基因功能分析基本策略課件

第十二章基因功能分析的基本策略第十二章基因功能分析的基本策略1轉(zhuǎn)基因模型是研究基因功能的主要手段轉(zhuǎn)基因生物：外源基因?qū)肷矬w表達(dá)。基因打靶：外源基因替換內(nèi)源基因?；蚯贸??；蚯萌搿；虺聊簩?dǎo)入特定基因，抑制內(nèi)源性基因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因模型是研究基因功能的主要手段轉(zhuǎn)基因生物：2第一節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictechnology)：將外源基因?qū)爰?xì)胞，隨機(jī)整合到受體基因組內(nèi)，并隨細(xì)胞分裂而遺傳給后代。細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因植物。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictech3一.轉(zhuǎn)基因生物的意義20世紀(jì)80年代(BrinsterandPalmiter)：著名的轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)，金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)大鼠生長(zhǎng)激素基因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因生物的用途：研究手段：疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。改良動(dòng)物性狀：抗病性、耐寒性等。生產(chǎn)產(chǎn)品：抗體、疫苗等的生產(chǎn)。一.轉(zhuǎn)基因生物的意義20世紀(jì)80年代(Brinste4基因功能分析基本策略課件5二、基本原理構(gòu)建攜帶目的基因的載體。外源基因?qū)耄簩⒛康幕蛲ㄟ^(guò)顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中。使目的基因整合到基因組中。將此受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞再植入受體動(dòng)物的輸卵管或子宮中。使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。二、基本原理構(gòu)建攜帶目的基因的載體。6基本原理供體基因受體的受精卵基本原理供體基因受體的受精卵7基本原理轉(zhuǎn)基因的受精卵基本原理轉(zhuǎn)基因的受精卵8基本原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物9基本過(guò)程上游—基因改造和載體構(gòu)建中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系下游—基因整合、表達(dá)的檢測(cè)與細(xì)胞篩選基本過(guò)程上游—基因改造和載體構(gòu)建101.上游—基因改造和載體構(gòu)建外源基因:完整的轉(zhuǎn)錄單位,由順式作用元件、結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)組成。報(bào)告基因(reportergene):在表達(dá)載體中引入易于檢測(cè)的提示重組體存在的基因。GFP、LacZ、AP、LUC。融合基因(fusiongene):將特定的目的基因與報(bào)告基因拼接成融合基因，并與順式作用元件拼接成完整的轉(zhuǎn)錄單位。1.上游—基因改造和載體構(gòu)建外源基因:完整的轉(zhuǎn)錄單位,11動(dòng)物轉(zhuǎn)基因常用的載體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體非病毒類載體：如質(zhì)粒等。動(dòng)物轉(zhuǎn)基因常用的載體腺病毒載體122.中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系基因?qū)爰夹g(shù)：物理、化學(xué)和生物學(xué)方法1)顯微注射法（microinjection)2)胚胎干細(xì)胞法（embryonicstemcells,ES細(xì)胞）3)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法4)精子載體法2.中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系基因?qū)爰夹g(shù)：物理、化131)DNA顯微注射法制備超量受精卵。DNA顯微注射。轉(zhuǎn)移注射卵到輸卵管或子宮。轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立。1)DNA顯微注射法制備超量受精卵。14DNA顯微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核DNA顯微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核15基因功能分析基本策略課件16DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精原核。顯微鏡下觀察，精原核比卵原核大，容易辨別。線性DNA整合效率比超螺旋DNA高出數(shù)倍，因而用于顯微注射的轉(zhuǎn)入基因通常是去除載體序列的線狀DNA。DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精17DNA顯微注射法的特點(diǎn)DNA大小無(wú)限制，最大可達(dá)250Kb。隨機(jī)整合：在染色體上整合的位點(diǎn)是隨機(jī)的，整合的拷貝數(shù)也不一定。轉(zhuǎn)入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干擾該基因的正常表達(dá)，影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的正常發(fā)育和代謝?？傂瘦^低(實(shí)際成功率1/1000)。DNA顯微注射法的特點(diǎn)DNA大小無(wú)限制，最大可達(dá)25018提高顯微注射DNA表達(dá)的成功率轉(zhuǎn)入的外源基因要能夠高效表達(dá)，最好是可以誘導(dǎo)表達(dá)。轉(zhuǎn)入基因中應(yīng)該包含有幫助提高整合效率的序列，如微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子外源基因提高顯微注射DNA表達(dá)的成功率轉(zhuǎn)入的外源基因要能夠高效表19基因功能分析基本策略課件202)胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞(embryostemcells,ES細(xì)胞)：可人工培養(yǎng)增殖的小鼠胚泡發(fā)育期胚胎細(xì)胞，當(dāng)把這種胚胎細(xì)胞重新導(dǎo)入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持著分化成其他類型細(xì)胞的能力。ES細(xì)胞具有與胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和分化特性。2)胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞(embryostemcel21胚胎干細(xì)胞法分離和培養(yǎng)ES細(xì)胞。外源基因?qū)隕S細(xì)胞。導(dǎo)入外源基因的ES細(xì)胞的子宮轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立。胚胎干細(xì)胞法分離和培養(yǎng)ES細(xì)胞。22胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內(nèi)層細(xì)胞胰蛋白酶消化解離加飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內(nèi)層細(xì)胞胰蛋白酶消23胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)24胚胎干細(xì)胞外源DNA的導(dǎo)入DNA胚胎干細(xì)胞囊胚原囊胚轉(zhuǎn)基因動(dòng)物磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法微注射胚胎干細(xì)胞外源DNA的導(dǎo)入DNA磷酸鈣-DNA共沉淀法25外源DNA的整合用于ES細(xì)胞的DNA載體一般帶有定點(diǎn)整合元件,避免了隨機(jī)整合。定點(diǎn)整合位點(diǎn)應(yīng)選擇在基因組內(nèi)編碼非必需產(chǎn)物的地方，以減少整合對(duì)細(xì)胞正常功能的影響。定點(diǎn)整合位點(diǎn)必須在基因組的可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的地方。外源DNA的整合用于ES細(xì)胞的DNA載體一般帶有26胚胎干細(xì)胞法的特點(diǎn)定點(diǎn)整合。ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)，外源DNA導(dǎo)入后可用正-負(fù)選擇法篩選擇正確整合的ES細(xì)胞,相對(duì)較簡(jiǎn)單。目前只在小鼠身上獲得成功。胚胎干細(xì)胞法的特點(diǎn)定點(diǎn)整合。27基因功能分析基本策略課件283）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建獲得四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚外源DNA導(dǎo)入早期胚胎：獲得病毒顆粒感染早期胚胎包裝細(xì)胞與早期胚胎共培養(yǎng)感染后的胚胎植入受體動(dòng)物子宮，發(fā)育成攜帶外源基因的動(dòng)物。3）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建29逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒感染四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚嵌合小鼠純合體小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒感染四/八細(xì)30逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的特點(diǎn)通過(guò)病毒DNA插入宿主DNA的機(jī)制，將外源目的基因整合到宿主基因組，整合效率高。反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(＜10kb)。對(duì)家禽類的轉(zhuǎn)基因研究有重要意義。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的特點(diǎn)通過(guò)病毒DNA插入宿主DNA的314）精子載體法外源DNA精子卵細(xì)胞受精卵轉(zhuǎn)基因動(dòng)物共育法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法電穿孔法4）精子載體法外源DNA共育法32DNA精子受精卵DNA卵細(xì)胞DNA胚胎干細(xì)胞DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法四細(xì)胞胚胎囊胚原腸胚轉(zhuǎn)基因動(dòng)物微注射顯微注射DNA精子受精卵DNA卵細(xì)胞DNA胚胎干細(xì)胞DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒333.下游—基因整合與表達(dá)檢測(cè)及篩選染色體基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)錄水平：轉(zhuǎn)基因的mRNA的存在與否以及表達(dá)水平。蛋白水平：轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)以及功能檢測(cè)。3.下游—基因整合與表達(dá)檢測(cè)及篩選染色體基因水平：是否整合34鑒定方法PCRSouthernblot染色體原位雜交NorthernblotRT-PCRWesternblot鑒定方法PCR35基因轉(zhuǎn)移鼠純合鼠系的建立×轉(zhuǎn)基因雜合鼠未轉(zhuǎn)基因鼠生殖系細(xì)胞中不含轉(zhuǎn)入基因生殖系細(xì)胞中含轉(zhuǎn)入基因子代多次交配可得到純合轉(zhuǎn)基因鼠系基因轉(zhuǎn)移鼠純合鼠系的建立×轉(zhuǎn)基因雜合鼠未轉(zhuǎn)基因鼠生殖系細(xì)胞中36三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用分析動(dòng)物表型與外源基因的關(guān)系，揭示外源基因的功能。建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。基因產(chǎn)品的制備：乳腺、膀胱生物反應(yīng)器。三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用分析動(dòng)物表型與外源基因的關(guān)系，揭示外源基37人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型完整的動(dòng)物模型可以模擬人類疾病的起始和發(fā)展，幫助了解疾病的病因和發(fā)展過(guò)程。為測(cè)試各種可能的治療方案提供一個(gè)統(tǒng)一有效的系統(tǒng)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型提供了人類疾病的研究手段。人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型完整的動(dòng)物模型可以模擬人類疾病的起始38人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：老年性癡呆癥(Alzheimer’sdisease)、關(guān)節(jié)炎(arthritis)、肌肉營(yíng)養(yǎng)缺乏癥(musculardistrophy)、腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經(jīng)退行性疾病(neurodegenenerativedisorder)、內(nèi)分泌功能障礙(endocrinological

