外源基因的表達(dá)08課件

外源基因表達(dá)系統(tǒng)由基因表達(dá)載體和相應(yīng)的受體細(xì)胞兩部分組成。

基因表達(dá)系統(tǒng)有原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)和真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)。第一節(jié)外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)由基因表達(dá)載體和相應(yīng)的受體細(xì)1據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：1．原核表達(dá)系統(tǒng)：將外源基因引入原核細(xì)胞，并使其在原核細(xì)胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達(dá)、合成基因產(chǎn)物的體系。2．真核表達(dá)系統(tǒng)：使外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的體系。據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：2（1）大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。

（2）基因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作和分析。（3）多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。（4）生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機制比較清楚。（5）不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象。（6）內(nèi)源蛋白酶會降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞具有如下特點：

（1）大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅3外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個環(huán)節(jié)，它是在一系列酶蛋白和調(diào)控序列的共同作用下完成的。

一、啟動子

啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。

第二節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控元件

外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個環(huán)節(jié)，它是41.原核生物的啟動子

原核生物的啟動子一般由四個部分構(gòu)成：轉(zhuǎn)錄起始位點、兩個六聯(lián)體保守序列區(qū)和間隔區(qū)。

識別區(qū)Pribnow框轉(zhuǎn)錄起點16～19bp5～9bp5’TTGACATATAATA（G）3’3’AACTGTATATTAT（C）5’-35序列-10序列

圖示：原核生物啟動子結(jié)構(gòu)模式1.原核生物的啟動子原核生物的啟動子一般5

（1）轉(zhuǎn)錄起始位點:大多數(shù)細(xì)菌啟動子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的序列為CAT，轉(zhuǎn)錄從第二個堿基開始，該堿基為嘌呤堿基（A/G）。

（2）Pribnow框:

在距轉(zhuǎn)錄起始位點上游存在一個6bp保守序列：TATAAT，由于富含A、T，又稱為TATAbox，中間的堿基位于轉(zhuǎn)錄起始點上游的10bp處，又稱為–10序列區(qū)。少數(shù)Pribnow框中間堿基的位置在–9～-18之間變化。（1）轉(zhuǎn)錄起始位點:大多數(shù)細(xì)菌啟動子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的序6（3）Sextama框:在轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的另一個六聯(lián)體保守序列位于距轉(zhuǎn)錄起始位點上游35bp處，通常稱為-35區(qū)，該保守序列為TTGACA，其中前三個堿基具有較強的保守性，它是RNA聚合酶的識別位點。

（4）間隔區(qū):原核生物啟動子在轉(zhuǎn)錄起始位點與Pribnow框之間、Pribnow框與Sextama框之間存在長度不等的間隔序列。間隔序列內(nèi)部無明顯的保守性，其序列的堿基組成對啟動子的功能并不十分重要,但間隔序列的長度卻是影響啟動子功能的重要因素。啟動子強弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列

（3）Sextama框:在轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的另一個六聯(lián)7原核RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用可調(diào)控的強啟動子有Lac、Trp、PL、Tac等。

一般認(rèn)為，大腸桿菌RNA聚合酶識別并結(jié)合啟動子-35區(qū)和RNA聚合酶亞基結(jié)合，-10區(qū)和RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄起始位點附近，DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使第1和第2核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后RNA聚合酶向前推進(jìn)，形成新的RNA鏈。

原核RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。8

9根據(jù)真核基因編碼的產(chǎn)物和RNA聚合酶的種類可把真核生物的啟動子分為三類：

Ⅰ型啟動子:rRNA基因啟動子。Ⅱ型啟動子:mRNA基因啟動子。Ⅲ型啟動子:tRNA啟動子。

2．真核生物的啟動子根據(jù)真核基因編碼的產(chǎn)物和RNA聚合酶的種類可把真核生物的啟10

所屬的基因絕大多數(shù)為編碼蛋白質(zhì)。Ⅱ型啟動子也具有兩個高度保守的共有序列。其一是在－25附近的一段AT富集序列，其共有序列是TATAA，稱為TATA盒。TATA盒與原核的Pribonow盒相似，是與DNA雙鏈的解鏈有關(guān)，決定轉(zhuǎn)錄的起始。其二是在多數(shù)啟動子中，-70附近共有序列CAAT區(qū)，稱為CAAT盒，與RNA酶的結(jié)合有關(guān)。除以上兩個區(qū)域外，有些啟動子上游中含有GC盒，是轉(zhuǎn)錄因子與DNA分子此它們可影響轉(zhuǎn)錄起始的頻率。啟動子決定了被轉(zhuǎn)錄基因的啟動頻率與精確性，同時啟動子在DNA序列中的位置和方向是嚴(yán)格固定的，是由5′到3′方向。Ⅱ型啟動子：

所屬的基因絕大多數(shù)為編碼蛋白質(zhì)。Ⅱ型啟動子也具有11

轉(zhuǎn)錄終止過程包括：

（1）RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進(jìn)，RNA的延伸也停止在終止信號上；

（2）完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來；（3）RNA聚合酶從模板上釋放出來。二終止子（terminator，T）:位于基因3’端,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止過程包括：二終止子（termin12

