植酸酶畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵條件研究(完整版)實(shí)用資料

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要范圍,同時(shí)停加甘油。植酸酶畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵條件研究（完整版）實(shí)用資料(可以直接使用，可編輯完整版實(shí)用資料，歡迎下載）3.4.5正交設(shè)計(jì)接種量、轉(zhuǎn)速、生長(zhǎng)pH值、D0四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。表2因素和水平表Table2Thechartoffactorsandlevels接種量轉(zhuǎn)速生長(zhǎng)pHDO(%(rpm(%水平254005.030-40水平3105005.540—503.5植霞爵贏麗而靳盯—————————————~發(fā)酵結(jié)束后放罐,得到發(fā)酵液即含植酸酶的粗酶液。由于本實(shí)驗(yàn)僅僅是傲一嘗試,所以只取少量發(fā)酵液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將發(fā)酵液過(guò)濾除菌,去掉酵母細(xì)胞。取上清液并將其放于平皿中,在40℃下真空濃縮,去除粗酶液中部分水,達(dá)到濃縮植酸酶的目的。以1:1的比例將濃縮液與滅菌的麥麩混合(v/w,mYg,放予40℃烘箱中處理5h,使含水量達(dá)到25%,即得到了植酸酶成品。測(cè)成品中的植酸酶酶活。4.試驗(yàn)結(jié)果4.1培養(yǎng)基4.1.1輔料(x1酶活力(KU/mL輔料名稱圖1.不周輔料對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1TheeffectofcomplementSOilphytaseactivity圖1結(jié)果表明,畢赤酵母基因工程菌在麥芽汁.麥麩培養(yǎng)基、麥芽汁.米糠培養(yǎng)基、麥芽汁一玉米粉培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基中的酶活力。均高于對(duì)照,其中以麥芽汁.麥麩培養(yǎng)基的酶活力最高,麥芽汁一玉米粉培養(yǎng)基的酶活力最低,麥芽汁.米糠培養(yǎng)基的酶活力介于兩者之間。因此選用麥麩作為培養(yǎng)基輔料,有利于酶活力的提高,即輔料x1為麥麩。4.1.2輔料添加量(X2酶活力(KU/mL麥麩添加量(g圖2.麥麩添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2Theeffectofbran’squantityOilphytaseactivity圖2結(jié)果表明,添加麥麩可以提高植酸酶的酶活力,隨著麥麩在培養(yǎng)基中含量的增加,植酸酶的酶活力呈上升趨勢(shì)。在1009麥芽粉中添加158麥麩和添加209麥麩的植酸酶的酶活力幾乎差不多。但考慮到培養(yǎng)基成本的問題,選擇麥麩的添加量為每1009麥芽粉添加159。輔料麥麩的添加量x2為159。4.1.3氨源補(bǔ)加生長(zhǎng)階段補(bǔ)加蛋白胨濃度(x3圖3結(jié)果表明,在生長(zhǎng)階段補(bǔ)加蛋白胨,不論18h還是35h的菌體濃度都高于對(duì)照,酶活力也高于對(duì)照?？梢?蛋白胨對(duì)菌體生長(zhǎng)和酶活力的提高都有促進(jìn)作用,蛋白胨濃度為3%時(shí),酶活力最高,所以在生長(zhǎng)階段蛋白胨濃度即X3為3%。蛋白胨濃度(%圖3.生長(zhǎng)階段添加蛋白胨與苗體濃度和產(chǎn)酶的關(guān)系Fig.3TheeffectofpeptoneconcentrationonYeastconcentrationandphytaseacth,ityatgrowthphase誘導(dǎo)階段補(bǔ)加蛋白胨濃度(】(4酶活力(KU,mL蛋白胨的添加重(%圖4.誘導(dǎo)階段添加蛋白胨對(duì)產(chǎn)酶的影響FigATheeffectofpeptoneconcentrationonphytaseactivityatinducingphase圖4結(jié)果表明,在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加1%、2%、3%的蛋白胨,發(fā)酵液的酶活力略高予對(duì)照,而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加4%、5%的蛋白胨,其發(fā)酵液的酶活力明顯低于對(duì)照。說(shuō)明蛋白胨在~定濃度范圍內(nèi),可提高酶活力?？紤]到在誘導(dǎo)階段補(bǔ)加蛋白膝對(duì)產(chǎn)酶沒有顯著影響,而且會(huì)增加培養(yǎng)基的成本,故在以后的實(shí)驗(yàn)中,在誘導(dǎo)表達(dá)階段不補(bǔ)加蛋白胨即(4為0。4。2植酸酶基因工程菌搖瓶培養(yǎng)條件4.2.1種齡(YT致謝本文是在導(dǎo)師王紅寧教授精心指導(dǎo)下完成的。三年來(lái)，王老師對(duì)我的生活、學(xué)習(xí)和研究等方面都給予了悉心的指導(dǎo)和關(guān)懷，培養(yǎng)了我獨(dú)立科研的能力，而王老師開闊的思路、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)、勇于攀登科技高峰的科學(xué)品質(zhì)更潛移默化地影響了我，激勵(lì)著我在科學(xué)的道路上繼續(xù)前進(jìn)ｌ在此論文完成之際，我向培養(yǎng)了我的導(dǎo)師致以最衷心的感謝！梁如玉副教授、廖德聰老師、陳惠副教授、柳萍老師、黃勇老師、趙海霞老師、吳琦博士、周生博士、李建文博士、鄒立扣博士、胡惠瓊博士，在我論文設(shè)計(jì)及完成過(guò)程中，提出了許多寶貴和富有建設(shè)性的意見，在此表示感謝！本課題組的許欽坤，玉米所的張建輝，以及本實(shí)驗(yàn)室的謝濤、李成忠、張瑞強(qiáng)、鄭連軍、王鋼、陳萍、余祖華、陳建華、汪洋等同學(xué)在我實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都給予了極大的幫助和關(guān)心，在我實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)困難的時(shí)候，是他們給了我精神動(dòng)力和智力支持，幫我順利度過(guò)難關(guān)。在此，對(duì)他們一并表示最衷心的感謝。最后，感謝我的家人和朋友，他們一直相信我，一貫支持我，是我論文順利完成的堅(jiān)強(qiáng)后盾。要范圍,同時(shí)停加甘油。3.4.5正交設(shè)計(jì)接種量、轉(zhuǎn)速、生長(zhǎng)pH值、D0四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。表2因素和水平表Table2Thechartoffactorsandlevels接種量轉(zhuǎn)速生長(zhǎng)pHDO(%(rpm(%水平254005.030-40水平3105005.540—503.5植霞爵贏麗而靳盯—————————————~發(fā)酵結(jié)束后放罐,得到發(fā)酵液即含植酸酶的粗酶液。由于本實(shí)驗(yàn)僅僅是傲一嘗試,所以只取少量發(fā)酵液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將發(fā)酵液過(guò)濾除菌,去掉酵母細(xì)胞。取上清液并將其放于平皿中,在40℃下真空濃縮,去除粗酶液中部分水,達(dá)到濃縮植酸酶的目的。以1:1的比例將濃縮液與滅菌的麥麩混合(v/w,mYg,放予40℃烘箱中處理5h,使含水量達(dá)到25%,即得到了植酸酶成品。測(cè)成品中的植酸酶酶活。4.試驗(yàn)結(jié)果4.1培養(yǎng)基4.1.1輔料(x1酶活力(KU/mL輔料名稱圖1.不周輔料對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1TheeffectofcomplementSOilphytaseactivity圖1結(jié)果表明,畢赤酵母基因工程菌在麥芽汁.麥麩培養(yǎng)基、麥芽汁.米糠培養(yǎng)基、麥芽汁一玉米粉培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基中的酶活力。均高于對(duì)照,其中以麥芽汁.麥麩培養(yǎng)基的酶活力最高,麥芽汁一玉米粉培養(yǎng)基的酶活力最低,麥芽汁.米糠培養(yǎng)基的酶活力介于兩者之間。因此選用麥麩作為培養(yǎng)基輔料,有利于酶活力的提高,即輔料x1為麥麩。4.1.2輔料添加量(X2酶活力(KU/mL麥麩添加量(g圖2.麥麩添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2Theeffectofbran’squantityOilphytaseactivity圖2結(jié)果表明,添加麥麩可以提高植酸酶的酶活力,隨著麥麩在培養(yǎng)基中含量的增加,植酸酶的酶活力呈上升趨勢(shì)。在1009麥芽粉中添加158麥麩和添加209麥麩的植酸酶的酶活力幾乎差不多。但考慮到培養(yǎng)基成本的問題,選擇麥麩的添加量為每1009麥芽粉添加159。輔料麥麩的添加量x2為159。4.1.3氨源補(bǔ)加生長(zhǎng)階段補(bǔ)加蛋白胨濃度(x3圖3結(jié)果表明,在生長(zhǎng)階段補(bǔ)加蛋白胨,不論18h還是35h的菌體濃度都高于對(duì)照,酶活力也高于對(duì)照?？梢?蛋白胨對(duì)菌體生長(zhǎng)和酶活力的提高都有促進(jìn)作用,蛋白胨濃度為3%時(shí),酶活力最高,所以在生長(zhǎng)階段蛋白胨濃度即X3為3%。蛋白胨濃度(%圖3.生長(zhǎng)階段添加蛋白胨與苗體濃度和產(chǎn)酶的關(guān)系Fig.3TheeffectofpeptoneconcentrationonYeastconcentrationandphytaseacth,ityatgrowthphase誘導(dǎo)階段補(bǔ)加蛋白胨濃度(】(4酶活力(KU,mL蛋白胨的添加重(%圖4.