儀器分析分子發(fā)光分析法

關(guān)于儀器分析分子發(fā)光分析法第一頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日分子發(fā)光分析法較高激發(fā)態(tài)基態(tài)吸收能量受激退激光輻射分子在退激過(guò)程中以光輻射形式釋放能量§5-1分子發(fā)光分析法及其分類第二頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日根據(jù)分子受激時(shí)所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為以下幾類：光致發(fā)光：以光能來(lái)激發(fā)而發(fā)光

化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光—化學(xué)發(fā)光分析法熱致發(fā)光、生物發(fā)光、電致發(fā)光熒光—熒光分析法磷光—磷光分析法第三頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日激發(fā)光譜和熒光光譜熒光強(qiáng)度波長(zhǎng)（nm)300400500硫酸奎寧的兩個(gè)光譜Iλλex,maxλfl,max第四頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日硒熒光分光光度法GB17378.5-1998(13.1)油類沉積物熒光分光光度法GB17378.5-1998(14.1)石油烴熒光分光光度法GB17378.6-1998(14.1)第五頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日§5-2

熒光和磷光光譜法一、熒光和磷光光譜的產(chǎn)生基態(tài)分子光照后，價(jià)電子躍遷產(chǎn)生熒光和磷光基態(tài)分子價(jià)電子躍遷到激發(fā)態(tài)光照激發(fā)去激發(fā)光*

*n基態(tài)第六頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日1.電子自旋狀態(tài)的多重性分子中的電子數(shù)及自旋方向基態(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)單重態(tài)S1S0,S1,S2,S3分別代表基態(tài)、第一、二、三激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)分子具有抗磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-8第七頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日T1、T2、T3分別表示第一、二、三激發(fā)三重態(tài)由基態(tài)單重態(tài)→激發(fā)三重態(tài)，凈自旋0。這種躍遷為禁阻躍遷基態(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)三重態(tài)T1自旋平行三重態(tài)分子具有順磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-4~1S第八頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日2.無(wú)輻射去激外部轉(zhuǎn)移—激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，熒光或磷光減弱或消失振動(dòng)馳豫(VR)—同一電子能級(jí)中，從較高振動(dòng)能級(jí)到較低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程內(nèi)部轉(zhuǎn)換(IC)—相同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-S系間竄躍(ISC)—不同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-T

發(fā)生系間竄躍電子需轉(zhuǎn)向，S1—T1間進(jìn)行，比內(nèi)部轉(zhuǎn)換困難第九頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日T1S0ISCVRVRIC吸光吸光S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍第十頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日3.輻射去激—熒光和磷光產(chǎn)生S1或T1S0這種過(guò)程叫輻射去激發(fā)光(1)熒光：從S1的最低振動(dòng)能級(jí)回到S0各振動(dòng)能級(jí)所產(chǎn)生的光輻射叫熒光第十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日特點(diǎn)：產(chǎn)生速度快，10-9~10-6s；依賴于外部光源熒>激第十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光圖5-1分子熒光光譜產(chǎn)生過(guò)程示意圖S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍第十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日（2）磷光S1T1S0磷光特點(diǎn)：發(fā)光速度慢，約為10-4~10s，光照停止后，磷光仍可持續(xù)一段時(shí)間體系間竄躍(isc)發(fā)光第十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日磷光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)磷>熒>激

*易產(chǎn)生熒光

n*易產(chǎn)生磷光第十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光

磷光圖5-1分子熒光、磷光光譜產(chǎn)生過(guò)程示意圖S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍VR第十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日二、熒光、磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（一）熒光效率

熒光強(qiáng)度常用熒光量子效率φf(shuō)來(lái)描述

熒光量子效率f=發(fā)熒光的分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子總數(shù)第十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日f(shuō)是一個(gè)物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)，反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，

f

越大，熒光越強(qiáng)，在0~1之間。分析上有應(yīng)用價(jià)值的熒光化合物的熒光效率大于0.1。第十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日（二）熒光磷光與有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系至今對(duì)激發(fā)態(tài)分子的性質(zhì)了解不深，無(wú)法定量地描述熒光與分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系物質(zhì)只有吸收了紫外可見(jiàn)光，產(chǎn)生*、n*躍遷，產(chǎn)生熒光第十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日*與n*躍遷相比，摩爾吸收系數(shù)大102~103，壽命短*躍遷常產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，n*躍遷產(chǎn)生的熒光弱，但可產(chǎn)生系間竄躍，產(chǎn)生更強(qiáng)的磷光第二十頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日1.共軛體系——有較強(qiáng)的熒光具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物,電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生熒光;環(huán)越多，共軛程度越大,產(chǎn)生熒光波長(zhǎng)越長(zhǎng)，發(fā)射的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)第二十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日f(shuō)ex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲線狀環(huán)結(jié)構(gòu)比非線狀結(jié)構(gòu)的熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)第二十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日

