原生質體培養(yǎng)方法課件

原生質體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)固-液體雙層培養(yǎng)固體平板培養(yǎng)瓊脂糖珠培養(yǎng)原生質體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)固-液體雙層培養(yǎng)固體平板培養(yǎng)瓊脂1

液體淺層培養(yǎng):Liquidthinlayerculture將含有原生質體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進行培養(yǎng)優(yōu)點：操作簡單，對原生質體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉移培養(yǎng)物缺點：原生質體分布不均勻，常發(fā)生原生質體粘連現(xiàn)象而影響其進一步生長和發(fā)育；難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情況；一旦污染，全皿報廢液體淺層培養(yǎng):Liquidthinlayercult2

固體平板培養(yǎng):Solidculture固體培養(yǎng)也就是瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點瓊脂糖可在30C左右融化與原生質體混合而不影響原生質體的生命活動?；旌虾蟮暮性|體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進行培養(yǎng)優(yōu)點：可以跟蹤觀察單個原生質體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計原生質體分裂頻率缺點：操作要求嚴格，尤其是混合時的溫度掌握必須合適，溫度偏高則影響原生質體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質體不易混合均勻固體平板培養(yǎng):Solidculture3

液體－固體雙層培養(yǎng):Liquidsolidculture即在培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面優(yōu)點：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產生的一些有害物質，促進原生質體的分裂和細胞團的形成缺點：不易觀察細胞的發(fā)育過程液體－固體雙層培養(yǎng):Liquidsolidcultur4Semi-permeablemembraneonsolidmediumSemi-permeablemembraneonsol5Semi-permeablemembraneenhancesembryoregenerationincitrusprotoplastcultureSemi-permeablemembraneenhanc6

瓊脂糖珠培養(yǎng):Agarosebeadculture將含有原生質體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50l一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉培養(yǎng)(Thompson等，1986)。培養(yǎng)過程中，通過調整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進一步的生長和發(fā)育。這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進了原生質體的分裂和細胞團的形成瓊脂糖珠培養(yǎng):Agarosebeadculture7原生質體發(fā)育與植株再生細胞壁再生細胞分裂與生長愈傷組織形成植株再生原生質體發(fā)育與植株再生細胞壁再生細胞分裂與生長愈傷組織形成植81.細胞壁再生原生質體培養(yǎng)數小時后開始再生新的細胞壁，一至數天內便可形成完整細胞壁新合成的細胞壁可用0.1％熒光增白劑（Calcofluor）染色后在熒光顯微鏡下觀察，可見到綠色熒光圍繞細胞表面，證明細胞壁已形成。也可用高滲溶液產生質壁分離的方法、電子顯微鏡觀察技術和冰凍蝕刻法等進行再生細胞壁的研究原生質體培養(yǎng)數小時后新壁開始形成，先是質膜合成形成細胞壁主要成分的微纖維，然后轉移到質膜表面進行聚合作用產生多片層的結構，之后在質膜與片層結構之間或在膜上產生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團，最后形成完整的細胞壁只有能形成完好細胞壁的再生細胞才能進入細胞分裂階段1.細胞壁再生92.細胞分裂和生長原生質體培養(yǎng)數天后，胞質增加，細胞器增殖，RNA、蛋白質及多聚糖合成增加，不久即可發(fā)生核的有絲分裂及胞質分裂原生質體一般培養(yǎng)2～7d開始第1次分裂，但第1次分裂的時間隨植物種類、分離原生質體的材料、原生質體質量、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件而異用幼苗下胚軸和子葉、幼根、懸浮培養(yǎng)的細胞、未成熟種子的子葉等分離原生質體，一般比用葉肉分離原生質體容易誘導分裂，第一次分裂出現(xiàn)的時間較快2.細胞分裂和生長103.愈傷組織形成

1）多數情況下，原生質體培養(yǎng)2周后，可形成多細胞團，3周后形成肉眼可見的小細胞團，5-6周后形成直徑1mm的小愈傷組織2）原生質體培養(yǎng)15-20天后，需要及時添加新鮮培養(yǎng)基，同時降低滲透壓，否則細胞團不會繼續(xù)生長。待小愈傷組織長至1-2mm時，應及時轉移至固體培養(yǎng)基使其進一步生長3.愈傷組織形成114.植株再生原生質體培養(yǎng)再生的愈傷組織可直接轉移到分化培養(yǎng)基，一步成苗（器官發(fā)生）。愈傷組織也可通過體細胞胚發(fā)生，先形成胚狀體，再誘導生芽、生根。不同植物種屬，其再生方式不同4.植株再生12仙客來原生質體的再生仙客來原生質體的再生13香蕉原生質體再生—Assani等2006看護培養(yǎng)香蕉原生質體再生—Assani等2006看護培養(yǎng)14Sugarbeet（糖甜菜）callusandprotoplastregenerationSugarbeet（糖甜菜）callusandprot15影響原生質體培養(yǎng)的主要因素