誘導(dǎo)階段添加蛋白胨對(duì)產(chǎn)酶的影響FigATheeffectofpeptoneconcentrationonphytaseactivityatinducingphase圖4結(jié)果表明,在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加1%、2%、3%的蛋白胨,發(fā)酵液的酶活力略高予對(duì)照,而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加4%、5%的蛋白胨,其發(fā)酵液的酶活力明顯低于對(duì)照。說(shuō)明蛋白胨在~定濃度范圍內(nèi),可提高酶活力。考慮到在誘導(dǎo)階段補(bǔ)加蛋白膝對(duì)產(chǎn)酶沒有顯著影響,而且會(huì)增加培養(yǎng)基的成本,故在以后的實(shí)驗(yàn)中,在誘導(dǎo)表達(dá)階段不補(bǔ)加蛋白胨即(4為0。4。2植酸酶基因工程菌搖瓶培養(yǎng)條件4.2.1種齡(YT致謝本文是在導(dǎo)師王紅寧教授精心指導(dǎo)下完成的。三年來(lái)，王老師對(duì)我的生活、學(xué)習(xí)和研究等方面都給予了悉心的指導(dǎo)和關(guān)懷，培養(yǎng)了我獨(dú)立科研的能力，而王老師開闊的思路、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)、勇于攀登科技高峰的科學(xué)品質(zhì)更潛移默化地影響了我，激勵(lì)著我在科學(xué)的道路上繼續(xù)前進(jìn)ｌ在此論文完成之際，我向培養(yǎng)了我的導(dǎo)師致以最衷心的感謝！梁如玉副教授、廖德聰老師、陳惠副教授、柳萍老師、黃勇老師、趙海霞老師、吳琦博士、周生博士、李建文博士、鄒立扣博士、胡惠瓊博士，在我論文設(shè)計(jì)及完成過(guò)程中，提出了許多寶貴和富有建設(shè)性的意見，在此表示感謝！本課題組的許欽坤，玉米所的張建輝，以及本實(shí)驗(yàn)室的謝濤、李成忠、張瑞強(qiáng)、鄭連軍、王鋼、陳萍、余祖華、陳建華、汪洋等同學(xué)在我實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都給予了極大的幫助和關(guān)心，在我實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)困難的時(shí)候，是他們給了我精神動(dòng)力和智力支持，幫我順利度過(guò)難關(guān)。在此，對(duì)他們一并表示最衷心的感謝。最后，感謝我的家人和朋友，他們一直相信我，一貫支持我，是我論文順利完成的堅(jiān)強(qiáng)后盾。中國(guó)生物工程雜志ChinaBiotechnology,2005,25(8:25～30植物耐鹽相關(guān)基因克隆與轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展3崔潤(rùn)麗2刁現(xiàn)民1,233(1河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所國(guó)家谷子改良中心石家莊050031(2河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院石家莊050016摘要土地鹽漬化是農(nóng)作物產(chǎn)量降低的一個(gè)重要因素。從鹽分對(duì)植物的傷害、植物耐鹽的機(jī)理、耐鹽相關(guān)基因的克隆及轉(zhuǎn)耐鹽基因植物等方面論述了植物的耐鹽機(jī)理及轉(zhuǎn)耐鹽基因植物的研究現(xiàn)狀,分析了耐鹽性狀的復(fù)雜性,并對(duì)前景進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞鹽害耐鹽機(jī)理基因克隆轉(zhuǎn)基因收稿日期:2005202131修回日期:20052052273河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2004000697,河北省農(nóng)林科學(xué)院資助項(xiàng)目(A032120210533通訊作者,電子信箱:xmdiao@土地鹽漬化是限制農(nóng)作物生長(zhǎng)、重的非生物脅迫之一取兩種措施,;,且隨著大量化學(xué)物質(zhì)的加入加重了土壤的次生鹽漬化,因此培育耐鹽的作物品種就日益重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了鹽分對(duì)植物的傷害、植物耐鹽的機(jī)理,克隆了一些耐鹽相關(guān)基因,并通過(guò)耐鹽相關(guān)基因轉(zhuǎn)化,獲得了一些耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植物,展示了誘人的前景。本文從植物耐鹽的機(jī)理、耐鹽相關(guān)基因的克隆及轉(zhuǎn)耐鹽基因植物等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述,對(duì)該領(lǐng)域的前景進(jìn)行了展望。1植物耐鹽的機(jī)理鹽分對(duì)植物脅迫分為滲透脅迫、離子傷害、離子不平衡或營(yíng)養(yǎng)缺乏三類,滲透脅迫和離子傷害目前被認(rèn)為是對(duì)植物危害的兩個(gè)主要過(guò)程[1]。植物的耐鹽性總的來(lái)說(shuō)可分為形態(tài)耐鹽和生理耐鹽。形態(tài)耐鹽性是特殊環(huán)境下的少數(shù)耐鹽植物進(jìn)化出特殊器官泌鹽和稀鹽,如海灘的紅樹和堿蓬屬植物。對(duì)多數(shù)植物來(lái)說(shuō),則是生理耐鹽。本文主要討論生理性耐鹽的研究進(jìn)展。1.1鹽脅迫下滲透機(jī)制的調(diào)節(jié)在鹽脅迫下,由于外界滲透壓較低,植物吸收水分,。植物為了避免這種,降低細(xì)胞的滲透勢(shì),從而使水分順利地進(jìn)入植物體內(nèi),保證植物正常生理活動(dòng)的進(jìn)行。滲透調(diào)節(jié)分為無(wú)機(jī)滲透調(diào)節(jié)和有機(jī)滲透調(diào)節(jié)。參與無(wú)機(jī)滲透調(diào)節(jié)的離子主要是Na+、K+、Ca2+和Cl2。趙可夫等[2]研究發(fā)現(xiàn)鹽生植物的無(wú)機(jī)滲透劑以Na+、K+和Cl2為主,而非鹽生植物高粱、蘆葦?shù)戎饕訩+和有機(jī)滲透物質(zhì)為主。說(shuō)明鹽生植物和非鹽生植物在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)方面的不同。植物在逆境中會(huì)主動(dòng)積累一些有機(jī)滲透物質(zhì),其中小分子化合物有如下幾類:第一類是多元醇,如甘油、山梨醇、甘露醇、右旋肌醇甲醚等;第二類是糖類,如蔗糖、海藻糖等;第三類是氨基酸及其衍生物,如脯氨酸、甘氨酸、甜菜堿等。這些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒,對(duì)代謝過(guò)程無(wú)抑制作用,它們的積累在一定范圍內(nèi)可以維持鹽脅迫下細(xì)胞的正常膨壓和代謝功能。這些保護(hù)滲透物質(zhì)在植物抗鹽研究中已越來(lái)越受重視。1.2鹽脅迫改變代謝途徑在鹽脅迫下,一些鹽生植物能夠通過(guò)改變其自身的代謝途徑而適應(yīng)高鹽度的生存環(huán)境。一些肉質(zhì)植物,如豆瓣綠屬植物、馬齒莧科植物以及禾本科植物冰草等,在鹽漬或水分脅迫下可以改變光合碳同化途徑,即由C3途徑變?yōu)镃AM途徑。CAM植物在夜間開放氣孔進(jìn)行CO2吸收和固定,白天氣孔關(guān)閉減少蒸騰量。這種轉(zhuǎn)變的機(jī)理,趙可夫等[2]認(rèn)為主要是Cl-活化了細(xì)胞中的RUBP羧化酶所導(dǎo)致的。并通過(guò)測(cè)量CO2固定和PEP羧化酶活性證實(shí)光合作用轉(zhuǎn)變是受鹽誘導(dǎo)的。中國(guó)生物工程雜志ChinaBiotechnologyVol.25No.82005整個(gè)光合作用途徑的改變是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程,涉及到的基因很多,利用改變植物光合作用途徑提高植物耐鹽性十分困難。1.3鹽脅迫下離子的區(qū)域化大量的研究表明,植物將吸收的Na+、Cl-等離子積累在液泡中,減少干擾細(xì)胞質(zhì)和葉綠體等的生化代謝過(guò)程,這種作用稱為離子的區(qū)域化作用。Flowers等[3]實(shí)驗(yàn)證明,鹽生植物和非鹽生植物的細(xì)胞對(duì)Na+都非常敏感,Na+、Cl-的區(qū)域化分配是植物對(duì)鹽漬環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。由于離子區(qū)域化,使得液泡中Na+濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞質(zhì)中的濃度。如高濃度NaCl條件下,生長(zhǎng)多代的煙草懸浮細(xì)胞系液泡中,積累的NaCl濃度相當(dāng)高,可達(dá)800mmol/L,而細(xì)胞質(zhì)NaCl的濃度仍保持在100mmol/L[4]。研究表明,在NaCl脅迫下,Na+通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞只有25%左右為主動(dòng)運(yùn)輸,輸,但Na+度的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程[5]+Cl-Niu[6]濱藜根和葉子質(zhì)膜上H+2ATPase基因的表達(dá)。Dopont[7]證明當(dāng)外界環(huán)境Na+濃度提高,植物通過(guò)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中,實(shí)現(xiàn)區(qū)域化,減少細(xì)胞質(zhì)中的Na+濃度,且在濱藜中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性是被NaCl誘導(dǎo)的。因此,深入研究液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)揭示作物耐鹽機(jī)理是至關(guān)重要的。