disfunction)、動(dòng)脈硬化癥及其他很多疾病。人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：39利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器：乳腺、膀胱、血液生物反應(yīng)器等?？鼓窱II：轉(zhuǎn)基因綿羊的乳汁中。β乳球蛋白紅細(xì)胞生成素凝血因子VIII凝血因子IX生長(zhǎng)激素利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器：乳腺、膀胱40轉(zhuǎn)基因改良移植器官改造異種來(lái)源器官的遺傳性狀，使之適應(yīng)于人體器官或組織的移植。1997年起，利用遺傳改良的轉(zhuǎn)基因豬肝做為嚴(yán)重肝病患者的離體生命支持物。轉(zhuǎn)基因改良移植器官改造異種來(lái)源器官的遺傳性狀，使之適應(yīng)于人體41動(dòng)物的克隆1996年，首次實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的無(wú)性生殖。由綿羊的乳腺細(xì)胞提供細(xì)胞核，卵細(xì)胞提供細(xì)胞質(zhì)發(fā)育而來(lái)。核移植技術(shù)（NuclearTransfer)動(dòng)物的克隆1996年，首次實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的無(wú)性生殖。42核移植技術(shù)（NuclearTransfer)核移植技術(shù)（NuclearTransfer)43基因功能分析基本策略課件44第二節(jié)基因打靶基因打靶(GeneTargeting)

：通過(guò)DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。基因敲除(geneknockout):將某個(gè)基因定向去除?；蚯萌?geneknockin):定向?qū)⒁欢位蛐蛄刑娲硪欢位蛐蛄?。第二?jié)基因打靶基因打靶(GeneTargeting)45一、基因打靶的基本程序打靶載體的構(gòu)建。打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞及其鑒定?；蚯贸鼸S細(xì)胞注射入胚泡。胚泡植入假孕小鼠的子宮。嵌合體的雜交建立基因打靶的純合鼠系。一、基因打靶的基本程序打靶載體的構(gòu)建。461.打靶載體的構(gòu)建同源基因片段質(zhì)粒載體HB1HB2neor基因HSV-tk基因1.打靶載體的構(gòu)建同源基因片段質(zhì)粒載體HB1HB2neor472.打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法顯微注射法2.打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞磷酸鈣-DNA共沉淀法48打靶載體的正-負(fù)選擇與整合位點(diǎn)兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列(HB1和HB2)。目的基因。編碼抗G418的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor基因）。2個(gè)不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分別來(lái)自I型II型單純皰疹病毒。打靶載體的正-負(fù)選擇與整合位點(diǎn)兩端區(qū)域同源的兩段DNA序49打靶載體的正篩選

tk1HB1neorHB2tk2載體載體同源重組neorG418正篩選，細(xì)胞存活染色體染色體打靶載體的正篩選tk1HB1neor50打靶載體的負(fù)篩選

