抗原抗體反應(yīng)課件

臨床免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用

2008-3-31臨床免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用1Immunologictechnique/appliance

Classicalantigenandantibodyreaction(抗原抗體反應(yīng))Immunoassay(IA){(免疫測(cè)定)Immunolabelingtechnique(標(biāo)記免疫技術(shù))Immunologictechnique/applianc2一、Classicalantigen

andantibodyreaction一、Classicalantigen

a3AntigenandAntibodyreaction

Ag+Ab→Ag-Ab+Ag/AbInvivo(不同免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用)Invitro（抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，多樣性）AntigenandAntibodyreaction4抗原/抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：

特異性（specific）最適比（optimalratio）可逆性（reversible）親和性（afinity）和親和力（avidity）抗原/抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：5抗原/抗體反應(yīng)分兩階段（一）抗原/抗體發(fā)生特異性結(jié)合1、親水膠體轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷z體（水化層）2、抗原抗體的結(jié)合力（靜電引力、范登華引力、氫鍵結(jié)合力、疏水結(jié)合力等）（二）抗原/抗體結(jié)合的可見反應(yīng)1、凝集～2、沉淀～3、溶細(xì)胞～4、等等

抗原/抗體反應(yīng)分兩階段6Invitro（classical～）PrecipitationReaction（沉淀反應(yīng)）AgglutinationReaction（凝集反應(yīng)）AntigenandAntibodyReactionInvolvedbyComplement（補(bǔ)體介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)）EtalInvitro（classical～）Precipitat7

PrecipitationReaction

Immunodifusion（免疫擴(kuò)散）Immunoturbidimetry（免疫濁度）Immunoeletrophoresis（免疫電泳）Etal(環(huán)狀～）（絮狀～）

PrecipitationReaction

Immun8抗原抗體反應(yīng)課件9沉淀反應(yīng)的類型歸納

環(huán)狀沉淀反應(yīng)液相（液體）{絮狀沉淀反應(yīng)

免疫濁度測(cè)定沉淀反應(yīng){免疫擴(kuò)散固相（凝膠）{

免疫電泳沉淀反應(yīng)的類型歸納10

免疫濁度(turbidimetry)測(cè)定:

含義：是將光學(xué)測(cè)量?jī)x與自動(dòng)分析檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合，應(yīng)用于沉淀反應(yīng)試驗(yàn)。原理：抗原抗體在檢測(cè)反應(yīng)液中會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物，使得反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過剩，形成的復(fù)合物隨樣本中抗原的量增加而增多，反應(yīng)液的濁度亦隨之增高。與系列標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照(標(biāo)準(zhǔn)曲線)，可計(jì)算樣本中被測(cè)抗原的濃度。

免疫濁度(turbidimetry)測(cè)定:

含義：是將11

透射免疫比濁（turbidimetry）免疫比濁測(cè)定儀散射免疫比濁（nephelometry）包括—終點(diǎn)～速率～抗原抗體反應(yīng)課件12

AgglutinationReaction

例:

人類ABO血型檢測(cè)(玻片)肥達(dá)(Widal)反應(yīng){direct～類風(fēng)濕因子測(cè)定(乳膠){indirect～包括-正向反向抗紅細(xì)胞不完全抗體(Coobs)

AgglutinationReaction

例:13補(bǔ)體介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)(complement)例：CH50（complementhemolysis50%)(測(cè)補(bǔ)體）脂質(zhì)體免疫法檢測(cè)補(bǔ)體（測(cè)補(bǔ)體）微量細(xì)胞毒試驗(yàn)（complementdependentcytotoxicity；CDC）（交叉配型）特定蛋白檢測(cè)儀及配套試劑（補(bǔ)體單成分）補(bǔ)體介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)(complement)例：14二、ImmunolabelingTechnique二、ImmunolabelingTechnique15ImmunolabelingTechnique原理：于抗原或抗體上標(biāo)記可以微量檢測(cè)的標(biāo)記物（熒光素、酶或同位素等），待特異性抗原抗體反應(yīng)后，所測(cè)的不必是抗原-抗體復(fù)合物本身，而測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物，并可通過標(biāo)記物的放大作用，進(jìn)一步提高其檢測(cè)的敏感度。ImmunolabelingTechnique原理：于抗原16ImmunolabelingTechniqueEnzymelinkedimmunosorbentassay（ELISA）Fluorescenceimmunoassay（FIA）Radioimmunoassay（RIA）Luminescenceimmune-techniqueSolidphasemembrane-basedimmunoassayBiotin-avidinsystem（BAS）ImmunolabelingTechniqueEnzyme17酶免疫技術(shù)/ELISA酶免疫技術(shù)—是以酶標(biāo)記抗原或抗體作為主要試劑的免疫測(cè)定方法。ELISA—是以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定。酶免疫技術(shù)/ELISA18酶免疫技術(shù)分類（一）酶免疫組織化學(xué)測(cè)定技術(shù)（二）酶免疫測(cè)定技術(shù)Ab*＋Ag→Ab*Ag＋Ab*Ab＋Ag*→AbAg*＋Ag*（1）Homogenous（均相測(cè)定）（2）Hetergenous（異相測(cè)定）——Solidphase（固相）酶免疫技術(shù)分類（一）酶免疫組織化學(xué)測(cè)定技術(shù)19ELISA：ELISA—是以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定。ELISA：ELISA—是以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體反20—抗原/抗體的固相化