1.4鹽分增加質(zhì)膜的透性鹽分能增加質(zhì)膜的透性,同時(shí)當(dāng)鹽脅迫時(shí),植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基,從而引起膜質(zhì)的過(guò)氧化,最終導(dǎo)致膜系統(tǒng)的破壞。80年代以來(lái),人們對(duì)鹽分脅迫下植物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)進(jìn)行了大量研究,并已確定它由一些能清除活性氧的酶系統(tǒng)和抗氧化物質(zhì)組成,如超氧化物歧化酶(SOD、過(guò)氧化物酶(POD、過(guò)氧化氫酶(CAT和抗壞血酸(ASA等,它們協(xié)同作用共同抵抗鹽分脅迫誘導(dǎo)的氧化傷害,而單一的抗氧化酶則不足以防御這種氧化脅迫。1.5鹽漬條件下拒鹽和對(duì)離子的選擇吸收某些鹽生植物能通過(guò)一些生理機(jī)制拒絕或減少對(duì)離子的吸收,從而減輕離子所造成的傷害。高粱在1000mmol/LNaCl中脅迫7天后,其根和莖部木質(zhì)部液中Na+比穗軸木質(zhì)部中Na+要高十幾倍,小麥、甜菜、玉米等在鹽的脅迫下其根Na+也要比地上部分高3～7倍[8]。說(shuō)明根具有抑制Na+吸收和向地上運(yùn)輸?shù)臋C(jī)能,對(duì)于這種限制移動(dòng)的控制機(jī)制目前人們認(rèn)為涉及以下過(guò)程:(1+,即使進(jìn),就是進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)+Na+局限于細(xì)胞間隙中;(Na+被吸入液泡,并將其封閉在液泡,阻止Na+向葉片運(yùn)輸;(3植物體內(nèi)把進(jìn)入導(dǎo)管內(nèi)的Na+向?qū)Ч芡馀懦?Na+聚積在與導(dǎo)管相鄰的薄壁組織細(xì)胞中,同時(shí)將移動(dòng)到地上部分的Na+從導(dǎo)管滲進(jìn)篩管,再將其返送到根部。植物通過(guò)這種機(jī)制保持細(xì)胞質(zhì)有極低滲透勢(shì),以抵消液泡滲透勢(shì)的降低,對(duì)減輕高鹽對(duì)植物損傷有重要作用。2耐鹽相關(guān)基因的克隆2.1近年來(lái)克隆到的鹽誘導(dǎo)基因近20年來(lái),隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,作物耐鹽生理生化機(jī)制日益明確,使克隆與作物耐鹽相關(guān)基因成為可能,近年來(lái)克隆到的部分基因見表1。表1近年來(lái)克隆到的部分鹽誘導(dǎo)基因Table1Partialgenesclonedforsalttolerance基因來(lái)源功能資料來(lái)源基因登錄號(hào)AhProTi榆錢菠菜脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白申義國(guó)等[9]AF270651P5CS大豆脯氨酸合成酶Delauney等[10]AY492005SOS1擬南芥反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Shi等[11]AF256224BADH細(xì)菌甜菜堿脫氫酶Larimer等[12]BX572595SsAPX鹽地堿蓬過(guò)氧化物酶馬常樂等[13]AY034893CDPKI擬海桑鈣調(diào)蛋白基因Huang等[14]AY466385TaNHX1小麥Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因王子寧等[15]AY040245SacB枯草桿菌果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶Rey等[16]NC006270DsALDP鹽藻果糖-1,6-二磷酸醛縮酶張曉寧等[17]AY092823622005,25(8崔潤(rùn)麗等:植物耐鹽相關(guān)基因克隆與轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展2.2耐鹽相關(guān)基因的分類根據(jù)基因產(chǎn)物的不同,可將現(xiàn)已克隆的基因分為以下幾類。2.2.1滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的基因這些基因在正常條件下表達(dá)量極低,但是在鹽脅迫條件下會(huì)大量表達(dá)并產(chǎn)生一些小分子有機(jī)物,如脯氨酸、甜菜堿、糖醇等。通過(guò)這些小分子物質(zhì)維持細(xì)胞滲透勢(shì),提高植物的耐鹽性。(1脯氨酸合成相關(guān)基因1990年,Delauney等[10]在大豆中發(fā)現(xiàn)P5CS酶與滲透調(diào)節(jié)有關(guān),由此提取mRNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,進(jìn)一步篩選得到了P5CS基因。到目前為止,P5CS基因已經(jīng)從紫花苜蓿、豌豆、擬南芥、水稻等物種中得到克隆和鑒定,不同生物的P5CS基因具有較高的同源性。在紫花苜蓿、豌豆、擬南芥、水稻中的研究表明:鹽處理或干旱條件下P5CS基因轉(zhuǎn)錄水平有很大程度的提高,并最終導(dǎo)致了脯氨酸含量的增加[18]。(2成相關(guān)基因Falkenberg等[19]cDNA片段,并證明與脫酶(BADH的活性有關(guān)McCue等[20]從甜菜的λ10cDNA文庫(kù)中克隆了3個(gè)負(fù)責(zé)編碼BADH的cDNA,發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與菠菜的BADH具有83%的同源性。BADH和CMO等基因已應(yīng)用到耐鹽植物基因工程研究中。2.2.2與離子區(qū)域化相關(guān)的基因液泡膜上的Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接參與了Na+在液泡中的積累。王子寧等[15]以水稻Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA為探針,從小麥鹽脅迫的cDNA文庫(kù)中篩選和克隆了2個(gè)Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,分別命名為TaNHX1和TaNHX2。這2個(gè)基因與已知的水稻、擬南芥和濱藜中的同類基因NHX的相似性約為70%。RT2PCR分析表明,小麥苗經(jīng)400mmol/L的NaCl處理1h后TaNHX1基因的轉(zhuǎn)錄水平有所提高。Shi等[11]從擬南芥中克隆了1個(gè)Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SOS1,并證明SOS1基因是Na+和K+在液泡中富集所必需的,與植物耐鹽性直接相關(guān)。SOS1基因所編碼的蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域與已知的真核生物和細(xì)菌的該基因具有顯著的同源性。Apes等[21]將1個(gè)編碼液泡膜Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因轉(zhuǎn)入擬南芥,證明其耐鹽性顯著增強(qiáng),可在含鹽量為200mmol/L的NaCl土壤中生長(zhǎng)。此外,還有其他關(guān)于Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的報(bào)道,目前大家一致認(rèn)為Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)﹄x子的區(qū)域化具有重要作用。2.2.3保護(hù)酶基因保護(hù)酶(尤其是SOD是人們研究在1989年就已經(jīng)獲得了,SOD基因,包括Fe2/SOD基因既有單拷,線粒體和葉綠體中的SOD是在核內(nèi)合成后再分泌到細(xì)胞器中的。多數(shù)SOD基因的表達(dá)都具有組織特異性,并受許多環(huán)境因素的影響。趙風(fēng)云等[22]的研究表明,水稻的Mn2SOD基因(sodA1可由ABA、干旱、鹽脅迫誘導(dǎo),而Fe2SOD基因則由ABA誘導(dǎo),質(zhì)體的Cu/Zn2SOD基因(sodCp由鹽脅迫在光下誘導(dǎo)而黑暗條件下則不誘導(dǎo)。這些現(xiàn)象說(shuō)明不同的SOD基因表達(dá)受不同的因素誘導(dǎo),因此僅轉(zhuǎn)入1個(gè)或1種類型的SOD基因難以提高植物的耐鹽能力。3轉(zhuǎn)基因耐鹽植物研究進(jìn)展盡管人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并克隆了許多與耐鹽相關(guān)的基因,但僅有少量基因被用于轉(zhuǎn)化工作。近年來(lái)獲得的主要轉(zhuǎn)耐鹽相關(guān)基因植物見表2。表2近年獲得的主要轉(zhuǎn)耐鹽相關(guān)基因(或轉(zhuǎn)錄因子植物Table2Recenttransgenicplantsforsalttolerance基因轉(zhuǎn)入植物轉(zhuǎn)基因植物的表現(xiàn)資料來(lái)源BADH小麥、煙草抗?jié)B透耐鹽、耐旱能力明顯提高劉鳳華等[23]mtlD/gutD水稻耐鹽能力較轉(zhuǎn)它們的單基因植物明顯增強(qiáng)劉俊君等[24]P5CS水稻幼苗抗鹽能力顯著增強(qiáng)蘇金等[25]gutD玉米具有較高的耐鹽性,可在1.75%NaCl培養(yǎng)基上生長(zhǎng)劉巖等[26]SOD紫花苜蓿顯著提高植物的耐鹽性Apes等[21]NHXVP1煙草抗性提高,可在鹽脅迫條件下生長(zhǎng)趙風(fēng)云等[22]AtNHX1擬南芥基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在根、嫩枝、花中的含量提高M(jìn)cKersie等[27]AhproTi擬南芥可耐受200mmol/LNaCl,并可持續(xù)生長(zhǎng)申義國(guó)等[9]DsALDP煙草在100～200mmol/LNaCl下仍保持醛縮酶活性張曉寧等[17]SOS1水稻顯著提高耐鹽性O(shè)hta等[28]Apx大麥顯著提高耐鹽性Ishitani[29]72中國(guó)生物工程雜志ChinaBiotechnologyVol.25No.82005目前獲得的一些轉(zhuǎn)基因植物耐鹽性雖有提高,但這只是相對(duì)于對(duì)照植株而言的,轉(zhuǎn)入均是單個(gè)基因或相關(guān)的兩個(gè)基因,并沒有得到生產(chǎn)大田能利用的抗鹽植株。