tk1HB1neorHB2tk2染色體染色體非特異性整合

GCV負(fù)篩選，細(xì)胞死亡打靶載體的負(fù)篩選tk1HB1neor51PCR鑒定在打靶載體的HB1和HB2之間，加上一個(gè)載體和鼠的基因組中都沒(méi)有的獨(dú)特DNA序列（US）。如發(fā)生隨機(jī)整合，PCR無(wú)法擴(kuò)增出預(yù)期的DNA片段。如果整合于特定位點(diǎn)時(shí)，則PCR可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段。PCR鑒定在打靶載體的HB1和HB2之間，加上一個(gè)52PCR鑒定：特異整合tk1HB1USneorHB2tk2P2P1PCR反應(yīng)有特異條帶特異整合PCR鑒定：特異整合tk1HB1USneo53基因敲除小鼠的獲得基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮嵌合體的雜交育種：同源重組只發(fā)生在一條染色體上，因而同源重組后只能得到嵌合體，將嵌合體雜交，即可得到純合子。×基因敲除小鼠的獲得基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡×54基因功能分析基本策略課件55基因敲除和RNA干擾基因敲除是在基因水平將某個(gè)基因定點(diǎn)去除，動(dòng)物整體水平。RNA干擾不是敲除基因，而是誘導(dǎo)RNA的特異性降解，干擾基因的表達(dá)。一般是在細(xì)胞水平?；蚯贸蚏NA干擾基因敲除是在基因水平將某個(gè)基因定點(diǎn)去56第三節(jié)RNA干擾1990年，Jorgense等通過(guò)轉(zhuǎn)基因改造牽?；伾Ｍ庠椿虿坏荒芗由罨ǖ念伾?，反而造成內(nèi)源基因表達(dá)的降低。

第三節(jié)RNA干擾1990年，Jorgense等通過(guò)57RNA干擾是dsRNA導(dǎo)致的基因沉默1998年，F(xiàn)ire等在C.elegans中用antisenseRNA抑制基因表達(dá)。dsRNA比sense或antisenseRNA都好。注射甚至口服dsRNA都能誘發(fā)基因沉默。很少量的雙鏈RNA就能誘發(fā)C.elegans整體的基因沉默，甚至能傳遞到子一代。RNA干擾：RNAinterference(RNAi)

RNA干擾是dsRNA導(dǎo)致的基因沉默1998年，F(xiàn)ir58RNAi是真核生物中廣泛存在的現(xiàn)象

植物：干擾因素自葉脈向外擴(kuò)散，綠色熒光蛋白(GFP)基因被抑制，顯露出紅色。

線蟲(chóng)：左側(cè)為GFP轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)；右側(cè)線蟲(chóng)則經(jīng)GFPdsRNA處理。部分細(xì)胞RNAi相關(guān)蛋白表達(dá)較低，仍有綠色熒光。

Hela細(xì)胞：經(jīng)ORC6siRNA作用后，細(xì)胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象。綠色為tubulin，紅色為DNA。ORC6細(xì)胞分裂調(diào)控蛋白。

果蠅：右側(cè)果蠅為野生型，左側(cè)為shRNA

造成的色素缺乏的缺陷型。RNAi是真核生物中廣泛存在的現(xiàn)象植物：干擾因素自葉脈向59RNA干擾RNA干擾：雙鏈RNA誘導(dǎo)的同源mRNA降解。RNA干擾技術(shù)可以用于基因敲除，選擇性關(guān)閉特定細(xì)胞基因。RNA干擾RNA干擾：雙鏈RNA誘導(dǎo)的同源mRNA60siRNA的產(chǎn)生Dicer：RNaseIII的一種，可降解dsRNA成siRNA。ShortinterferingRNA(siRNA)：21~23ntsiRNA的產(chǎn)生Dicer：RNaseIII的一種，可61siRNA誘導(dǎo)同源序列的降解RNA-InducedSilencingComplex產(chǎn)生兩種后果：同源mRNA的降解。同源mRNA翻譯受阻。siRNA誘導(dǎo)同源序列的降解RNA-InducedSil62基因沉默的機(jī)制是多方面的dsRNA造成的mRNA降解。Post-translationalgenesilencingdsRNA造成同源性基因的甲基化和表達(dá)關(guān)閉。dsRNA造成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。dsRNA對(duì)蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生影響?；虺聊臋C(jī)制是多方面的dsRNA造成的mRNA降解。63RNAi和基因敲除在基因組DNA上，通過(guò)同源重組進(jìn)行的基因敲除。在mRNA水平進(jìn)行的基因敲除：AntisenseoligonucleotidesRibozymeRNAinterference：dsRNA；siRNA；shRNARNAi和基因敲除在基因組DNA上，通過(guò)同源重組進(jìn)行的64dsRNA能夠誘發(fā)細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)在哺乳動(dòng)物存在干擾素相關(guān)的抗病毒體系。dsRNA激活dsRNA-dependentproteinkinase(PKR)，進(jìn)一步誘導(dǎo)非序列依賴的內(nèi)源性RNA降解。在胚胎期細(xì)胞，上述非特異的抗病毒體系尚未形成。通過(guò)dsRNA可以誘導(dǎo)序列特異的RNAi。dsRNA能夠誘發(fā)細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)在哺乳動(dòng)物存在干擾素相關(guān)65siRNA與shRNA<30bpsiRNA可以誘導(dǎo)RNAi，并克服哺乳細(xì)胞的障礙。ShorthairpinRNA：