（coating，包被）（immunosorbent）(蛋白分子表面效應(yīng))操作：（例）Ag/AbinpH9.6carbonatebufferIncubatedat4℃forovernight—抗原/抗體的固相化操作：（例）Ag/Abinp21表面效應(yīng)：蛋白質(zhì)分子在吸附（包被）過程，為了克服與固相載體之間的排斥力，需要重新分布其表面的功能性基團(tuán)，使疏水性基團(tuán)充分暴露，然后，局部接觸區(qū)域的偶極分子脫氫，再通過范德瓦爾引力將其固相于載體表面。整個(gè)過程謂coating。影響：抗原抗體的構(gòu)象和功能；抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過程。表面效應(yīng)：蛋白質(zhì)分子在吸附（包被）過程，為了克服與固相載22區(qū)別：（1）非共價(jià)吸附抗體或蛋白通過疏水性相互作用而附著（2）共價(jià)吸附借助固相上的活性基團(tuán)，通過化學(xué)交聯(lián)劑與抗原/抗體分子上相應(yīng)活性基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵，固著～

區(qū)別：（1）非共價(jià)吸附23固相載體材料要求：1、結(jié)合容量2、結(jié)合能力3、結(jié)合性質(zhì)4、性價(jià)比種類：1、聚苯乙烯2、聚氯乙烯3、硝酸纖維素膜4、尼龍膜5、磁性微粒孔間差異（<10%）

固相載體材料要求：種類：孔間差異24對(duì)策一、用一定濃度的人IgG（10ng/ml）適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG控制反應(yīng)各條件計(jì)算各孔讀值的平均值并要求每孔的讀值與其平均值間的差異小于10%。二、選擇已知陽性與陰性標(biāo)本，作系列稀釋在不同固相載體上按預(yù)定的ELISA法進(jìn)行操作測(cè)定評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn)：陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大的好對(duì)策一、25Blocking（封閉）Ag/Ab被固相化后，固相載體表面會(huì)留有少量未被吸附的位點(diǎn)（空），反應(yīng)過程中加入的待檢標(biāo)本或酶標(biāo)抗體等可能與之吸附（非特異），導(dǎo)致其檢測(cè)的本底偏高。為避免之，包被后再用BSA或小牛血清包被一次——Blocking。Blocking（封閉）Ag/Ab被固相化后，固相載體表面會(huì)26用于酶免疫測(cè)定的抗原與抗體1、用途：包被與標(biāo)記2、種類：抗原—天然、重組、合成抗體—多克隆、單克隆3、要求：抗原純度高、抗體效價(jià)高、結(jié)合力高（對(duì)照孔）4、適宜工作濃度用于酶免疫測(cè)定的抗原與抗體1、用途：包被與標(biāo)記27抗原性肽段的固相合成以Fmoc-Gly-Wang樹脂為載體，以N-α-Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸為原料，以HBTU/HoBt作為偶聯(lián)試劑，從C-N端順序依次偶聯(lián)所需的氨基酸，直至合成所需的各肽段。然后將肽從樹脂上裂解下來，洗滌，凍干得到短肽。

抗原性肽段的固相合成以Fmoc-Gly-Wang樹脂為載體，28抗原抗體反應(yīng)課件29

間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇

各類血清包被抗原稀釋度1:1001:2001:4001:8001:160強(qiáng)陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.660.05稀釋液0.090.020.020.020.04選擇標(biāo)準(zhǔn)：強(qiáng)陽性參考血清A值為0.8左右,陰性參考血清A值<0.1

間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇

各類血清包被30酶免疫測(cè)定的酶結(jié)合物制備*酶結(jié)合物（conjugate）或稱酶標(biāo)抗體或抗原。一般是通過化學(xué)交聯(lián)(耦聯(lián))或免疫學(xué)反應(yīng)而獲得。適宜標(biāo)記用酶的要求:

①酶活性～②具共價(jià)交聯(lián)能力～③催化底物產(chǎn)有色信號(hào)并易于檢測(cè)～④自身穩(wěn)定,不易受干擾～酶免疫測(cè)定的酶結(jié)合物制備*酶結(jié)合物（conjugate）或稱31免疫測(cè)定技術(shù)常用的酶及其底物(substrate)

酶

底物

顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)辣根過氧化物酶鄰苯二胺橘紅色492四甲基聯(lián)苯胺黃色460氨基水楊酸棕色449鄰聯(lián)苯甲胺蘭色4252,2'-連胺基-2（3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）銨鹽藍(lán)綠色642堿性磷酸酶4-硝基酚磷酸鹽（PNP）黃色400萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽紅色500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黃色405,420葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭深藍(lán)色405,420ＢD-半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷（4MuG）熒光360,450硝基酚半乳糖苷（ONPG）黃色420免疫測(cè)定技術(shù)常用的酶及其底物(substrate)酶32Conjugate的制備1、戊二醛交聯(lián)法（一步/二步）酶-NH2O=C-H酶-N=CH||

