationofGABAduringdrying[J].PlantandCellPhysiology,2010,51(4):546-553.JohnsonBS,SinghNK,CherryJH,etal.Purificationandcharacterizationofglutamatedecarboxylasefromcowpea[J].Phytochemistry,1997,46(1):39-44.CarrollAD,FoxGG,LaurieS,etal.Ammoniumassimilationandtheroleof[gamma]-aminobutyricacidinpHhomeostasisincarrotcellsuspensions[J].PlantPhysiology,1994,106(2):513-520.CrawfordLA,BownAW,BreitkreuzKE,etal.ThesynthesisofgammaaminobutyricacidinresponsetotreatmentsreducingcytosolicpH[J].PlantPhysiology,1994,104(3):865-871.白青云.低氧脅迫和鹽脅迫下發(fā)芽粟谷y-氨基丁酸富集機(jī)理及抗氧化性研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.YGuo,ChenH,SongY,etal.Effectsofsoakingandaerationtreatmentony-aminobutyricacidaccumulationingerminatedsoybean(GlycinemaxL.)[J].Europe