多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測(cè)定

3,4-苯并芘是強(qiáng)致癌物ex=386nm

em=430nm第二十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日2.剛性平面結(jié)構(gòu)—較穩(wěn)定的平面結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu)熒光素：氧橋把兩個(gè)環(huán)固定在一個(gè)平面上，具有平面結(jié)構(gòu)，強(qiáng)熒光物質(zhì)酚酞：無(wú)氧橋把兩個(gè)環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)第二十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日例1，2-二苯乙烯反式：平面構(gòu)型強(qiáng)熒光體順式：非平面構(gòu)型非熒光體第二十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日（三）取代基的類型（1）增強(qiáng)熒光的取代基

-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團(tuán)由于基團(tuán)的n電子（孤對(duì)電子）的電子云與苯環(huán)上的軌道平行，共享了共軛電子，擴(kuò)大了共軛體系，使熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)第二十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日（2）減弱熒光的取代基

-COOH、-NO2

、-COOR、-NO、-SH吸電子基團(tuán),使熒光波長(zhǎng)短移，熒光強(qiáng)度減弱芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強(qiáng)，磷光增強(qiáng)，熒光減弱。磷光相應(yīng)增強(qiáng)，這種效應(yīng)為重原子效應(yīng)。（3）影響不明顯的取代基

-NH3+、-R、-SO3H等第二十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日三、環(huán)境對(duì)熒光、磷光的影響

1.溶劑的影響不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)溶劑的極性增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)紅移，強(qiáng)度增大

2.溫度的影響——低溫下測(cè)定，提高靈敏度因?yàn)檩椛滠S遷的速率基本不隨溫度變;非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。熒光效率會(huì)隨溶液溫度升高下降，強(qiáng)度減弱。溫度對(duì)磷光影響更大第二十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日3.pH的影響大多數(shù)含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大共軛酸堿對(duì)是具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長(zhǎng)例：苯酚離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無(wú)熒光第二十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日但兩個(gè)苯環(huán)相連的化合物，又表現(xiàn)出相反的性質(zhì)，分子形式無(wú)熒光，離子化后顯熒光例：—苯酚有熒光無(wú)熒光另外，表面活性劑也會(huì)影響熒光強(qiáng)度和特性第三十頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日熒光池I0IIf熒光強(qiáng)度檢測(cè)器四、熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系

強(qiáng)度為I0的入射光，照射到濃度很稀的熒光物質(zhì)時(shí),產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度If

與入射光強(qiáng)度有下面的關(guān)系：If=fIa=f（I0-I）Ia為吸收的輻射強(qiáng)度I0為入射光強(qiáng)度I為透射光

If=f（I0-I010-A

）

=fI0

（1-10-A

）I=I010-A第三十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日當(dāng)A﹤0.05時(shí)，方括號(hào)中其它各項(xiàng)與第一項(xiàng)相比可忽略不計(jì)，上式簡(jiǎn)化

If=2.3fI0A=2.3fI0bc將上式展開(kāi)第三十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日當(dāng)A﹤0.05時(shí)，

If與f、I0、

和c有關(guān)。對(duì)一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度一定時(shí)，f、I0、

和b為常數(shù)，合并為K

If=KCIp=KC定量分析依據(jù)第三十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度呈線形關(guān)系，

If=KC只有在濃度低時(shí)使用，熒光物質(zhì)測(cè)定的是微量或痕量組分，靈敏度高濃度高時(shí)，If與C不呈線形關(guān)系，有時(shí)C增大，If反而降低。因?yàn)楣絒]中后面影響；有時(shí)發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)第三十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日熒光猝滅

——熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞后使熒光強(qiáng)度下降(熒光效率f下降)稱為熒光猝滅。使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑第三十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見(jiàn)的熒光猝滅劑碰撞猝滅——M+激→M*M*+Q→M+Q+熱自熄滅——熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象第三十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日（一）熒光分析儀器

——主要由光源、單色器、樣品池、檢測(cè)器和顯示器組成。五、熒光和磷光分析儀器第三十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日光源第一單色器液池檢測(cè)器第二單色器檢測(cè)器放大器及記錄器exem與分光光度計(jì)有兩點(diǎn)不同①兩個(gè)單色器②檢測(cè)器與激發(fā)光互成直角I0I第三十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日1、光源激發(fā)光源一般要求比吸收測(cè)量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度；適用波長(zhǎng)范圍寬熒光計(jì)中，常使用鹵鎢燈作光源熒光光度計(jì)中常用高壓汞燈和氙弧燈應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強(qiáng)第三十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日2、單色器熒光計(jì)用濾光片作單色器，熒光計(jì)只能用于定量分析，不能獲得光譜大多數(shù)熒光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)