+

（CH2)3

——CH3||抗體-NH2O=C-H抗體-N=CH2、過碘酸鈉法

利用過碘酸鈉將酶蛋白分子中與酶活性無關(guān)的多糖分子的羥基氧化——成活潑的醛基+

抗體蛋白游離氨基形成—Schiffs堿而交聯(lián)Conjugate的制備1、戊二醛交聯(lián)法（一步/二步）33Homogenous（均相測(cè)定）

Ab*＋Ag→Ab*Ag＋Ab*Ab＋Ag*→AbAg*＋Ag*Ab*Ag＋Ab*

AbAg*＋Ag*—不需分離，但Ab*/Ag*酶需失活例：enzyme-multipliedimmunoassaytecnique(EMIT,酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù))clonedenzymedonorimmmunoassay(CEDIA)(克隆酶供體免疫測(cè)定)Homogenous（均相測(cè)定）

Ab*＋A34EMIT測(cè)定：檢測(cè)對(duì)象：半抗原試劑：抗體酶標(biāo)記半抗原底物反應(yīng)模式：競(jìng)爭(zhēng)法EMIT測(cè)定：檢測(cè)對(duì)象：半抗原35CEDIA測(cè)定：enzymeacceptor，EA（酶受體）enzymedonor，ED（酶供體）EA、ED游離無酶活性檢測(cè)對(duì)象：藥物、小分子物試劑：抗體、EAED標(biāo)記抗原底物反應(yīng)模式：競(jìng)爭(zhēng)法CEDIA測(cè)定：enzymeacceptor，EA36固相膜免疫吸附測(cè)定固相載體：硝酸纖維素微孔膜標(biāo)記物選擇：有色微粒子（膠體金）反應(yīng)形式：穿流（滲濾）橫流（層析）WesternBlot重組免疫結(jié)合試驗(yàn)（RIBA）應(yīng)用：藥物、激素、抗生素等固相膜免疫吸附測(cè)定固相載體：硝酸纖維素微孔膜37Fluorescenceimmunoassay（FIA）

以熒光素為標(biāo)記物并標(biāo)記抗體/抗原，當(dāng)抗原-抗體特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下可示蹤，實(shí)際工作中普遍使用。由于主要用熒光素標(biāo)記抗體去檢測(cè)相應(yīng)抗原（定位、定量），所以統(tǒng)稱熒光抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）分類：熒光免疫顯微技術(shù)（流式）熒光免疫測(cè)定（非均相/均相）Fluorescenceimmunoassay（FIA）

38熒光（fluorescence）：某些物質(zhì)在光的照射下，吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)返回原基態(tài)時(shí)，以電磁輻射形式放射出所吸收的光能，稱為光致發(fā)光。若用一短波長(zhǎng)光照射某物質(zhì)，該物質(zhì)能發(fā)射較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光，此種光被稱謂熒光。熒光素（fluorchrome）：是指一些具有光致熒光特性的染料物質(zhì)。熒光的淬滅現(xiàn)象：某些理化因素可使得熒光色素的輻射能力減弱或消失的現(xiàn)象。熒光（fluorescence）：39常用的熒光素1、異硫氰基熒光黃（FITC）純品為黃色結(jié)晶粉末，最大吸收光譜490～495mm，最大發(fā)射光譜520～530mm，呈明亮黃綠色熒光。2、四乙基羅丹明（RB200）純品為橘紅色粉末，最大吸收光譜570mm，最大發(fā)射光譜595～600mm，呈明亮橙色熒光。3、四甲基異硫氰基羅丹明（TRITC）羅丹明的衍生物，純品為紫紅色粉末，最大吸收光譜550mm，最大發(fā)射光譜620mm，呈橙紅熒光。常用的熒光素1、異硫氰基熒光黃（FITC）40常用的熒光抗體標(biāo)記方法即熒光素與抗體的結(jié)合熒光素有活潑的化學(xué)基（偶氮基—N=N—）（異氰基—N=C=O）（異硫氰基—N=C=S）抗體蛋白有氨基酸的自由氨基方法：透析~攪拌~結(jié)合物——（熒光素—N-C-N-蛋白質(zhì)）

lllHSH常用的熒光抗體標(biāo)記方法即熒光素與抗體的結(jié)合41熒光免疫測(cè)定（非均相/均相）

時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TR-FIA）（非）熒光免疫測(cè)定（非均相/均相）