目前比較一致的觀點(diǎn)是:植物的耐鹽性是多種生理性狀的綜合表現(xiàn),是由位于不同染色體上的多個(gè)基因控制的,因此培育有實(shí)踐意義的轉(zhuǎn)基因植物可能需要同時(shí)轉(zhuǎn)入多個(gè)基因。3.1導(dǎo)入編碼產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的酶基因劉鳳華等[23]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將BADH基因?qū)氩葺蜔煵葜蝎@得轉(zhuǎn)基因植株,鑒定表明:轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性較對(duì)照明顯提高,并利用PCR檢測(cè)證明耐鹽性的提高是由于外源BADH表達(dá)的結(jié)果。蘇金等[25]獲得的轉(zhuǎn)基因水稻提高了脯氨酸水平,秧苗對(duì)100～150mmol/LNaCl具有一定的抗性。除脯氨酸和甘氨酸甜菜堿外,其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),如甘露醇和山梨醇合成的關(guān)鍵酶12磷酸甘露醇脫氫酶(mtlD和62磷(]等[26]將這2,分別獲得在1.75%NaCl培養(yǎng)基中有一定耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因植株。3.2導(dǎo)入與離子區(qū)域化效應(yīng)有關(guān)的基因Ohta等[28]將Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)入水稻,在水稻中超表達(dá)該基因,發(fā)現(xiàn)其木質(zhì)部蒸騰流中Na+的含量明顯降低,植物的耐鹽性增強(qiáng),顯示可以通過(guò)限制Na+在植物細(xì)胞中的積累來(lái)提高植物的耐鹽性。趙風(fēng)云等[22]從SuaedaSalsa中克隆到Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,并證明該基因?qū)χ参锏哪望}性至關(guān)重要。Apes等[21]將一編碼液泡Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)入擬南芥使其超表達(dá),結(jié)果表明,該轉(zhuǎn)基因植株能夠在NaCl含量為200mmol/L的土壤中生長(zhǎng)發(fā)育,比對(duì)照耐鹽性顯著提高,可見轉(zhuǎn)入與離子區(qū)域化效應(yīng)有關(guān)的基因可顯著提高植物的耐鹽性。4導(dǎo)入耐鹽植物的總DNA將耐鹽植物的總DNA直接導(dǎo)入大田作物來(lái)提高其耐鹽性也是近幾年來(lái)遺傳工程研究中的一個(gè)重要方面。林棲鳳等[30]利用花粉管通道技術(shù),將海岸耐鹽植物紅樹的DNA導(dǎo)入茄子,獲得的轉(zhuǎn)化后代已在海灘上試種,可以用含鹽量2.5%的海水澆灌,約90%的植株能開花結(jié)果,完成生長(zhǎng)周期,并對(duì)其在鹽脅迫下的生長(zhǎng)情況、蒸騰速率、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性以及葉片氣孔的電鏡觀察等進(jìn)行了研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,導(dǎo)入紅樹DNA培育的茄子耐鹽能力明顯增強(qiáng),已繁殖到第三代,而對(duì)照植株幾乎全部死亡。綜上所述,盡管不同的研究者從諸多方面對(duì)植物的耐鹽機(jī)理作了大量的研究,并已達(dá)到了一定的廣度和深度,但由于植物耐鹽性是一個(gè)受多基因控制的復(fù)雜的數(shù)量性狀,它受植物種類、品種基因型和內(nèi)部生理生化反應(yīng)的影響,離實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用還有相當(dāng)大的距離。我們雖然了解了一些鹽脅迫條件下作物的反應(yīng)變化,但我們卻不能確定哪一種反應(yīng)是主要的,利用的可能性有多大,產(chǎn)生的耐鹽效應(yīng)有多大。在轉(zhuǎn)基因植物方面,雖然得到了一些轉(zhuǎn)基因植物,但如何協(xié)調(diào)好外源基因與內(nèi)源基因的關(guān)系,控制好基因表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量,避免對(duì)作物的消極影響等問題還有待進(jìn)一步研究。,。參考文獻(xiàn)[1]LevittJ.ResponseofPlantstoEnvironmentalStress(VolII.2nded.NewYork:AcademicPress,1980.102～106[2]趙可夫,李法曾.中國(guó)鹽生植物.北京:科學(xué)出版社,1999.191～200ZhaoKF,LiFZ.HalophyteinChina.Beijing:SciencePress,1999.191～200[3]FlowersTJ,HarveyDMR.Ionsrelationofsalttolerance.AustralianJournalofPlantPhysiology,1997,24:89～91[4]張福鎖.植物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)生理學(xué)和遺傳學(xué).北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,1993.206～230ZhangFS.PlantNutritionEcophysiologyandGenetics.Beijing:ChinaScienceandTechnologyPress,1993.206～230[5]王寶山,趙可夫,鄒奇.作物耐鹽機(jī)理研究進(jìn)展及提高作物耐鹽性的對(duì)策.植物學(xué)通報(bào),1997,33(6:423～426WangBSH,ZhaoKF,ZouQ.ChineseBulletinofBotany,1997,33(6:423～426[6]NiuXM,ZhuJK,NarasimhanML,etal.PlasmamembraneH+2ATPasegeneexpressionisregulatedbyNaClincellofthehalophyteAtriplexnummalariaL.Planta,1993,190:433～438[7]DopontFM.Salt2inducedchangesiniontransport:regulationofprimarypumpsandsecondarytransporters.In:ClarksonDTed.TransportandReceptorProteinsofPlantMembranes.NewYork:PlenumPress,1992.91～100[8]MicheletB,BoutryM.TheplasmamembraneH+2ATPaseahighlyregulatedenzymewithmultiplephysiologicalfunctions.PlantPhysiol,1995,108:1～6[9]申義國(guó),閆冬青,張萬(wàn)科,等.榆錢菠菜脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及轉(zhuǎn)擬南芥的耐鹽性.植物學(xué)報(bào),2002,44(8:956～962ShenYG,YanDQ,ZhangWK,etal.ActaBotanicaSinica,2002,44(8:956～962[10]DelauneyAJ,VermaDPS.AsoybeangeneencodingΔ12pyrroline2s2carboxylatereductasewasisolatedbyfunctional822005,25(8崔潤(rùn)麗等:植物耐鹽相關(guān)基因克隆與轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展complementationinE.coliandisfoundtobeosmoregulated.MolGenGendt,1990,221:299～305[11]ShiH,IshitaniM,KimC,etal.TheArabidopsisthalianasalttolerancegeneSOS1encodesaputativeNa+/H+antiporter.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(12:6896～6901[12]LarimerFW,ChainP.CompletegenomesequenceofthemetabolicallyversatilephotosyntheticbacteriumRhodopseduomonaspalustris.NatBiotechnol,2004,22(1:55～61[13]馬常樂,王萍萍,曹子誼,等.鹽地堿蓬A(yù)PX基因的克隆及鹽脅迫下的表達(dá).植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),2002,28(4:261～266MaCHL,WangPP,CaoZY,etal.JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,2002,28(4:261～266[14]HuangJ,MullapudiN.FirstglimpseintothepatternandscaleofgenetransferintheApicomplexa.IntJParasitol,2004,34(3:265～274[15]王子寧,張勁松,郭北海,等1小麥Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆和特性.