(shRNA)可達(dá)成穩(wěn)定的基因敲除。siRNA與shRNA<30bpsiRNA可以誘導(dǎo)66shRNA表達(dá)載體系統(tǒng)shRNA表達(dá)載體系統(tǒng)67miRNA表達(dá)載體系統(tǒng)miRNA表達(dá)載體系統(tǒng)68siRNA設(shè)計(jì)原則siRNAantisense鏈5’端穩(wěn)定性較低時(shí)具有更好的效率。必要時(shí)采用專業(yè)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。采用多個(gè)siRNA片段，并篩選其中最有效的。有時(shí)siRNA的干擾效果只表現(xiàn)在蛋白水平。盡可能使用較低的siRNA濃度，以保證其特異性。設(shè)立補(bǔ)救試驗(yàn)可進(jìn)一步確認(rèn)RNAi與效果之間的關(guān)系。siRNA設(shè)計(jì)原則siRNAantisense鏈5’69shRNA與siRNA應(yīng)用的局限在某些細(xì)胞的特定狀態(tài)下，shRNA或siRNA仍能夠誘發(fā)細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。miRNA在與其靶基因mRNA不完全匹配的情況下仍能夠誘發(fā)RNAi。在有14bp匹配的情況下就能夠誘發(fā)干擾。siRNA可在翻譯水平發(fā)揮作用，有研究發(fā)現(xiàn)，它能夠造成大量蛋白翻譯的降低。shRNA與siRNA應(yīng)用的局限在某些細(xì)胞的特定狀態(tài)下70shRNA與siRNA的比較siRNA應(yīng)用非常方便，干擾效力往往比較高。只能進(jìn)行達(dá)成瞬時(shí)的基因表達(dá)抑制。