對RNA聚合酶起強終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點，有1段富含A/T的區(qū)域和1段富含G/C的區(qū)域，G/C富含區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)，這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。并且有與A/T富含區(qū)對應(yīng)的一串U。

G/C富含區(qū)2G/C富含區(qū)1A/T富含區(qū)

DNA…NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCTTTTTTNNN……NNTTCGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN…

RNA…NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH對RNA聚合酶起強終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有13NNN

NC

GCCGCGRNA結(jié)構(gòu)GCCGGCAUAU……NNNNUUUU-OH3圖：強終止子模式圖N14

mRNA的翻譯起始效率主要由其5’端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS），它包括下列四個特征要素：

（1）位于翻譯起始密碼子上游的6至8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno(SD)序列，富含嘌呤核苷酸，通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端的富含嘧啶區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將RNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯。

三、SD序列:SD序列是核糖體RNA的識別和結(jié)合位點

。

mRNA的翻譯起始效率主要由其5’端的結(jié)構(gòu)15（2）翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子

。

（3）SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成。

（4）基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列。（2）翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱16

在組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，只有甲硫氨酸和色氨酸僅對應(yīng)唯一的密碼子，另外18種氨基酸均擁有2至6種不同的密碼子，這些編碼相同氨基酸的不同密碼子稱為簡并密碼子。

在E.coli中，并非每一種密碼子都擁有自己的tRNA，同一種tRNA分子往往可以識別多種簡并密碼子。

四、密碼子：

在組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，只有甲硫氨酸和色氨17

采用外源基因全合成的方法，按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡并密碼子。

原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有不同程度的差異性，因此，外源基因尤其是哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。

采用外源基因全合成的方法，按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)18

增強子（enhancer）是能夠增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列。

增強子的結(jié)構(gòu)類似啟動子，由多個元件組成，每個元件可以與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)通常含有多個自主的增強子，每個長50～1500bp不等。每個增強子都有一種特定的功能。

五、增強子:增強子（enhancer）是能夠增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的D19

六、翻譯終止子如果用UAAU來終止翻譯，效率會增加。

20第三節(jié)表達(dá)載體1.表達(dá)載體：

適用于在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。主要元件：強啟動子轉(zhuǎn)錄終止子SD順序增強子翻譯終止子其它調(diào)控基因

第三節(jié)表達(dá)載體1.表達(dá)載體：

適用于在受體細(xì)胞中21啟動子：建立表達(dá)載體時，選擇強啟動子。常見原核強啟動子：Plac：受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)，受IPTG的誘導(dǎo)Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。Ptac:Lac啟動子和Trp啟動子的雜合啟動子。PL和PR啟動子：噬菌體早期左/右向啟動子，受λ噬菌體cI基因負(fù)調(diào)控。溫度誘導(dǎo)。

啟動子：建立表達(dá)載體時，選擇強啟動子。常見原核強啟動子：22

（1）融合型表達(dá)載體:融合蛋白例如:pGEX系統(tǒng)

（2）非融合型表達(dá)蛋白載體:天然完整蛋白

例如:pKK223-3

（3）分泌型克隆表達(dá)載體:產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙

例如:pIN-III系統(tǒng)2.常見的表達(dá)載體（1）融合型表達(dá)載體:融合蛋白2.常見的表達(dá)載體23（1）融合型表達(dá)載體

PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因（1）融合型表達(dá)載體PSDForeignDNA融合型表達(dá)24位相載體----含有3種讀碼框的系列載體Ptac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：pGEX-1TpGEX-2TpGEX-3T位相載體位相載體----含有3種讀碼框的系列載體Ptac：IPTG誘25（2）非融合型表達(dá)載體

PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因（2）非融合型表達(dá)載體PSDForeignDNA非融合型26非融合型表達(dá)載體----pPL-LamdaPL啟動子---溫度誘導(dǎo)插入位點--HpaI非融合型表達(dá)載體----pPL-LamdaPL啟動子---溫27外源基因的表達(dá)08課件28（3）分泌型表達(dá)載體：1、主要元件：啟動子和SD序列信號肽序列：SD下游，編碼信號肽，可引導(dǎo)蛋白跨膜2、優(yōu)點：分泌表達(dá)，避免降解。

（3）分泌型表達(dá)載體：29分泌型表達(dá)載體----pINIII-ompA1分泌型表達(dá)載體----pINIII-ompA130分泌型融合表達(dá)載體----pEZZ18分泌型融合表達(dá)載體----pEZZ1831第四節(jié)真核生物基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)一、外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的必要條件：刪除內(nèi)含子和5’非編碼區(qū)外源基因置于強啟動子和SD順序控制下維持正確開放閱讀框架（ORF）mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解調(diào)控外原基因的表達(dá)，防止表達(dá)產(chǎn)物對寄主菌的毒害。

第四節(jié)真核生物基因在原核表達(dá)32二、外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式表達(dá)產(chǎn)物可能存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞外培養(yǎng)基中,其表達(dá)形式有:（1）包涵體蛋白（2）融合蛋白（3）整合型外源蛋白（4）分泌型外源蛋白。二、外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式33