植物學(xué)報(bào),2002,44(10:1203～1208WangZN,ZhangJS,GuoBH,etal.ActaBotanicaSinica,2002,44(10:1203～1208[16]ReyMW,RamaiyaP.CompleteindustrialBmBi2004,5:77～80[17]張曉寧,林長(zhǎng)發(fā),.受NaCl誘導(dǎo)的鹽藻果糖21,62二磷酸醛縮酶cDNA的克隆及其在煙草中的表達(dá).中國(guó)科學(xué),2002,32(5:392～398ZhangXN,LinCHF,ChenHY,etal.ScienceinChina,2002,32(5:392～398[18]郭蓓,邱麗娟,李向華,等.植物鹽誘導(dǎo)基因的研究進(jìn)展.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),1999,7(4:401～408GuoB,QiuLJ,LiXH.JournalofAgriculturalBiotechnology,1999,7(4:401～408[19]FalkenbergP,StormAR.PurificationandcharacterizationofosmoregulatorybetainealdehydedehydrogenaseofE.coli.BiochimBiophysActa,1990,1034:253～259[20]McCueKF,HansonAD.Salt2induciblebetainealdehydedehydrogenaseformsugarbeet:cDNAcloningandexpression.PlantMolecularBiology,1992,18(1:1～11[21]ApesMP,AharonGS.SalttoleranceconferredbyoverexpressionofavacuolarNa+/H+antiportinArabidopsis.Science,1999,285:1256～1258[22]趙風(fēng)云,郭善利,王增蘭,等1耐鹽轉(zhuǎn)基因植物研究進(jìn)展1植物生理與分子生物學(xué)報(bào),2003,29(3:171～178ZhaoFY,GuoSHL,WangZL,JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,2003,29(30:171～178[23]劉鳳華,郭巖,陳受宜,等.轉(zhuǎn)甜菜堿脫氫酶基因植物的耐鹽性研究.遺傳學(xué)報(bào),1997,24(1:54～58LiuFH,GuoY,ChenSHY,etal.ActaGeneticaSinica,1997,24(1:54～58[24]劉俊君,彭學(xué)賢,王慧中,等.轉(zhuǎn)mtlD/gutD雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性.科學(xué)通報(bào),2000,45(7:724～729LiuJJ,PengXX,WangHZH,etal.ChineseScienceBulletin,2000,45(7:724729[25]蘇金,陳丕鈴,吳瑞,等12P脫氫酶轉(zhuǎn)基因表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn).中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),1999,32:～L,WuR,etal.ScientiaAgriculturaSinica,32(6:101～103[26]劉巖,王國(guó)英,張福鎖,等.大腸桿菌gutD基因轉(zhuǎn)入玉米及耐鹽轉(zhuǎn)基因植株的獲得.中國(guó)科學(xué),1998,28(6:542～547LiuY,WangGY,ZhangFS,etal.ScienceinChina,1998,28(6:542～547[27]McKersieBD,BowleySR,JonesKS.Wintersurvivaloftransgenicalfalfaoverexposingsuperoxidedismutase.PlantPhysiol,1999,119:839～847[28]OhtaM,HayashiY.IntroductionofaNa+/H+antiportergeneformAtriplexgmeliniconfersalttolerancetorice.FEBSLett,2000,532(3:279～282[29]IshitaniM.Expressionofthebatainealdehydedehydrogenasegeneinbarlyinresponsetoosmoticstressandabscisicacid.PlantMolecularBiology,1995,27(2:307～315[30]林棲鳳,李冠一.紅樹DNA導(dǎo)入茄子獲得耐鹽性后代的研究.生物工程進(jìn)展,2001,21(5:40～44LinQF,LiGY.ChinaBiotechnology,2001,21(5:40～44AdvancesonCloningandTranslationoftheSaltToleranceGenesinPlantCUIRun2li2DIAOXian2min1,2(1TheNationalMilletImprovementCenter,InstituteofMillet,HebeiAcademyofAgricultureandForestShijiazhuang050031,China(2CollegeofLifeScience,HebeiNormalUniversityShijiazhuang050016,ChinaAbstractSalinityisoneofthemajorconstrainsincropproductionallovertheworld.Tryingtounderstandthemechanismofsalttoleranceandbreedingofsalttoleranttransgenicplantisahotpointinplantscience.Theprogressinfouraspectsofthisfieldincludingharmfulnessofsalinity,mechanismofsalttolerant,cloningofsalttolerantrelatedgenesandbreedingofsalttoleranttransgeniccropswerereviewed.Thecomlexityofsalttolerantmechanismandtheprospectofsalttolerantmolecularbreedingwerediscussed.KeywordsSalinityThemechanismofsalttolerantGenecloningTransgene92要范圍,同時(shí)停加甘油。3.4.5正交設(shè)計(jì)接種量、轉(zhuǎn)速、生長(zhǎng)pH值、D0四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。表2因素和水平表Table2Thechartoffactorsandlevels接種量轉(zhuǎn)速生長(zhǎng)pHDO(%(rpm(%水平254005.030-40水平3105005.540—503.5植霞爵贏麗而靳盯—————————————~發(fā)酵結(jié)束后放罐,得到發(fā)酵液即含植酸酶的粗酶液。由于本實(shí)驗(yàn)僅僅是傲一嘗試,所以只取少量發(fā)酵液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將發(fā)酵液過(guò)濾除菌,去掉酵母細(xì)胞。取上清液并將其放于平皿中,在40℃下真空濃縮,去除粗酶液中部分水,達(dá)到濃縮植酸酶的目的。以1:1的比例將濃縮液與滅菌的麥麩混合(v/w,mYg,放予40℃烘箱中處理5h,使含水量達(dá)到25%,即得到了植酸酶成品。測(cè)成品中的植酸酶酶活。4.試驗(yàn)結(jié)果4.1培養(yǎng)基4.1.1輔料(x1酶活力(KU/mL輔料名稱圖1.不周輔料對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1TheeffectofcomplementSOilphytaseactivity圖1結(jié)果表明,畢赤酵母基因工程菌在麥芽汁.麥麩培養(yǎng)基、麥芽汁.米糠培養(yǎng)基、麥芽汁一玉米粉培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基中的酶活力。均高于對(duì)照,其中以麥芽汁.麥麩培養(yǎng)基的酶活力最高,麥芽汁一玉米粉培養(yǎng)基的酶活力最低,麥芽汁.米糠培養(yǎng)基的酶活力介于兩者之間。因此選用麥麩作為培養(yǎng)基輔料,有利于酶活力的提高,即輔料x1為麥麩。4.1.2輔料添加量(X2酶活力(KU/mL麥麩添加量(g圖2.麥麩添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2Theeffectofbran’squantityOilphytaseactivity圖2結(jié)果表明,添加麥麩可以提高植酸酶的酶活力,隨著麥麩在培養(yǎng)基中含量的增加,植酸酶的酶活力呈上升趨勢(shì)。在1009麥芽粉中添加158麥麩和添加209麥麩的植酸酶的酶活力幾乎差不多。但考慮到培養(yǎng)基成本的問題,選擇麥麩的添加量為每1009麥芽粉添加159。輔料麥麩的添加量x2為159。4.1.3氨源補(bǔ)加生長(zhǎng)階段補(bǔ)加蛋白胨濃度(x3圖3結(jié)果表明,在生長(zhǎng)階段補(bǔ)加蛋白胨,不論18h還是35h的菌體濃度都高于對(duì)照,酶活力也高于對(duì)照?？梢?蛋白胨對(duì)菌體生長(zhǎng)和酶活力的提高都有促進(jìn)作用,蛋白胨濃度為3%時(shí),酶活力最高,所以在生長(zhǎng)階段蛋白胨濃度即X3為3%。蛋白胨濃度(%圖3.生長(zhǎng)階段添加蛋白胨與苗體濃度和產(chǎn)酶的關(guān)系Fig.3TheeffectofpeptoneconcentrationonYeastconcentrationandphytaseacth,ityatgrowthphase誘導(dǎo)階段補(bǔ)加蛋白胨濃度(】(4酶活力(KU,mL蛋白胨的添加重(%圖4.