在線蟲(chóng)和植物，siRNA可擴(kuò)增，但哺乳細(xì)胞不能。shRNA前期工作比較復(fù)雜?？梢赃M(jìn)行穩(wěn)定的基因表達(dá)抑制。shRNA與siRNA的比較siRNA71第十二章基因功能分析的基本策略第十二章基因功能分析的基本策略72轉(zhuǎn)基因模型是研究基因功能的主要手段轉(zhuǎn)基因生物：外源基因?qū)肷矬w表達(dá)?；虼虬校和庠椿蛱鎿Q內(nèi)源基因?；蚯贸??；蚯萌??；虺聊簩?dǎo)入特定基因，抑制內(nèi)源性基因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因模型是研究基因功能的主要手段轉(zhuǎn)基因生物：73第一節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictechnology)：將外源基因?qū)爰?xì)胞，隨機(jī)整合到受體基因組內(nèi)，并隨細(xì)胞分裂而遺傳給后代。細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因植物。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictech74一.轉(zhuǎn)基因生物的意義20世紀(jì)80年代(BrinsterandPalmiter)：著名的轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)，金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)大鼠生長(zhǎng)激素基因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因生物的用途：研究手段：疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。改良動(dòng)物性狀：抗病性、耐寒性等。生產(chǎn)產(chǎn)品：抗體、疫苗等的生產(chǎn)。一.轉(zhuǎn)基因生物的意義20世紀(jì)80年代(Brinste75基因功能分析基本策略課件76二、基本原理構(gòu)建攜帶目的基因的載體。外源基因?qū)耄簩⒛康幕蛲ㄟ^(guò)顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中。使目的基因整合到基因組中。將此受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞再植入受體動(dòng)物的輸卵管或子宮中。使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。二、基本原理構(gòu)建攜帶目的基因的載體。77基本原理供體基因受體的受精卵基本原理供體基因受體的受精卵78基本原理轉(zhuǎn)基因的受精卵基本原理轉(zhuǎn)基因的受精卵79基本原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物80基本過(guò)程上游—基因改造和載體構(gòu)建中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系下游—基因整合、表達(dá)的檢測(cè)與細(xì)胞篩選基本過(guò)程上游—基因改造和載體構(gòu)建811.上游—基因改造和載體構(gòu)建外源基因:完整的轉(zhuǎn)錄單位,由順式作用元件、結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)組成。報(bào)告基因(reportergene):在表達(dá)載體中引入易于檢測(cè)的提示重組體存在的基因。GFP、LacZ、AP、LUC。融合基因(fusiongene):將特定的目的基因與報(bào)告基因拼接成融合基因，并與順式作用元件拼接成完整的轉(zhuǎn)錄單位。1.上游—基因改造和載體構(gòu)建外源基因:完整的轉(zhuǎn)錄單位,82動(dòng)物轉(zhuǎn)基因常用的載體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體非病毒類載體：如質(zhì)粒等。動(dòng)物轉(zhuǎn)基因常用的載體腺病毒載體832.中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系基因?qū)爰夹g(shù)：物理、化學(xué)和生物學(xué)方法1)顯微注射法（microinjection)2)胚胎干細(xì)胞法（embryonicstemcells,ES細(xì)胞）3)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法4)精子載體法2.中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系基因?qū)爰夹g(shù)：物理、化841)DNA顯微注射法制備超量受精卵。DNA顯微注射。轉(zhuǎn)移注射卵到輸卵管或子宮。轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立。1)DNA顯微注射法制備超量受精卵。85DNA顯微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核DNA顯微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核86基因功能分析基本策略課件87DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精原核。顯微鏡下觀察，精原核比卵原核大，容易辨別。線性DNA整合效率比超螺旋DNA高出數(shù)倍，因而用于顯微注射的轉(zhuǎn)入基因通常是去除載體序列的線狀DNA。DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精88DNA顯微注射法的特點(diǎn)DNA大小無(wú)限制，最大可達(dá)250Kb。隨機(jī)整合：在染色體上整合的位點(diǎn)是隨機(jī)的，整合的拷貝數(shù)也不一定。轉(zhuǎn)入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干擾該基因的正常表達(dá)，影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的正常發(fā)育和代謝?？傂瘦^低(實(shí)際成功率1/1000)。DNA顯微注射法的特點(diǎn)DNA大小無(wú)限制，最大可達(dá)25089提高顯微注射DNA表達(dá)的成功率轉(zhuǎn)入的外源基因要能夠高效表達(dá)，最好是可以誘導(dǎo)表達(dá)。轉(zhuǎn)入基因中應(yīng)該包含有幫助提高整合效率的序列，如微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子外源基因提高顯微注射DNA表達(dá)的成功率轉(zhuǎn)入的外源基因要能夠高效表90基因功能分析基本策略課件912)胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞(embryostemcells,ES細(xì)胞)：可人工培養(yǎng)增殖的小鼠胚泡發(fā)育期胚胎細(xì)胞，當(dāng)把這種胚胎細(xì)胞重新導(dǎo)入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持著分化成其他類型細(xì)胞的能力。ES細(xì)胞具有與胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和分化特性。