時(shí)間分辨4204008001000短壽熒光長(zhǎng)壽熒光延緩時(shí)間計(jì)數(shù)時(shí)間熒光強(qiáng)度時(shí)間us時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定原理示意圖040043時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TR-FIA）原理1、用熒光壽命較長(zhǎng)的稀土金屬（Eu、Tb等）作標(biāo)記物，標(biāo)記抗原或抗體。2、利用時(shí)間分辨熒光分析儀3、延緩測(cè)量時(shí)間，以排除標(biāo)本中的自發(fā)熒光。因?yàn)楹笳叩臒晒鈮勖芏獭?、稀土金屬的激發(fā)光波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)間距大（Stokes移位290nm/一般熒光Stokes移位28nm）5、靈敏度高（0.2～1ng/ml）時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TR-FIA）原理1、用熒光壽命較長(zhǎng)的44熒光免疫測(cè)定（非均相/均相）熒光偏振免疫測(cè)定(FPIA)(均)熒光免疫測(cè)定（非均相/均相）熒光偏振免疫測(cè)定(FPIA)45當(dāng)待測(cè)抗原濃度高時(shí)，經(jīng)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)大部分抗體被其結(jié)合，而熒光素標(biāo)記的抗原多呈游離的小分子狀態(tài)。由于其分子小，測(cè)量到的熒光偏振光較低。反之，待測(cè)抗原濃度低時(shí)，大部分熒光素標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合，形成大分子的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，此時(shí)檢測(cè)到的熒光偏振程度也較高。熒光偏振免疫分析示意圖當(dāng)待測(cè)抗原濃度高時(shí)，經(jīng)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)大部分抗體被其結(jié)合，而熒光素標(biāo)46熒光偏振免疫測(cè)定(FPIA)原理1、熒光物質(zhì)在溶液中被單一平面的偏振光（波長(zhǎng)485nm）照射后，可吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)；當(dāng)其恢復(fù)至基態(tài)時(shí)釋放能量的同時(shí)發(fā)射偏振熒光（波長(zhǎng)525nm）。2、偏振熒光的強(qiáng)度與熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度呈反比。（大分子/慢-強(qiáng)，小分子/快-弱）。3、FPIA主要用于測(cè)定藥物（?。舛取?、當(dāng)藥物與熒光標(biāo)記藥物—競(jìng)爭(zhēng)一定量抗體，結(jié)果標(biāo)本中藥物高，熒光標(biāo)記藥物-抗體形成低，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物含量。（呈反比）熒光偏振免疫測(cè)定(FPIA)原理1、熒光物質(zhì)在溶液中被單47其他標(biāo)記1、放射性核素標(biāo)記物～2、發(fā)光標(biāo)記物～

chemiluminescenceimmunoassay,CLIAluminescenceenzymeimmunoassay,IEIAbioluminescenceimmunoassay,BLIA3、金標(biāo)記物～4、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）～其他標(biāo)記1、放射性核素標(biāo)記物～48Immnogoldlabelingtechnique金標(biāo)記免疫技術(shù)是以膠體金標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體，對(duì)樣本中相應(yīng)抗體或抗原進(jìn)行檢測(cè)。膠體金—一般指金的水溶液，又稱金溶膠。金顆粒直徑在1～100nm之間。其對(duì)電解質(zhì)敏感，水化層破壞顆粒凝聚據(jù)顆粒大小，其呈色性不同。

Immnogoldlabelingtechnique金標(biāo)49

膠體金（ColloidalGold）

15～60nm

膠體金（ColloidalGold）

50膠體金的制備還原法(最常用的化學(xué)方法)原理：在氯化金水溶液中加入一定量的還原劑，使金離子還原為金原子。在適當(dāng)條件下，還原的金原子凝聚成一定大小的金顆粒，形成金溶膠。常用的還原劑：檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等檸檬酸鈉還原制備的金顆粒直徑較大，15～150nm膠體金的制備還原法(最常用的化學(xué)方法)51燒制膠體金步驟:取預(yù)先處理過的三角燒瓶加入沸石與適量雙蒸水220V、煮沸棄去瓶?jī)?nèi)液體，加入雙蒸水，再次煮沸沸騰狀態(tài)下加入適量檸檬酸三鈉15～20秒后加入適量氯金酸2min內(nèi)液體由黑色變?yōu)榘底霞t色75V、微沸冷卻后，520nm下測(cè)OD值OD值在1.0～1.1之間最佳燒制膠體金步驟:取預(yù)先處理過的三角燒瓶加入沸石與適量52注意事項(xiàng):1.玻璃器皿的清潔玻璃器皿清洗→清潔液浸泡24h→流水沖→雙蒸水反復(fù)洗滌→晾干2.試劑配制應(yīng)盡量使用分析純?cè)噭└鞣N水溶液必須用雙蒸水或三蒸水配制3.影響膠體金顆粒大小的因素加入還原劑的速度與加入的量攪拌是否均勻制備膠體金所用的燒瓶大小注意事項(xiàng):1.玻璃器皿的清潔53膠體金結(jié)合物（Conjugate）膠體金結(jié)合物（Conjugate）54免疫膠體金制備1)在膠體金溶液中加入適合比例的抗體（或抗原）2)加適量碳酸鉀，觀察溶液顏色變化（當(dāng)膠體金與待標(biāo)記的蛋白比例合適時(shí)，溶液顏色無變化）。3)用高速離心機(jī)離心并棄去上清液，加入清洗液再次高速離心，棄去上清液，（注：吸取上清液時(shí)不要吸走沉淀物質(zhì)）。4)余下的沉淀物質(zhì)就是綴合后的膠體金，加恢復(fù)液用10ml玻璃針筒、濾器超濾到一定體積（即恢復(fù)濃度）。免疫膠體金制備1)在膠體金溶液中加入適合比例的抗體（或抗原）55膠體金標(biāo)記免疫測(cè)定模式1、斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（dotimmunogoldfiltrationassay，DIGTA）2、斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)（dotimmunochromatographicassay，DICA）膠體金標(biāo)記免疫測(cè)定模式1、斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)56抗原抗體反應(yīng)課件57斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)58抗原抗體反應(yīng)課件59陽性陰性固相膜固相抗原待測(cè)抗體金標(biāo)記抗人IgG抗體人IgG固相抗人IgG抗體IFA（間接）原理圖陽性陰性固相膜固相抗原待測(cè)抗體金標(biāo)記抗人IgG抗體人IgG固60免疫層析層析試驗(yàn)