誘導(dǎo)階段添加蛋白胨對(duì)產(chǎn)酶的影響FigATheeffectofpeptoneconcentrationonphytaseactivityatinducingphase圖4結(jié)果表明,在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加1%、2%、3%的蛋白胨,發(fā)酵液的酶活力略高予對(duì)照,而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加4%、5%的蛋白胨,其發(fā)酵液的酶活力明顯低于對(duì)照。說(shuō)明蛋白胨在~定濃度范圍內(nèi),可提高酶活力?？紤]到在誘導(dǎo)階段補(bǔ)加蛋白膝對(duì)產(chǎn)酶沒有顯著影響,而且會(huì)增加培養(yǎng)基的成本,故在以后的實(shí)驗(yàn)中,在誘導(dǎo)表達(dá)階段不補(bǔ)加蛋白胨即(4為0。4。2植酸酶基因工程菌搖瓶培養(yǎng)條件4.2.1種齡(YT致謝本文是在導(dǎo)師王紅寧教授精心指導(dǎo)下完成的。三年來(lái)，王老師對(duì)我的生活、學(xué)習(xí)和研究等方面都給予了悉心的指導(dǎo)和關(guān)懷，培養(yǎng)了我獨(dú)立科研的能力，而王老師開闊的思路、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)、勇于攀登科技高峰的科學(xué)品質(zhì)更潛移默化地影響了我，激勵(lì)著我在科學(xué)的道路上繼續(xù)前進(jìn)ｌ在此論文完成之際，我向培養(yǎng)了我的導(dǎo)師致以最衷心的感謝！梁如玉副教授、廖德聰老師、陳惠副教授、柳萍老師、黃勇老師、趙海霞老師、吳琦博士、周生博士、李建文博士、鄒立扣博士、胡惠瓊博士，在我論文設(shè)計(jì)及完成過(guò)程中，提出了許多寶貴和富有建設(shè)性的意見，在此表示感謝！本課題組的許欽坤，玉米所的張建輝，以及本實(shí)驗(yàn)室的謝濤、李成忠、張瑞強(qiáng)、鄭連軍、王鋼、陳萍、余祖華、陳建華、汪洋等同學(xué)在我實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都給予了極大的幫助和關(guān)心，在我實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)困難的時(shí)候，是他們給了我精神動(dòng)力和智力支持，幫我順利度過(guò)難關(guān)。在此，對(duì)他們一并表示最衷心的感謝。最后，感謝我的家人和朋友，他們一直相信我，一貫支持我，是我論文順利完成的堅(jiān)強(qiáng)后盾。中國(guó)生物工程雜志ChinaBiotechnology,2005,25(8:25～30植物耐鹽相關(guān)基因克隆與轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展3崔潤(rùn)麗2刁現(xiàn)民1,233(1河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所國(guó)家谷子改良中心石家莊050031(2河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院石家莊050016摘要土地鹽漬化是農(nóng)作物產(chǎn)量降低的一個(gè)重要因素。從鹽分對(duì)植物的傷害、植物耐鹽的機(jī)理、耐鹽相關(guān)基因的克隆及轉(zhuǎn)耐鹽基因植物等方面論述了植物的耐鹽機(jī)理及轉(zhuǎn)耐鹽基因植物的研究現(xiàn)狀,分析了耐鹽性狀的復(fù)雜性,并對(duì)前景進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞鹽害耐鹽機(jī)理基因克隆轉(zhuǎn)基因收稿日期:2005202131修回日期:20052052273河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2004000697,河北省農(nóng)林科學(xué)院資助項(xiàng)目(A032120210533通訊作者,電子信箱:xmdiao@土地鹽漬化是限制農(nóng)作物生長(zhǎng)、重的非生物脅迫之一取兩種措施,;,且隨著大量化學(xué)物質(zhì)的加入加重了土壤的次生鹽漬化,因此培育耐鹽的作物品種就日益重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了鹽分對(duì)植物的傷害、植物耐鹽的機(jī)理,克隆了一些耐鹽相關(guān)基因,并通過(guò)耐鹽相關(guān)基因轉(zhuǎn)化,獲得了一些耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植物,展示了誘人的前景。本文從植物耐鹽的機(jī)理、耐鹽相關(guān)基因的克隆及轉(zhuǎn)耐鹽基因植物等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述,對(duì)該領(lǐng)域的前景進(jìn)行了展望。1植物耐鹽的機(jī)理鹽分對(duì)植物脅迫分為滲透脅迫、離子傷害、離子不平衡或營(yíng)養(yǎng)缺乏三類,滲透脅迫和離子傷害目前被認(rèn)為是對(duì)植物危害的兩個(gè)主要過(guò)程[1]。植物的耐鹽性總的來(lái)說(shuō)可分為形態(tài)耐鹽和生理耐鹽。形態(tài)耐鹽性是特殊環(huán)境下的少數(shù)耐鹽植物進(jìn)化出特殊器官泌鹽和稀鹽,如海灘的紅樹和堿蓬屬植物。對(duì)多數(shù)植物來(lái)說(shuō),則是生理耐鹽。本文主要討論生理性耐鹽的研究進(jìn)展。1.1鹽脅迫下滲透機(jī)制的調(diào)節(jié)在鹽脅迫下,由于外界滲透壓較低,植物吸收水分,。植物為了避免這種,降低細(xì)胞的滲透勢(shì),從而使水分順利地進(jìn)入植物體內(nèi),保證植物正常生理活動(dòng)的進(jìn)行。滲透調(diào)節(jié)分為無(wú)機(jī)滲透調(diào)節(jié)和有機(jī)滲透調(diào)節(jié)。參與無(wú)機(jī)滲透調(diào)節(jié)的離子主要是Na+、K+、Ca2+和Cl2。趙可夫等[2]研究發(fā)現(xiàn)鹽生植物的無(wú)機(jī)滲透劑以Na+、K+和Cl2為主,而非鹽生植物高粱、蘆葦?shù)戎饕訩+和有機(jī)滲透物質(zhì)為主。說(shuō)明鹽生植物和非鹽生植物在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)方面的不同。植物在逆境中會(huì)主動(dòng)積累一些有機(jī)滲透物質(zhì),其中小分子化合物有如下幾類:第一類是多元醇,如甘油、山梨醇、甘露醇、右旋肌醇甲醚等;第二類是糖類,如蔗糖、海藻糖等;第三類是氨基酸及其衍生物,如脯氨酸、甘氨酸、甜菜堿等。這些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒,對(duì)代謝過(guò)程無(wú)抑制作用,它們的積累在一定范圍內(nèi)可以維持鹽脅迫下細(xì)胞的正常膨壓和代謝功能。這些保護(hù)滲透物質(zhì)在植物抗鹽研究中已越來(lái)越受重視。1.2鹽脅迫改變代謝途徑在鹽脅迫下,一些鹽生植物能夠通過(guò)改變其自身的代謝途徑而適應(yīng)高鹽度的生存環(huán)境。一些肉質(zhì)植物,如豆瓣綠屬植物、馬齒莧科植物以及禾本科植物冰草等,在鹽漬或水分脅迫下可以改變光合碳同化途徑,即由C3途徑變?yōu)镃AM途徑。CAM植物在夜間開放氣孔進(jìn)行CO2吸收和固定,白天氣孔關(guān)閉減少蒸騰量。這種轉(zhuǎn)變的機(jī)理,趙可夫等[2]認(rèn)為主要是Cl-活化了細(xì)胞中的RUBP羧化酶所導(dǎo)致的。并通過(guò)測(cè)量CO2固定和PEP羧化酶活性證實(shí)光合作用轉(zhuǎn)變是受鹽誘導(dǎo)的。中國(guó)生物工程雜志ChinaBiotechnologyVol.25No.82005整個(gè)光合作用途徑的改變是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程,涉及到的基因很多,利用改變植物光合作用途徑提高植物耐鹽性十分困難。1.3鹽脅迫下離子的區(qū)域化大量的研究表明,植物將吸收的Na+、Cl-等離子積累在液泡中,減少干擾細(xì)胞質(zhì)和葉綠體等的生化代謝過(guò)程,這種作用稱為離子的區(qū)域化作用。Flowers等[3]實(shí)驗(yàn)證明,鹽生植物和非鹽生植物的細(xì)胞對(duì)Na+都非常敏感,Na+、Cl-的區(qū)域化分配是植物對(duì)鹽漬環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。由于離子區(qū)域化,使得液泡中Na+濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞質(zhì)中的濃度。如高濃度NaCl條件下,生長(zhǎng)多代的煙草懸浮細(xì)胞系液泡中,積累的NaCl濃度相當(dāng)高,可達(dá)800mmol/L,而細(xì)胞質(zhì)NaCl的濃度仍保持在100mmol/L[4]。研究表明,在NaCl脅迫下,Na+通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞只有25%左右為主動(dòng)運(yùn)輸,輸,但Na+度的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程[5]+Cl-Niu[6]濱藜根和葉子質(zhì)膜上H+2ATPase基因的表達(dá)。Dopont[7]證明當(dāng)外界環(huán)境Na+濃度提高,植物通過(guò)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中,實(shí)現(xiàn)區(qū)域化,減少細(xì)胞質(zhì)中的Na+濃度,且在濱藜中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性是被NaCl誘導(dǎo)的。因此,深入研究液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)揭示作物耐鹽機(jī)理是至關(guān)重要的。