2)胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞(embryostemcel92胚胎干細(xì)胞法分離和培養(yǎng)ES細(xì)胞。外源基因?qū)隕S細(xì)胞。導(dǎo)入外源基因的ES細(xì)胞的子宮轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立。胚胎干細(xì)胞法分離和培養(yǎng)ES細(xì)胞。93胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內(nèi)層細(xì)胞胰蛋白酶消化解離加飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內(nèi)層細(xì)胞胰蛋白酶消94胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)95胚胎干細(xì)胞外源DNA的導(dǎo)入DNA胚胎干細(xì)胞囊胚原囊胚轉(zhuǎn)基因動(dòng)物磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法微注射胚胎干細(xì)胞外源DNA的導(dǎo)入DNA磷酸鈣-DNA共沉淀法96外源DNA的整合用于ES細(xì)胞的DNA載體一般帶有定點(diǎn)整合元件,避免了隨機(jī)整合。定點(diǎn)整合位點(diǎn)應(yīng)選擇在基因組內(nèi)編碼非必需產(chǎn)物的地方，以減少整合對(duì)細(xì)胞正常功能的影響。定點(diǎn)整合位點(diǎn)必須在基因組的可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的地方。外源DNA的整合用于ES細(xì)胞的DNA載體一般帶有97胚胎干細(xì)胞法的特點(diǎn)定點(diǎn)整合。ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)，外源DNA導(dǎo)入后可用正-負(fù)選擇法篩選擇正確整合的ES細(xì)胞,相對(duì)較簡(jiǎn)單。目前只在小鼠身上獲得成功。胚胎干細(xì)胞法的特點(diǎn)定點(diǎn)整合。98基因功能分析基本策略課件993）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建獲得四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚外源DNA導(dǎo)入早期胚胎：獲得病毒顆粒感染早期胚胎包裝細(xì)胞與早期胚胎共培養(yǎng)感染后的胚胎植入受體動(dòng)物子宮，發(fā)育成攜帶外源基因的動(dòng)物。3）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建100逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒感染四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚嵌合小鼠純合體小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒感染四/八細(xì)101逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的特點(diǎn)通過(guò)病毒DNA插入宿主DNA的機(jī)制，將外源目的基因整合到宿主基因組，整合效率高。反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(＜10kb)。對(duì)家禽類的轉(zhuǎn)基因研究有重要意義。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的特點(diǎn)通過(guò)病毒DNA插入宿主DNA的1024）精子載體法外源DNA精子卵細(xì)胞受精卵轉(zhuǎn)基因動(dòng)物共育法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法電穿孔法4）精子載體法外源DNA共育法103DNA精子受精卵DNA卵細(xì)胞DNA胚胎干細(xì)胞DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法四細(xì)胞胚胎囊胚原腸胚轉(zhuǎn)基因動(dòng)物微注射顯微注射DNA精子受精卵DNA卵細(xì)胞DNA胚胎干細(xì)胞DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒1043.下游—基因整合與表達(dá)檢測(cè)及篩選染色體基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)錄水平：轉(zhuǎn)基因的mRNA的存在與否以及表達(dá)水平。蛋白水平：轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)以及功能檢測(cè)。3.下游—基因整合與表達(dá)檢測(cè)及篩選染色體基因水平：是否整合105鑒定方法PCRSouthernblot染色體原位雜交NorthernblotRT-PCRWesternblot鑒定方法PCR106基因轉(zhuǎn)移鼠純合鼠系的建立×轉(zhuǎn)基因雜合鼠未轉(zhuǎn)基因鼠生殖系細(xì)胞中不含轉(zhuǎn)入基因生殖系細(xì)胞中含轉(zhuǎn)入基因子代多次交配可得到純合轉(zhuǎn)基因鼠系基因轉(zhuǎn)移鼠純合鼠系的建立×轉(zhuǎn)基因雜合鼠未轉(zhuǎn)基因鼠生殖系細(xì)胞中107三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用分析動(dòng)物表型與外源基因的關(guān)系，揭示外源基因的功能。建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型?；虍a(chǎn)品的制備：乳腺、膀胱生物反應(yīng)器。三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用分析動(dòng)物表型與外源基因的關(guān)系，揭示外源基108人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型完整的動(dòng)物模型可以模擬人類疾病的起始和發(fā)展，幫助了解疾病的病因和發(fā)展過(guò)程。為測(cè)試各種可能的治療方案提供一個(gè)統(tǒng)一有效的系統(tǒng)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型提供了人類疾病的研究手段。人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型完整的動(dòng)物模型可以模擬人類疾病的起始109人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：老年性癡呆癥(Alzheimer’sdisease)、關(guān)節(jié)炎(arthritis)、肌肉營(yíng)養(yǎng)缺乏癥(musculardistrophy)、腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經(jīng)退行性疾病(neurodegenenerativedisorder)、內(nèi)分泌功能障礙(endocrinological