免疫層析層析試驗(yàn)

61樣品墊結(jié)合物墊NC膜吸水墊ICA試劑條結(jié)構(gòu)示意圖樣結(jié)NC吸ICA試劑條結(jié)構(gòu)示意圖62

ICA雙抗體夾心法測(cè)抗原抗原抗體反應(yīng)課件63

ICA間接法測(cè)抗體ICA間接法測(cè)抗體64ICA結(jié)果觀察陽性陰性無效ICA結(jié)果觀察陽性陰性無效65半定量測(cè)定IFA肌紅蛋白雙孔法

S：測(cè)定孔C：定量質(zhì)控100μg/LIFA微量白蛋白單孔法T：測(cè)定孔C1：定量質(zhì)控30mg/LC2：定量質(zhì)控200mg/L結(jié)果判定：<30（-）、30~100（+）、100~200（++）、>200（+++）mg/LICA甲胎蛋白（AFP）參考值：30μg/L肝癌診斷值：>400μg/L結(jié)果判定：<30（-）、30~200（+）、200~400（++）、>400（+++）μg/LSC測(cè)定線對(duì)照線TC2C1半定量測(cè)定IFAIFAICASC測(cè)對(duì)T66IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個(gè)月室溫一年操作步驟3~51觀察時(shí)間3min3~20min陽性反應(yīng)顏色濃度操作結(jié)束顏色不變顏色逐漸加深I(lǐng)FA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試67Biotin-Avidin/StreptavidinSystemBiotin（維生素H）分子為雙環(huán)狀結(jié)構(gòu)，咪唑酮環(huán)與親和素結(jié)合，噻吩環(huán)上的戊酸側(cè)連與抗體等蛋白分子結(jié)合。Biotin-Avidin/StreptavidinS68Avidin（抗生物素蛋白o(hù)r卵白素）：從卵清蛋白中提取，有4個(gè)相同亞基組成，能結(jié)合4分子biotin。Streptavidin：由鏈霉菌分泌產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物，有4條相同的肽連組成，能結(jié)合4分子biotin。Avidin（抗生物素蛋白o(hù)r卵白素）：從卵清蛋白中提取，有69展望1、標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用提高抗原/抗體檢測(cè)的靈敏度，尤其對(duì)小分子抗原（藥物、激素）2、隨著標(biāo)記免疫分析的發(fā)展，自動(dòng)化檢測(cè)分析手段隨之改進(jìn)，達(dá)到規(guī)范、靈敏、精確、批量及快速的目標(biāo)。3、推動(dòng)交叉學(xué)科的協(xié)作與發(fā)展。展望1、標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用提高抗原/抗體檢測(cè)的靈敏度，尤其對(duì)小分70

謝謝

71臨床免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用

2008-3-31臨床免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用72Immunologictechnique/appliance

Classicalantigenandantibodyreaction(抗原抗體反應(yīng))Immunoassay(IA){(免疫測(cè)定)Immunolabelingtechnique(標(biāo)記免疫技術(shù))Immunologictechnique/applianc73一、Classicalantigen

andantibodyreaction一、Classicalantigen

a74AntigenandAntibodyreaction

Ag+Ab→Ag-Ab+Ag/AbInvivo(不同免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用)Invitro（抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，多樣性）AntigenandAntibodyreaction75抗原/抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：

特異性（specific）最適比（optimalratio）可逆性（reversible）親和性（afinity）和親和力（avidity）抗原/抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：76抗原/抗體反應(yīng)分兩階段（一）抗原/抗體發(fā)生特異性結(jié)合1、親水膠體轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷z體（水化層）2、抗原抗體的結(jié)合力（靜電引力、范登華引力、氫鍵結(jié)合力、疏水結(jié)合力等）（二）抗原/抗體結(jié)合的可見反應(yīng)1、凝集～2、沉淀～3、溶細(xì)胞～4、等等

抗原/抗體反應(yīng)分兩階段77Invitro（classical～）PrecipitationReaction（沉淀反應(yīng)）AgglutinationReaction（凝集反應(yīng)）AntigenandAntibodyReactionInvolvedbyComplement（補(bǔ)體介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)）EtalInvitro（classical～）Precipitat78

PrecipitationReaction

Immunodifusion（免疫擴(kuò)散）Immunoturbidimetry（免疫濁度）Immunoeletrophoresis（免疫電泳）Etal(環(huán)狀～）（絮狀～）

PrecipitationReaction

Immun79抗原抗體反應(yīng)課件80沉淀反應(yīng)的類型歸納

環(huán)狀沉淀反應(yīng)液相（液體）{絮狀沉淀反應(yīng)

免疫濁度測(cè)定沉淀反應(yīng){免疫擴(kuò)散固相（凝膠）{

免疫電泳沉淀反應(yīng)的類型歸納81

免疫濁度(turbidimetry)測(cè)定:

含義：是將光學(xué)測(cè)量?jī)x與自動(dòng)分析檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合，應(yīng)用于沉淀反應(yīng)試驗(yàn)。原理：抗原抗體在檢測(cè)反應(yīng)液中會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物，使得反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過剩，形成的復(fù)合物隨樣本中抗原的量增加而增多，反應(yīng)液的濁度亦隨之增高。與系列標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照(標(biāo)準(zhǔn)曲線)，可計(jì)算樣本中被測(cè)抗原的濃度。