1.4鹽分增加質(zhì)膜的透性鹽分能增加質(zhì)膜的透性,同時(shí)當(dāng)鹽脅迫時(shí),植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基,從而引起膜質(zhì)的過(guò)氧化,最終導(dǎo)致膜系統(tǒng)的破壞。80年代以來(lái),人們對(duì)鹽分脅迫下植物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)進(jìn)行了大量研究,并已確定它由一些能清除活性氧的酶系統(tǒng)和抗氧化物質(zhì)組成,如超氧化物歧化酶(SOD、過(guò)氧化物酶(POD、過(guò)氧化氫酶(CAT和抗壞血酸(ASA等,它們協(xié)同作用共同抵抗鹽分脅迫誘導(dǎo)的氧化傷害,而單一的抗氧化酶則不足以防御這種氧化脅迫。1.5鹽漬條件下拒鹽和對(duì)離子的選擇吸收某些鹽生植物能通過(guò)一些生理機(jī)制拒絕或減少對(duì)離子的吸收,從而減輕離子所造成的傷害。高粱在1000mmol/LNaCl中脅迫7天后,其根和莖部木質(zhì)部液中Na+比穗軸木質(zhì)部中Na+要高十幾倍,小麥、甜菜、玉米等在鹽的脅迫下其根Na+也要比地上部分高3～7倍[8]。說(shuō)明根具有抑制Na+吸收和向地上運(yùn)輸?shù)臋C(jī)能,對(duì)于這種限制移動(dòng)的控制機(jī)制目前人們認(rèn)為涉及以下過(guò)程:(1+,即使進(jìn),就是進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)+Na+局限于細(xì)胞間隙中;(Na+被吸入液泡,并將其封閉在液泡,阻止Na+向葉片運(yùn)輸;(3植物體內(nèi)把進(jìn)入導(dǎo)管內(nèi)的Na+向?qū)Ч芡馀懦?Na+聚積在與導(dǎo)管相鄰的薄壁組織細(xì)胞中,同時(shí)將移動(dòng)到地上部分的Na+從導(dǎo)管滲進(jìn)篩管,再將其返送到根部。植物通過(guò)這種機(jī)制保持細(xì)胞質(zhì)有極低滲透勢(shì),以抵消液泡滲透勢(shì)的降低,對(duì)減輕高鹽對(duì)植物損傷有重要作用。2耐鹽相關(guān)基因的克隆2.1近年來(lái)克隆到的鹽誘導(dǎo)基因近20年來(lái),隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,作物耐鹽生理生化機(jī)制日益明確,使克隆與作物耐鹽相關(guān)基因成為可能,近年來(lái)克隆到的部分基因見表1。表1近年來(lái)克隆到的部分鹽誘導(dǎo)基因Table1Partialgenesclonedforsalttolerance基因來(lái)源功能資料來(lái)源基因登錄號(hào)AhProTi榆錢菠菜脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白申義國(guó)等[9]AF270651P5CS大豆脯氨酸合成酶Delauney等[10]AY492005SOS1擬南芥反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Shi等[11]AF256224BADH細(xì)菌甜菜堿脫氫酶Larimer等[12]BX572595SsAPX鹽地堿蓬過(guò)氧化物酶馬常樂等[13]AY034893CDPKI擬海桑鈣調(diào)蛋白基因Huang等[14]AY466385TaNHX1小麥Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因王子寧等[15]AY040245SacB枯草桿菌果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶Rey等[16]NC006270DsALDP鹽藻果糖-1,6-二磷酸醛縮酶張曉寧等[17]AY092823622005,25(8崔潤(rùn)麗等:植物耐鹽相關(guān)基因克隆與轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展2.2耐鹽相關(guān)基因的分類根據(jù)基因產(chǎn)物的不同,可將現(xiàn)已克隆的基因分為以下幾類。2.2.1滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的基因這些基因在正常條件下表達(dá)量極低,但是在鹽脅迫條件下會(huì)大量表達(dá)并產(chǎn)生一些小分子有機(jī)物,如脯氨酸、甜菜堿、糖醇等。通過(guò)這些小分子物質(zhì)維持細(xì)胞滲透勢(shì),提高植物的耐鹽性。(1脯氨酸合成相關(guān)基因1990年,Delauney等[10]在大豆中發(fā)現(xiàn)P5CS酶與滲透調(diào)節(jié)有關(guān),由此提取mRNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,進(jìn)一步篩選得到了P5CS基因。到目前為止,P5CS基因已經(jīng)從紫花苜蓿、豌豆、擬南芥、水稻等物種中得到克隆和鑒定,不同生物的P5CS基因具有較高的同源性。在紫花苜蓿、豌豆、擬南芥、水稻中的研究表明:鹽處理或干旱條件下P5CS基因轉(zhuǎn)錄水平有很大程度的提高,并最終導(dǎo)致了脯氨酸含量的增加[18]。(2成相關(guān)基因Falkenberg等[19]cDNA片段,并證明與脫酶(BADH的活性有關(guān)McCue等[20]從甜菜的λ10cDNA文庫(kù)中克隆了3個(gè)負(fù)責(zé)編碼BADH的cDNA,發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與菠菜的BADH具有83%的同源性。BADH和CMO等基因已應(yīng)用到耐鹽植物基因工程研究中。2.2.2與離子區(qū)域化相關(guān)的基因液泡膜上的Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接參與了Na+在液泡中的積累。王子寧等[15]以水稻Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA為探針,從小麥鹽脅迫的cDNA文庫(kù)中篩選和克隆了2個(gè)Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,分別命名為TaNHX1和TaNHX2。這2個(gè)基因與已知的水稻、擬南芥和濱藜中的同類基因NHX的相似性約為70%。RT2PCR分析表明,小麥苗經(jīng)400mmol/L的NaCl處理1h后TaNHX1基因的轉(zhuǎn)錄水平有所提高。Shi等[11]從擬南芥中克隆了1個(gè)Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SOS1,并證明SOS1基因是Na+和K+在液泡中富集所必需的,與植物耐鹽性直接相關(guān)。SOS1基因所編碼的蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域與已知的真核生物和細(xì)菌的該基因具有顯著的同源性。Apes等[21]將1個(gè)編碼液泡膜Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因轉(zhuǎn)入擬南芥,證明其耐鹽性顯著增強(qiáng),可在含鹽量為200mmol/L的NaCl土壤中生長(zhǎng)。此外,還有其他關(guān)于Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的報(bào)道,目前大家一致認(rèn)為Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)﹄x子的區(qū)域化具有重要作用。2.2.3保護(hù)酶基因保護(hù)酶(尤其是SOD是人們研究在1989年就已經(jīng)獲得了,SOD基因,包括Fe2/SOD基因既有單拷,線粒體和葉綠體中的SOD是在核內(nèi)合成后再分泌到細(xì)胞器中的。多數(shù)SOD基因的表達(dá)都具有組織特異性,并受許多環(huán)境因素的影響。趙風(fēng)云等[22]的研究表明,水稻的Mn2SOD基因(sodA1可由ABA、干旱、鹽脅迫誘導(dǎo),而Fe2SOD基因則由ABA誘導(dǎo),質(zhì)體的Cu/Zn2SOD基因(sodCp由鹽脅迫在光下誘導(dǎo)而黑暗條件下則不誘導(dǎo)。這些現(xiàn)象說(shuō)明不同的SOD基因表達(dá)受不同的因素誘導(dǎo),因此僅轉(zhuǎn)入1個(gè)或1種類型的SOD基因難以提高植物的耐鹽能力。3轉(zhuǎn)基因耐鹽植物研究進(jìn)展盡管人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并克隆了許多與耐鹽相關(guān)的基因,但僅有少量基因被用于轉(zhuǎn)化工作。近年來(lái)獲得的主要轉(zhuǎn)耐鹽相關(guān)基因植物見表2。表2近年獲得的主要轉(zhuǎn)耐鹽相關(guān)基因(或轉(zhuǎn)錄因子植物Table2Recenttransgenicplantsforsalttolerance基因轉(zhuǎn)入植物轉(zhuǎn)基因植物的表現(xiàn)資料來(lái)源BADH小麥、煙草抗?jié)B透耐鹽、耐旱能力明顯提高劉鳳華等[23]mtlD/gutD水稻耐鹽能力較轉(zhuǎn)它們的單基因植物明顯增強(qiáng)劉俊君等[24]P5CS水稻幼苗抗鹽能力顯著增強(qiáng)蘇金等[25]gutD玉米具有較高的耐鹽性,可在1.75%NaCl培養(yǎng)基上生長(zhǎng)劉巖等[26]SOD紫花苜蓿顯著提高植物的耐鹽性Apes等[21]NHXVP1煙草抗性提高,可在鹽脅迫條件下生長(zhǎng)趙風(fēng)云等[22]AtNHX1擬南芥基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在根、嫩枝、花中的含量提高M(jìn)cKersie等[27]AhproTi擬南芥可耐受200mmol/LNaCl,并可持續(xù)生長(zhǎng)申義國(guó)等[9]DsALDP煙草在100～200mmol/LNaCl下仍保持醛縮酶活性張曉寧等[17]SOS1水稻顯著提高耐鹽性O(shè)hta等[28]Apx大麥顯著提高耐鹽性Ishitani[29]72中國(guó)生物工程雜志ChinaBiotechnologyVol.25No.82005目前獲得的一些轉(zhuǎn)基因植物耐鹽性雖有提高,但這只是相對(duì)于對(duì)照植株而言的,轉(zhuǎn)入均是單個(gè)基因或相關(guān)的兩個(gè)基因,并沒有得到生產(chǎn)大田能利用的抗鹽植株。