disfunction)、動(dòng)脈硬化癥及其他很多疾病。人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：110利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器：乳腺、膀胱、血液生物反應(yīng)器等。抗凝血酶III：轉(zhuǎn)基因綿羊的乳汁中。β乳球蛋白紅細(xì)胞生成素凝血因子VIII凝血因子IX生長(zhǎng)激素利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器：乳腺、膀胱111轉(zhuǎn)基因改良移植器官改造異種來(lái)源器官的遺傳性狀，使之適應(yīng)于人體器官或組織的移植。1997年起，利用遺傳改良的轉(zhuǎn)基因豬肝做為嚴(yán)重肝病患者的離體生命支持物。轉(zhuǎn)基因改良移植器官改造異種來(lái)源器官的遺傳性狀，使之適應(yīng)于人體112動(dòng)物的克隆1996年，首次實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的無(wú)性生殖。由綿羊的乳腺細(xì)胞提供細(xì)胞核，卵細(xì)胞提供細(xì)胞質(zhì)發(fā)育而來(lái)。核移植技術(shù)（NuclearTransfer)動(dòng)物的克隆1996年，首次實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的無(wú)性生殖。113核移植技術(shù)（NuclearTransfer)核移植技術(shù)（NuclearTransfer)114基因功能分析基本策略課件115第二節(jié)基因打靶基因打靶(GeneTargeting)