免疫濁度(turbidimetry)測(cè)定:

含義：是將82

透射免疫比濁（turbidimetry）免疫比濁測(cè)定儀散射免疫比濁（nephelometry）包括—終點(diǎn)～速率～抗原抗體反應(yīng)課件83

AgglutinationReaction

例:

人類ABO血型檢測(cè)(玻片)肥達(dá)(Widal)反應(yīng){direct～類風(fēng)濕因子測(cè)定(乳膠){indirect～包括-正向反向抗紅細(xì)胞不完全抗體(Coobs)

AgglutinationReaction

例:84補(bǔ)體介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)(complement)例：CH50（complementhemolysis50%)(測(cè)補(bǔ)體）脂質(zhì)體免疫法檢測(cè)補(bǔ)體（測(cè)補(bǔ)體）微量細(xì)胞毒試驗(yàn)（complementdependentcytotoxicity；CDC）（交叉配型）特定蛋白檢測(cè)儀及配套試劑（補(bǔ)體單成分）補(bǔ)體介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)(complement)例：85二、ImmunolabelingTechnique二、ImmunolabelingTechnique86ImmunolabelingTechnique原理：于抗原或抗體上標(biāo)記可以微量檢測(cè)的標(biāo)記物（熒光素、酶或同位素等），待特異性抗原抗體反應(yīng)后，所測(cè)的不必是抗原-抗體復(fù)合物本身，而測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物，并可通過標(biāo)記物的放大作用，進(jìn)一步提高其檢測(cè)的敏感度。ImmunolabelingTechnique原理：于抗原87ImmunolabelingTechniqueEnzymelinkedimmunosorbentassay（ELISA）Fluorescenceimmunoassay（FIA）Radioimmunoassay（RIA）Luminescenceimmune-techniqueSolidphasemembrane-basedimmunoassayBiotin-avidinsystem（BAS）ImmunolabelingTechniqueEnzyme88酶免疫技術(shù)/ELISA酶免疫技術(shù)—是以酶標(biāo)記抗原或抗體作為主要試劑的免疫測(cè)定方法。ELISA—是以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定。酶免疫技術(shù)/ELISA89酶免疫技術(shù)分類（一）酶免疫組織化學(xué)測(cè)定技術(shù)（二）酶免疫測(cè)定技術(shù)Ab*＋Ag→Ab*Ag＋Ab*Ab＋Ag*→AbAg*＋Ag*（1）Homogenous（均相測(cè)定）（2）Hetergenous（異相測(cè)定）——Solidphase（固相）酶免疫技術(shù)分類（一）酶免疫組織化學(xué)測(cè)定技術(shù)90ELISA：ELISA—是以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定。ELISA：ELISA—是以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體反91—抗原/抗體的固相化

（coating，包被）（immunosorbent）(蛋白分子表面效應(yīng))操作：（例）Ag/AbinpH9.6carbonatebufferIncubatedat4℃forovernight—抗原/抗體的固相化操作：（例）Ag/Abinp92表面效應(yīng)：蛋白質(zhì)分子在吸附（包被）過程，為了克服與固相載體之間的排斥力，需要重新分布其表面的功能性基團(tuán)，使疏水性基團(tuán)充分暴露，然后，局部接觸區(qū)域的偶極分子脫氫，再通過范德瓦爾引力將其固相于載體表面。整個(gè)過程謂coating。影響：抗原抗體的構(gòu)象和功能；抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過程。表面效應(yīng)：蛋白質(zhì)分子在吸附（包被）過程，為了克服與固相載93區(qū)別：（1）非共價(jià)吸附抗體或蛋白通過疏水性相互作用而附著（2）共價(jià)吸附借助固相上的活性基團(tuán)，通過化學(xué)交聯(lián)劑與抗原/抗體分子上相應(yīng)活性基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵，固著～

區(qū)別：（1）非共價(jià)吸附94固相載體材料要求：1、結(jié)合容量2、結(jié)合能力3、結(jié)合性質(zhì)4、性價(jià)比種類：1、聚苯乙烯2、聚氯乙烯3、硝酸纖維素膜4、尼龍膜5、磁性微粒孔間差異（<10%）

固相載體材料要求：種類：孔間差異95對(duì)策一、用一定濃度的人IgG（10ng/ml）適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG控制反應(yīng)各條件計(jì)算各孔讀值的平均值并要求每孔的讀值與其平均值間的差異小于10%。二、選擇已知陽性與陰性標(biāo)本，作系列稀釋在不同固相載體上按預(yù)定的ELISA法進(jìn)行操作測(cè)定評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn)：陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大的好對(duì)策一、96Blocking（封閉）Ag/Ab被固相化后，固相載體表面會(huì)留有少量未被吸附的位點(diǎn)（空），反應(yīng)過程中加入的待檢標(biāo)本或酶標(biāo)抗體等可能與之吸附（非特異），導(dǎo)致其檢測(cè)的本底偏高。為避免之，包被后再用BSA或小牛血清包被一次——Blocking。Blocking（封閉）Ag/Ab被固相化后，固相載體表面會(huì)97用于酶免疫測(cè)定的抗原與抗體1、用途：包被與標(biāo)記2、種類：抗原—天然、重組、合成抗體—多克隆、單克隆3、要求：抗原純度高、抗體效價(jià)高、結(jié)合力高（對(duì)照孔）4、適宜工作濃度用于酶免疫測(cè)定的抗原與抗體1、用途：包被與標(biāo)記98抗原性肽段的固相合成以Fmoc-Gly-Wang樹脂為載體，以N-α-Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸為原料，以HBTU/HoBt作為偶聯(lián)試劑，從C-N端順序依次偶聯(lián)所需的氨基酸，直至合成所需的各肽段。然后將肽從樹脂上裂解下來，洗滌，凍干得到短肽。

