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文檔簡介

實(shí)驗(yàn)五小鼠脾單個核細(xì)胞的分離

—密度梯度離心法

原理：

根據(jù)物理學(xué)顆粒沉降原理，不同密度的顆粒在其沉降運(yùn)動中可因其比重的差別而處于不同的分布位置。利用此原理可設(shè)計(jì)一定比重的液體界面，將小鼠脾臟中各種不同比重的細(xì)胞通過離心沉降而達(dá)到使其彼此分離的目的。原理：

已知小鼠淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重為1.088左右，而紅細(xì)胞與粒細(xì)胞的比重均大于1.088。因此，若用比重為1.088±0.001的分離液則可通過密度梯度離心方法，在分離液界面上收集得到脾單個核細(xì)胞。操作步驟：離心后的樣本各成份在試管中的分布位置如下圖：1.0881.088操作步驟：加入足量生理鹽水，用滴管輕輕上下混勻，然后1000rpm離心10min，棄去上清液，將沉淀細(xì)胞充分搖勻，然后用生理鹽水再離心洗滌1次，棄去上清液后充分搖勻沉淀細(xì)胞。用生理鹽水稀釋沉淀細(xì)胞至0.3ml（約加6滴），混勻。取細(xì)胞懸液一滴加入等量白細(xì)胞稀釋液于另一試管中充分混勻，用計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算出淋巴細(xì)胞濃度（個/ml）。檢查細(xì)胞活力：取細(xì)胞懸液一滴，加入等量錐蘭溶液于另一試管中，充分混勻后立即滴一滴細(xì)胞懸液于載玻片上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)100~200個淋巴細(xì)胞中著色的死細(xì)胞數(shù)。操作注意事項(xiàng)注意分離液與稀釋血的比例，一般以1:2~1:3為宜。分離時所取的離心速度與時間，因各臺離心機(jī)的離心半徑而異，需事先通過預(yù)試驗(yàn)決定。加入稀釋血時應(yīng)十分小心，注意保護(hù)試管內(nèi)的界面，勿使混淆影響分離效果。做細(xì)胞活力檢查時，錐蘭染色后應(yīng)盡快計(jì)數(shù)完畢，時

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