基因型番茄與秘魯番茄有性雜交后性狀分離的遺傳分析表明，其愈傷組織再生能力受2個顯性基因決定(Koornneef等1987)。Cheng和Veilleux(1991)對芙薯(S.phureja)原生質體培養(yǎng)能力進行遺傳分析，證明從原生質體培養(yǎng)到形成愈傷組織受2個獨立位點的顯性基因控制(Cheng等1991)Dudits等（1991）以苜蓿不同基因型深入研究，表明某個基因型在離體培養(yǎng)時難以形成體細胞胚。若將對激素調節(jié)有作用的發(fā)根農桿菌rolB和rolC基因引入并表達，可能促使其體細胞胚形成影響原生質體培養(yǎng)的主要因素

基因型16原生質體來源

供體材料類型：向日葵幼葉、子葉和下胚軸原生質體培養(yǎng)，只有下胚軸原生質體培養(yǎng)得到了細胞團和體細胞胚，而幼葉和子葉原生質體均未獲得成功供體細胞的分化程度：同一個基因型的植株生長在不同的環(huán)境條件下，其生理狀態(tài)會有改變。供試植株最好生長在控制條件下，以提高原生質體的細胞分裂頻率和再生能力，并且可提高實驗重復性

柑橘：葉肉原生質體無論單獨培養(yǎng)還是共培養(yǎng)均不能再生，只有胚性愈傷組織來源的原生質體才能再生原生質體來源17

起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基起始培養(yǎng)密度：適宜密度為1-5×105/ml

培養(yǎng)基激素水平：柑橘不添加外源激素，也可再生培養(yǎng)基營養(yǎng)成分完全性：越豐富越好

起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基18Protoplastdensitycounting25格×16格（0.1mm3）的血球計數板計算公式：原生質體細胞數/ml=80小格（左上、右上、左下、右下、中5個中格）內原生質體細胞個數/80×400×104×稀釋倍數1ml=1cm3=1000mm3Protoplastdensitycounting25格19三、原生質體再生植株遺傳及變異染色體變異植株性狀變異三、原生質體再生植株遺傳及變異染色體變異植株性狀變異20染色體變異染色體倍性變異是原生質體再生植株的常見變異類型原生質體再生植株的倍性與分離原生質體的起始材料有關由莖尖、葉肉和胚性組織細胞分離的原生質體能較好保持原來的倍性用懸浮培養(yǎng)細胞，特別是長期繼代培養(yǎng)的細胞系分離的原生質體，較易出現(xiàn)染色體倍性及數目的變化Grosser等（1984）報道，由三葉草葉肉原生質體再生的植株為二倍體（2n=16），而由培養(yǎng)細胞分離的原生質體再生的植株為四倍體（2n=32）原生質體再生植株變異還與植物種類有關：馬鈴薯易變，柑橘不易變染色體變異染色體倍性變異是原生質體再生植株的常見變異類型21植株表型變異與育種原生質體再生植株表型變異：包括植物學性狀、抗性變異、育性/果實無核、成熟期等變異程度的大小與起始材料及培養(yǎng)過程中產生的變異有關原生質體再生植株變異可為體細胞遺傳學研究和品種改良提供有益的材料從原生質體培養(yǎng)再生植株已選育一些新品種（體細胞突變育種）植株表型變異與育種原生質體再生植株表型變異：包括植物學性狀、22原生質體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)固-液體雙層培養(yǎng)固體平板培養(yǎng)瓊脂糖珠培養(yǎng)原生質體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)固-液體雙層培養(yǎng)固體平板培養(yǎng)瓊脂23

液體淺層培養(yǎng):Liquidthinlayerculture將含有原生質體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進行培養(yǎng)優(yōu)點：操作簡單，對原生質體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉移培養(yǎng)物缺點：原生質體分布不均勻，常發(fā)生原生質體粘連現(xiàn)象而影響其進一步生長和發(fā)育；難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情況；一旦污染，全皿報廢液體淺層培養(yǎng):Liquidthinlayercult24

固體平板培養(yǎng):Solidculture固體培養(yǎng)也就是瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點瓊脂糖可在30C左右融化與原生質體混合而不影響原生質體的生命活動?；旌虾蟮暮性|體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進行培養(yǎng)優(yōu)點：可以跟蹤觀察單個原生質體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計原生質體分裂頻率缺點：操作要求嚴格，尤其是混合時的溫度掌握必須合適，溫度偏高則影響原生質體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質體不易混合均勻固體平板培養(yǎng):Solidculture25

液體－固體雙層培養(yǎng):Liquidsolidculture即在培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面優(yōu)點：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產生的一些有害物質，促進原生質體的分裂和細胞團的形成缺點：不易觀察細胞的發(fā)育過程液體－固體雙層培養(yǎng):Liquidsolidcultur26Semi-permeablemembraneonsolidmediumSemi-permeablemembraneonsol27Semi-permeablemembraneenhancesembryoregenerationincitrusprotoplastcultureSemi-permeablemembraneenhanc28