ex

第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來(lái)選擇測(cè)定用的熒光波長(zhǎng)

em。第四十頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日3、樣品池盛放測(cè)定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊4、檢測(cè)器把光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào),放大,直接轉(zhuǎn)成熒光強(qiáng)度熒光的強(qiáng)度一般較弱，要求檢測(cè)器有較高的靈敏度，熒光光度計(jì)采用光電倍增管熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可大大提高熒光強(qiáng)度5、讀出裝置掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜記錄,結(jié)果打印輸出第四十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日（二）激發(fā)光譜和熒光、磷光光譜激發(fā)光譜：熒光和磷光均為光致發(fā)光，合適的激發(fā)光波長(zhǎng)需根據(jù)激發(fā)光譜確定Iex固定em熒光波長(zhǎng)獲得方法：固定em不變，改變ex，測(cè)定它的熒光強(qiáng)度，以I為縱坐標(biāo)，ex為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜，確定最大ex第四十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日Iem固定ex激發(fā)光波長(zhǎng)獲得方法：固定ex不變，改變em，以I為縱坐標(biāo)，em為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜從曲線上找出最大的em發(fā)射光譜：熒光、磷光光譜第四十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日磷＞熒＞

激圖吸收峰熒光峰磷光峰第四十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日激發(fā)光譜和熒光光譜熒光強(qiáng)度波長(zhǎng)（nm)300400500硫酸奎寧的兩個(gè)光譜Iλλex,maxλfl,max第四十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日（三）磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室試樣需在液氮溫度（77K，-196℃）下測(cè)定低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶?jī)?nèi)）固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2.磷光鏡有些物質(zhì)既可產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。用機(jī)械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長(zhǎng)消除熒光干擾。第四十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日六、

熒光、磷光分析及應(yīng)用（一）定量分析方法定量分析依據(jù)If=KCIp=KC1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法——最常用的定量分析方法濃度C1C2C3C4C5Cx熒光強(qiáng)度If1If2If3If4If5IfxIfIfxCxC第四十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日2.熒光猝滅法把熒光猝滅用在定量分析上，具有較高的靈敏度和選擇性熒光物質(zhì)M與猝滅劑Q生成不發(fā)熒光的基態(tài)配合物MQ

M+Q=MQ（非熒光物質(zhì)）第四十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日猝滅劑加入前的熒光強(qiáng)度猝滅劑加入后試液的熒光強(qiáng)度常數(shù)猝滅劑濃度I前/I后與C(Q)有線性關(guān)系，可求猝滅劑含量經(jīng)推導(dǎo)得出：第四十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)曲線法I前/I后xCQxCQI前/I后第五十頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日3.比較法——比較簡(jiǎn)單如果試樣數(shù)量不多，可用比較法進(jìn)行測(cè)量配一標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為Cs，Cs與未知液濃度Cx相近，并在相同條件下測(cè)定它們的熒光強(qiáng)度未知液If

x=KCx

標(biāo)準(zhǔn)液If

s=KCs

比較第五十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日（二）熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法具有靈敏度高、取樣量少等優(yōu)點(diǎn)1.無(wú)機(jī)化合物的分析與有機(jī)化合物生成發(fā)熒光的有機(jī)配合物后，進(jìn)行熒光分析的元素達(dá)70多種，其中較常采用熒光法測(cè)定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素?zé)晒忖绶ㄒ彩菬晒夥治鲋薪?jīng)常采用的方法?？刹捎脽晒忖绶ㄩg接測(cè)定的離子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等第五十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日2.有機(jī)化合物的分析芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)熒光；可直接用熒光法測(cè)定。對(duì)于具有致癌活性的多環(huán)芳烴——熒光分析法是最主要的測(cè)定方法為提高測(cè)定的靈敏度，有時(shí)也將芳香族化合物與適當(dāng)試劑反應(yīng)之后進(jìn)行測(cè)定可測(cè)定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大量有機(jī)物質(zhì)，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等第五十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日例：3，4–苯并芘3，4–苯并芘為強(qiáng)致癌物質(zhì)煤炭、石油、天然氣等燃料不完全燃燒以及吸煙、焚燒垃圾都會(huì)產(chǎn)生3，4–苯并芘，汽車尾氣也是主要來(lái)源食品加工過(guò)程也會(huì)產(chǎn)生3，4–苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品分析測(cè)定：用環(huán)己烷將3，4–苯并芘從試樣中提取出來(lái)，用堿將提取液的脂肪類物質(zhì)皂化，然后用色譜法分離純化，用95%C2H5OH稀釋，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量第五十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，2022年，8月28日例：VB2——又稱核黃素，是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑，常存在于動(dòng)物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶液。在低濃度情況下，I=KC