抗原性肽段的固相合成以Fmoc-Gly-Wang樹脂為載體，99抗原抗體反應(yīng)課件100

間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇

各類血清包被抗原稀釋度1:1001:2001:4001:8001:160強(qiáng)陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.660.05稀釋液0.090.020.020.020.04選擇標(biāo)準(zhǔn)：強(qiáng)陽性參考血清A值為0.8左右,陰性參考血清A值<0.1

間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇

各類血清包被101酶免疫測(cè)定的酶結(jié)合物制備*酶結(jié)合物（conjugate）或稱酶標(biāo)抗體或抗原。一般是通過化學(xué)交聯(lián)(耦聯(lián))或免疫學(xué)反應(yīng)而獲得。適宜標(biāo)記用酶的要求:

①酶活性～②具共價(jià)交聯(lián)能力～③催化底物產(chǎn)有色信號(hào)并易于檢測(cè)～④自身穩(wěn)定,不易受干擾～酶免疫測(cè)定的酶結(jié)合物制備*酶結(jié)合物（conjugate）或稱102免疫測(cè)定技術(shù)常用的酶及其底物(substrate)

酶

底物

顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)辣根過氧化物酶鄰苯二胺橘紅色492四甲基聯(lián)苯胺黃色460氨基水楊酸棕色449鄰聯(lián)苯甲胺蘭色4252,2'-連胺基-2（3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）銨鹽藍(lán)綠色642堿性磷酸酶4-硝基酚磷酸鹽（PNP）黃色400萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽紅色500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黃色405,420葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭深藍(lán)色405,420ＢD-半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷（4MuG）熒光360,450硝基酚半乳糖苷（ONPG）黃色420免疫測(cè)定技術(shù)常用的酶及其底物(substrate)酶103Conjugate的制備1、戊二醛交聯(lián)法（一步/二步）酶-NH2O=C-H酶-N=CH||

+

（CH2)3

——CH3||抗體-NH2O=C-H抗體-N=CH2、過碘酸鈉法

利用過碘酸鈉將酶蛋白分子中與酶活性無關(guān)的多糖分子的羥基氧化——成活潑的醛基+

抗體蛋白游離氨基形成—Schiffs堿而交聯(lián)Conjugate的制備1、戊二醛交聯(lián)法（一步/二步）104Homogenous（均相測(cè)定）

Ab*＋Ag→Ab*Ag＋Ab*Ab＋Ag*→AbAg*＋Ag*Ab*Ag＋Ab*

AbAg*＋Ag*—不需分離，但Ab*/Ag*酶需失活例：enzyme-multipliedimmunoassaytecnique(EMIT,酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù))clonedenzymedonorimmmunoassay(CEDIA)(克隆酶供體免疫測(cè)定)Homogenous（均相測(cè)定）

Ab*＋A105EMIT測(cè)定：檢測(cè)對(duì)象：半抗原試劑：抗體酶標(biāo)記半抗原底物反應(yīng)模式：競(jìng)爭(zhēng)法EMIT測(cè)定：檢測(cè)對(duì)象：半抗原106CEDIA測(cè)定：enzymeacceptor，EA（酶受體）enzymedonor，ED（酶供體）EA、ED游離無酶活性檢測(cè)對(duì)象：藥物、小分子物試劑：抗體、EAED標(biāo)記抗原底物反應(yīng)模式：競(jìng)爭(zhēng)法CEDIA測(cè)定：enzymeacceptor，EA107固相膜免疫吸附測(cè)定固相載體：硝酸纖維素微孔膜標(biāo)記物選擇：有色微粒子（膠體金）反應(yīng)形式：穿流（滲濾）橫流（層析）WesternBlot重組免疫結(jié)合試驗(yàn)（RIBA）應(yīng)用：藥物、激素、抗生素等固相膜免疫吸附測(cè)定固相載體：硝酸纖維素微孔膜108Fluorescenceimmunoassay（FIA）

以熒光素為標(biāo)記物并標(biāo)記抗體/抗原，當(dāng)抗原-抗體特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下可示蹤，實(shí)際工作中普遍使用。由于主要用熒光素標(biāo)記抗體去檢測(cè)相應(yīng)抗原（定位、定量），所以統(tǒng)稱熒光抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）分類：熒光免疫顯微技術(shù)（流式）熒光免疫測(cè)定（非均相/均相）Fluorescenceimmunoassay（FIA）