瓊脂糖珠培養(yǎng):Agarosebeadculture將含有原生質體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50l一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉培養(yǎng)(Thompson等，1986)。培養(yǎng)過程中，通過調整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進一步的生長和發(fā)育。這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進了原生質體的分裂和細胞團的形成瓊脂糖珠培養(yǎng):Agarosebeadculture29原生質體發(fā)育與植株再生細胞壁再生細胞分裂與生長愈傷組織形成植株再生原生質體發(fā)育與植株再生細胞壁再生細胞分裂與生長愈傷組織形成植301.細胞壁再生原生質體培養(yǎng)數小時后開始再生新的細胞壁，一至數天內便可形成完整細胞壁新合成的細胞壁可用0.1％熒光增白劑（Calcofluor）染色后在熒光顯微鏡下觀察，可見到綠色熒光圍繞細胞表面，證明細胞壁已形成。也可用高滲溶液產生質壁分離的方法、電子顯微鏡觀察技術和冰凍蝕刻法等進行再生細胞壁的研究原生質體培養(yǎng)數小時后新壁開始形成，先是質膜合成形成細胞壁主要成分的微纖維，然后轉移到質膜表面進行聚合作用產生多片層的結構，之后在質膜與片層結構之間或在膜上產生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團，最后形成完整的細胞壁只有能形成完好細胞壁的再生細胞才能進入細胞分裂階段1.細胞壁再生312.細胞分裂和生長原生質體培養(yǎng)數天后，胞質增加，細胞器增殖，RNA、蛋白質及多聚糖合成增加，不久即可發(fā)生核的有絲分裂及胞質分裂原生質體一般培養(yǎng)2～7d開始第1次分裂，但第1次分裂的時間隨植物種類、分離原生質體的材料、原生質體質量、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件而異用幼苗下胚軸和子葉、幼根、懸浮培養(yǎng)的細胞、未成熟種子的子葉等分離原生質體，一般比用葉肉分離原生質體容易誘導分裂，第一次分裂出現(xiàn)的時間較快2.細胞分裂和生長323.愈傷組織形成

1）多數情況下，原生質體培養(yǎng)2周后，可形成多細胞團，3周后形成肉眼可見的小細胞團，5-6周后形成直徑1mm的小愈傷組織2）原生質體培養(yǎng)15-20天后，需要及時添加新鮮培養(yǎng)基，同時降低滲透壓，否則細胞團不會繼續(xù)生長。待小愈傷組織長至1-2mm時，應及時轉移至固體培養(yǎng)基使其進一步生長3.愈傷組織形成334.植株再生原生質體培養(yǎng)再生的愈傷組織可直接轉移到分化培養(yǎng)基，一步成苗（器官發(fā)生）。愈傷組織也可通過體細胞胚發(fā)生，先形成胚狀體，再誘導生芽、生根。不同植物種屬，其再生方式不同4.植株再生34仙客來原生質體的再生仙客來原生質體的再生35香蕉原生質體再生—Assani等2006看護培養(yǎng)香蕉原生質體再生—Assani等2006看護培養(yǎng)36Sugarbeet（糖甜菜）callusandprotoplastregenerationSugarbeet（糖甜菜）callusandprot37影響原生質體培養(yǎng)的主要因素

基因型番茄與秘魯番茄有性雜交后性狀分離的遺傳分析表明，其愈傷組織再生能力受2個顯性基因決定(Koornneef等1987)。Cheng和Veilleux(1991)對芙薯(S.phureja)原生質體培養(yǎng)能力進行遺傳分析，證明從原生質體培養(yǎng)到形成愈傷組織受2個獨立位點的顯性基因控制(Cheng等1991)Dudits等（1991）以苜蓿不同基因型深入研究，表明某個基因型在離體培養(yǎng)時難以形成體細胞胚。若將對激素調節(jié)有作用的發(fā)根農桿菌rolB和rolC基因引入并表達，可能促使其體細胞胚形成影響原生質體培養(yǎng)的主要因素

基因型38原生質體來源

供體材料類型：向日葵幼葉、子葉和下胚軸原生質體培養(yǎng)，只有下胚軸原生質體培養(yǎng)得到了細胞團和體細胞胚，而幼葉和子葉原生質體均未獲得成功供體細胞的分化程度：同一個基因型的植株生長在不同的環(huán)境條件下，其生理狀態(tài)會有改變。供試植株最好生長在控制條件下，以提高原生質體的細胞分裂頻率和再生能力，并且可提高實驗重復性

柑橘：葉肉原生質體無論單獨培養(yǎng)還是共培養(yǎng)均不能再生，只有胚性愈傷組織來源的原生質體才能再生原生質體來源39

起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基起始培養(yǎng)密度：適宜密度為1-5×105/ml

培養(yǎng)基激素水平：柑橘不添加外源激素，也可再生培養(yǎng)基營養(yǎng)成分完全性：越豐富越好

起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基40Pr