：通過(guò)DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。基因敲除(geneknockout):將某個(gè)基因定向去除?；蚯萌?geneknockin):定向?qū)⒁欢位蛐蛄刑娲硪欢位蛐蛄?。第二?jié)基因打靶基因打靶(GeneTargeting)116一、基因打靶的基本程序打靶載體的構(gòu)建。打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞及其鑒定?；蚯贸鼸S細(xì)胞注射入胚泡。胚泡植入假孕小鼠的子宮。嵌合體的雜交建立基因打靶的純合鼠系。一、基因打靶的基本程序打靶載體的構(gòu)建。1171.打靶載體的構(gòu)建同源基因片段質(zhì)粒載體HB1HB2neor基因HSV-tk基因1.打靶載體的構(gòu)建同源基因片段質(zhì)粒載體HB1HB2neor1182.打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法顯微注射法2.打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞磷酸鈣-DNA共沉淀法119打靶載體的正-負(fù)選擇與整合位點(diǎn)兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列(HB1和HB2)。目的基因。編碼抗G418的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor基因）。2個(gè)不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分別來(lái)自I型II型單純皰疹病毒。打靶載體的正-負(fù)選擇與整合位點(diǎn)兩端區(qū)域同源的兩段DNA序120打靶載體的正篩選

tk1HB1neorHB2tk2載體載體同源重組neorG418正篩選，細(xì)胞存活染色體染色體打靶載體的正篩選tk1HB1neor121打靶載體的負(fù)篩選

tk1HB1neorHB2tk2染色體染色體非特異性整合

GCV負(fù)篩選，細(xì)胞死亡打靶載體的負(fù)篩選tk1HB1neor122PCR鑒定在打靶載體的HB1和HB2之間，加上一個(gè)載體和鼠的基因組中都沒(méi)有的獨(dú)特DNA序列（US）。如發(fā)生隨機(jī)整合，PCR無(wú)法擴(kuò)增出預(yù)期的DNA片段。如果整合于特定位點(diǎn)時(shí)，則PCR可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段。PCR鑒定在打靶載體的HB1和HB2之間，加上一個(gè)123PCR鑒定：特異整合tk1HB1USneorHB2tk2P2P1PCR反應(yīng)有特異條帶特異整合PCR鑒定：特異整合tk1HB1USneo124基因敲除小鼠的獲得基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮嵌合體的雜交育種：同源重組只發(fā)生在一條染色體上，因而同源重組后只能得到嵌合體，將嵌合體雜交，即可得到純合子?！粱蚯贸∈蟮墨@得基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡×125基因功能分析基本策略課件126基因敲除和RNA干擾基因敲除是在基因水平將某個(gè)基因定點(diǎn)去除，動(dòng)物整體水平。RNA干擾不是敲除基因，而是誘導(dǎo)RNA的特異性降解，干擾基因的表達(dá)。一般是在細(xì)胞水平?；蚯贸蚏NA干擾基因敲除是在基因水平將某個(gè)基因定點(diǎn)去127第三節(jié)RNA干擾1990年，Jorgense等通過(guò)轉(zhuǎn)基因改造牽?；伾Ｍ庠椿虿坏荒芗由罨ǖ念伾?，反而造成內(nèi)源基因表達(dá)的降低。

第三節(jié)RNA干擾1990年，Jorgense等通過(guò)128RNA干擾是dsRNA導(dǎo)致的基因沉默1998年，F(xiàn)ire等在C.elegans中用antisenseRNA抑制基因表達(dá)。dsRNA比sense或antisenseRNA都好。注射甚至口服dsRNA都能誘發(fā)基因沉默。很少量的雙鏈RNA就能誘發(fā)C.elegans整體的基因沉默，甚至能傳遞到子一代。RNA干擾：RNAinterference(RNAi)

RNA干擾是dsRNA導(dǎo)致的基因沉默1998年，F(xiàn)ir129RNAi是真核生物中廣泛存在的現(xiàn)象

植物：干擾因素自葉脈向外擴(kuò)散，綠色熒光蛋白(GFP)基因被抑制，顯露出紅色。

線蟲(chóng)：左側(cè)為GFP轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)；右側(cè)線蟲(chóng)則經(jīng)GFPdsRNA處理。部分細(xì)胞RNAi相關(guān)蛋白表達(dá)較低，仍有綠色熒光。

Hela細(xì)胞：經(jīng)ORC6siRNA作用后，細(xì)胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象。綠色為tubulin，紅色為DNA。ORC6細(xì)胞分裂調(diào)控蛋白。

果蠅：右側(cè)果蠅為野生型，左側(cè)為shRNA

造成的色素缺乏的缺陷型。RNAi