109熒光（fluorescence）：某些物質(zhì)在光的照射下，吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)返回原基態(tài)時(shí)，以電磁輻射形式放射出所吸收的光能，稱為光致發(fā)光。若用一短波長(zhǎng)光照射某物質(zhì)，該物質(zhì)能發(fā)射較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光，此種光被稱謂熒光。熒光素（fluorchrome）：是指一些具有光致熒光特性的染料物質(zhì)。熒光的淬滅現(xiàn)象：某些理化因素可使得熒光色素的輻射能力減弱或消失的現(xiàn)象。熒光（fluorescence）：110常用的熒光素1、異硫氰基熒光黃（FITC）純品為黃色結(jié)晶粉末，最大吸收光譜490～495mm，最大發(fā)射光譜520～530mm，呈明亮黃綠色熒光。2、四乙基羅丹明（RB200）純品為橘紅色粉末，最大吸收光譜570mm，最大發(fā)射光譜595～600mm，呈明亮橙色熒光。3、四甲基異硫氰基羅丹明（TRITC）羅丹明的衍生物，純品為紫紅色粉末，最大吸收光譜550mm，最大發(fā)射光譜620mm，呈橙紅熒光。常用的熒光素1、異硫氰基熒光黃（FITC）111常用的熒光抗體標(biāo)記方法即熒光素與抗體的結(jié)合熒光素有活潑的化學(xué)基（偶氮基—N=N—）（異氰基—N=C=O）（異硫氰基—N=C=S）抗體蛋白有氨基酸的自由氨基方法：透析~攪拌~結(jié)合物——（熒光素—N-C-N-蛋白質(zhì)）

lllHSH常用的熒光抗體標(biāo)記方法即熒光素與抗體的結(jié)合112熒光免疫測(cè)定（非均相/均相）

時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TR-FIA）（非）熒光免疫測(cè)定（非均相/均相）

時(shí)間分辨11304008001000短壽熒光長(zhǎng)壽熒光延緩時(shí)間計(jì)數(shù)時(shí)間熒光強(qiáng)度時(shí)間us時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定原理示意圖0400114時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TR-FIA）原理1、用熒光壽命較長(zhǎng)的稀土金屬（Eu、Tb等）作標(biāo)記物，標(biāo)記抗原或抗體。2、利用時(shí)間分辨熒光分析儀3、延緩測(cè)量時(shí)間，以排除標(biāo)本中的自發(fā)熒光。因?yàn)楹笳叩臒晒鈮勖芏獭?、稀土金屬的激發(fā)光波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)間距大（Stokes移位290nm/一般熒光Stokes移位28nm）5、靈敏度高（0.2～1ng/ml）時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TR-FIA）原理1、用熒光壽命較長(zhǎng)的115熒光免疫測(cè)定（非均相/均相）熒光偏振免疫測(cè)定(FPIA)(均)熒光免疫測(cè)定（非均相/均相）熒光偏振免疫測(cè)定(FPIA)116當(dāng)待測(cè)抗原濃度高時(shí)，經(jīng)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)大部分抗體被其結(jié)合，而熒光素標(biāo)記的抗原多呈游離的小分子狀態(tài)。由于其分子小，測(cè)量到的熒光偏振光較低。反之，待測(cè)抗原濃度低時(shí)，大部分熒光素標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合，形成大分子的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，此時(shí)檢測(cè)到的熒光偏振程度也較高。熒光偏振免疫分析示意圖當(dāng)待測(cè)抗原濃度高時(shí)，經(jīng)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)大部分抗體被其結(jié)合，而熒光素標(biāo)117熒光偏振免疫測(cè)定(FPIA)原理1、熒光物質(zhì)在溶液中被單一平面的偏振光（波長(zhǎng)485nm）照射后，可吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)；當(dāng)其恢復(fù)至基態(tài)時(shí)釋放能量的同時(shí)發(fā)射偏振熒光（波長(zhǎng)525nm）。2、偏振熒光的強(qiáng)度與熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度呈反比。（大分子/慢-強(qiáng)，小分子/快-弱）。3、FPIA主要用于測(cè)定藥物（小）濃度。4、當(dāng)藥物與熒光標(biāo)記藥物—競(jìng)爭(zhēng)一定量抗體，結(jié)果標(biāo)本中藥物高，熒光標(biāo)記藥物-抗體形成低，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物含量。（呈反比）熒光偏振免疫測(cè)定(FPIA)原理1、熒光物質(zhì)在溶液中被單118其他標(biāo)記1、放射性核素標(biāo)記物～2、發(fā)光標(biāo)記物～

chemiluminescenceimmunoassay,CLIAluminescenceenzymeimmunoassay,IEIAbioluminescenceimmunoassay,BLIA3、金標(biāo)記物～4、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）～其他標(biāo)記1、放射性核素標(biāo)記物～119Immnogoldlabelingtechnique金標(biāo)記免疫技術(shù)是以膠體金標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體，對(duì)樣本中相應(yīng)抗體或抗原進(jìn)行檢測(cè)。膠體金—一般指金的水溶液，又稱金溶膠。金顆粒直徑在1～100nm之間。其對(duì)電解質(zhì)敏感，水化層破壞顆粒凝聚據(jù)顆粒大小，其呈色性不同。

Immnogoldlabelingtechnique金標(biāo)120

膠體金（ColloidalGold）

15～60nm

膠體金（ColloidalGold）

121膠體金的制備還原法(最常用的化學(xué)方法)原理：在氯化金水溶液中加入一定量的還原劑，使金離子還原為金原子。