目前比較一致的觀點(diǎn)是:植物的耐鹽性是多種生理性狀的綜合表現(xiàn),是由位于不同染色體上的多個(gè)基因控制的,因此培育有實(shí)踐意義的轉(zhuǎn)基因植物可能需要同時(shí)轉(zhuǎn)入多個(gè)基因。3.1導(dǎo)入編碼產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的酶基因劉鳳華等[23]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將BADH基因?qū)氩葺蜔煵葜蝎@得轉(zhuǎn)基因植株,鑒定表明:轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性較對(duì)照明顯提高,并利用PCR檢測(cè)證明耐鹽性的提高是由于外源BADH表達(dá)的結(jié)果。蘇金等[25]獲得的轉(zhuǎn)基因水稻提高了脯氨酸水平,秧苗對(duì)100～150mmol/LNaCl具有一定的抗性。除脯氨酸和甘氨酸甜菜堿外,其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),如甘露醇和山梨醇合成的關(guān)鍵酶12磷酸甘露醇脫氫酶(mtlD和62磷(]等[26]將這2,分別獲得在1.75%NaCl培養(yǎng)基中有一定耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因植株。3.2導(dǎo)入與離子區(qū)域化效應(yīng)有關(guān)的基因Ohta等[28]將Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)入水稻,在水稻中超表達(dá)該基因,發(fā)現(xiàn)其木質(zhì)部蒸騰流中Na+的含量明顯降低,植物的耐鹽性增強(qiáng),顯示可以通過(guò)限制Na+在植物細(xì)胞中的積累來(lái)提高植物的耐鹽性。趙風(fēng)云等[22]從SuaedaSalsa中克隆到Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,并證明該基因?qū)χ参锏哪望}性至關(guān)重要。Apes等[21]將一編碼液泡Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)入擬南芥使其超表達(dá),結(jié)果表明,該轉(zhuǎn)基因植株能夠在NaCl含量為200mmol/L的土壤中生長(zhǎng)發(fā)育,比對(duì)照耐鹽性顯著提高,可見轉(zhuǎn)入與離子區(qū)域化效應(yīng)有關(guān)的基因可顯著提高植物的耐鹽性。4導(dǎo)入耐鹽植物的總DNA將耐鹽植物的總DNA直接導(dǎo)入大田作物來(lái)提高其耐鹽性也是近幾年來(lái)遺傳工程研究中的一個(gè)重要方面。林棲鳳等[30]利用花粉管通道技術(shù),將海岸耐鹽植物紅樹的DNA導(dǎo)入茄子,獲得的轉(zhuǎn)化后代已在海灘上試種,可以用含鹽量2.5%的海水澆灌,約90%的植株能開花結(jié)果,完成生長(zhǎng)周期,并對(duì)其在鹽脅迫下的生長(zhǎng)情況、蒸騰速率、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性以及葉片氣孔的電鏡觀察等進(jìn)行了研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,導(dǎo)入紅樹DNA培育的茄子耐鹽能力明顯增強(qiáng),已繁殖到第三代,而對(duì)照植株幾乎全部死亡。綜上所述,盡管不同的研究者從諸多方面對(duì)植物的耐鹽機(jī)理作了大量的研究,并已達(dá)到了一定的廣度和深度,但由于植物耐鹽性是一個(gè)受多基因控制的復(fù)雜的數(shù)量性狀,它受植物種類、品種基因型和內(nèi)部生理生化反應(yīng)的影響,離實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用還有相當(dāng)大的距離。我們雖然了解了一些鹽脅迫條件下作物的反應(yīng)變化,但我們卻不能確定哪一種反應(yīng)是主要的,利用的可能性有多大,產(chǎn)生的耐鹽效應(yīng)有多大。在轉(zhuǎn)基因植物方面,雖然得到了一些轉(zhuǎn)基因植物,但如何協(xié)調(diào)好外源基因與內(nèi)源基因的關(guān)系,控制好基因表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量,避免對(duì)作物的消極影響等問題還有待進(jìn)一步研究。,。參考文獻(xiàn)[1]LevittJ.ResponseofPlantstoEnvironmentalStress(VolII.2nded.NewYork:AcademicPress,1980.102～106[2]趙可夫,李法曾.中國(guó)鹽生植物.北京:科學(xué)出版社,1999.191～200ZhaoKF,LiFZ.HalophyteinChina.Beijing:SciencePress,1999.191～200[3]FlowersTJ,HarveyDMR.Ionsrelationofsalttolerance.AustralianJournalofPlantPhysiology,1997,24:89～91[4]張福鎖.植物營(yíng)養(yǎng)生態(tài)生理學(xué)和遺傳學(xué).北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,1993.206～230ZhangFS.PlantNutritionEcophysiologyandGenetics.Beijing:ChinaScienceandTechnologyPress,1993.206～230[5]王寶山,趙可夫,鄒奇.作物耐鹽機(jī)理研究進(jìn)展及提高作物耐鹽性的對(duì)策.植物學(xué)通報(bào),1997,33(6:423～426WangBSH,ZhaoKF,ZouQ.ChineseBulletinofBotany,1997,33(6:423～426[6]NiuXM,ZhuJK,NarasimhanML,etal.PlasmamembraneH+2ATPasegeneexpressionisregulatedbyNaClincellofthehalophyteAtriplexnummalariaL.Planta,1993,190:433～438[7]DopontFM.Salt2inducedchangesiniontransport:regulationofprimarypumpsandsecondarytransporters.In:ClarksonDTed.TransportandReceptorProteinsofPlantMembranes.NewYork:PlenumPress,1992.91～100[8]MicheletB,BoutryM.TheplasmamembraneH+2ATPaseahighlyregulatedenzymewithmultiplephysiologicalfunctions.PlantPhysiol,1995,108:1～6[9]申義國(guó),閆冬青,張萬(wàn)科,等.榆錢菠菜脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及轉(zhuǎn)擬南芥的耐鹽性.植物學(xué)報(bào),2002,44(8:956～962ShenYG,YanDQ,ZhangWK,etal.ActaBotanicaSinica,2002,44(8:956～962[10]DelauneyAJ,VermaDPS.AsoybeangeneencodingΔ12pyrroline2s2carboxylatereductasewasisolatedbyfunctional822005,25(8崔潤(rùn)麗等:植物耐鹽相關(guān)基因克隆與轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展complementationinE.coliandisfoundtobeosmoregulated.MolGenGendt,1990,221:299～305[11]ShiH,IshitaniM,KimC,etal.TheArabidopsisthalianasalttolerancegeneSOS1encodesaputativeNa+/H+antiporter.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(12:6896～6901[12]LarimerFW,ChainP.CompletegenomesequenceofthemetabolicallyversatilephotosyntheticbacteriumRhodopseduomonaspalustris.NatBiotechnol,2004,22(1:55～61[13]馬常樂,王萍萍,曹子誼,等.鹽地堿蓬A(yù)PX基因的克隆及鹽脅迫下的表達(dá).植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),2002,28(4:261～266MaCHL,WangPP,CaoZY,etal.JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,2002,28(4:261～266[14]HuangJ,MullapudiN.FirstglimpseintothepatternandscaleofgenetransferintheApicomplexa.IntJParasitol,2004,34(3:265～274[15]王子寧,張勁松,郭北海,等1小麥Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆和特性.植物學(xué)報(bào),2002,44(10:12