外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚集在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，稱為包涵體。

包涵體主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在某些條件下也能在細(xì)胞周質(zhì)中形成。包涵體主要由蛋白質(zhì)組成，并且大部分蛋白質(zhì)為外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，它們具有正確的氨基酸序列，但空間構(gòu)象卻是錯誤的，因而一般沒有生物學(xué)活性。在包涵體中還含有受體細(xì)胞本身的一些表達(dá)產(chǎn)物，如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表達(dá)載體編碼的蛋白等。此外還包括DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。

（1）包涵體蛋白：

外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚34

以包涵體形式表達(dá)的外源蛋白最突出的優(yōu)點是易于分離純化，因為包涵體的水難溶性和密度遠(yuǎn)大于其他蛋白，通過高速離心即可與其他蛋白區(qū)分開來。包涵體對蛋白酶也表現(xiàn)出較好的抗性。

外源基因的表達(dá)08課件35

將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因閱讀框，以這種方式表達(dá)的蛋白成為融合蛋白。

受體菌蛋白位于N’端，外源蛋白位于C’端。外源蛋白與菌體自身蛋白以融合蛋白的方式表達(dá)后:穩(wěn)定性大大增加。具有較高的水溶性和一定的生物學(xué)活性。表達(dá)能以較高的效率進(jìn)行并且易于分離純化。

（2）融合蛋白將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩36在融合蛋白被表達(dá)之后，必須從融合蛋白中將原核多肽去掉。常用的有化學(xué)降解法及酶解法，一般而言，化學(xué)降解法缺乏選擇特異性，且反應(yīng)條件劇烈（如溴化氰）；而酶解法特異性較高，但切割效率不高。在融合蛋白被表達(dá)之后，必須從融合蛋白中將原核多肽去掉。常用的37

將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的特定位置上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)。

為了獲得含有整合基因的重組體，被選擇的載體一般是那些不能在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制的質(zhì)粒。

（3）整合型外源蛋白：

將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的特定位置上，38

分泌型蛋白是指外源基因的表達(dá)產(chǎn)物通過運輸或分泌的方式穿過細(xì)胞的外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。

以分泌型蛋白的形式表達(dá)外源基因具有以下優(yōu)點：

(1)簡化了發(fā)酵后處理的純化工藝；

(2)減少了外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)被蛋白酶降解的概率；

(3)通過對分泌表達(dá)的設(shè)計有利于形成正確的空間構(gòu)象，獲得有較好生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。外源基因以分泌型蛋白表達(dá)時，須在N端加入信號肽序列(由15～30個氨基酸組成)，對蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞膜外起決定性作用。

（4）分泌型外源蛋白

分泌型蛋白是指外源基因的表達(dá)產(chǎn)物通過運輸或分39三、影響外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)效率的因素：1、啟動子：建立表達(dá)載體時，選擇強啟動子。2、基因劑量：3、核糖體結(jié)合位點：SD順序與16srRNA3’末端互補程度。AUG—SD間距離。三、影響外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)效率的因素：2、基因劑量：404、提高表達(dá)水平的手段（1）、選擇合適載體，提高翻譯水平強啟動子----提高轉(zhuǎn)錄水平核糖體結(jié)合位點（ATG---SD）避免產(chǎn)物降解：分泌/融合表達(dá)細(xì)菌蛋白酶抑制劑4、提高表達(dá)水平的手段41（2）、選擇合適宿主Lac啟動子----LacI菌PL/PR--------cI857溶源菌

（3）、誘導(dǎo)表達(dá)溫度誘導(dǎo)------PL/

PRIPTG的化學(xué)誘導(dǎo)----Plac、Ptac

（4）、提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿主降解（2）、選擇合適宿主（3）、誘導(dǎo)表達(dá)42

I.調(diào)整SD序列與AUG間的距離。II.用點突變的方法改變某些堿基。III.增加mRNA的穩(wěn)定性。

5.提高翻譯水平I.調(diào)整SD序列與AUG間的距離。5.提高43

外源基因在細(xì)菌中高效表達(dá)，必然影響宿主的生長和代謝，而細(xì)胞代謝的損傷，又必然影響外源基因的表達(dá)。常用的方法有：

I.誘導(dǎo)表達(dá):使細(xì)菌的生長與外源基因的表達(dá)分開

。II.表達(dá)載體的誘導(dǎo)復(fù)制:將宿主菌的生長和表達(dá)質(zhì)粒的復(fù)制分開。

III.表達(dá)分泌蛋白

6.誘導(dǎo)表達(dá)減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷，提高外源基因的表達(dá)水平外源基因在細(xì)菌中高效表達(dá)，必然影響宿主的生長和代謝，而細(xì)44

在大腸桿菌中表達(dá)的外源蛋白往往不夠穩(wěn)定，常被細(xì)菌的蛋白酶降解，因而會使外源基因的表達(dá)水平大大降低。

有效的解決方法:

I.克隆一段原核序列，表達(dá)融合蛋白。

II.采用某種突變菌株，保護(hù)表達(dá)蛋白不被降解。

III.表達(dá)分泌蛋白。

7.提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解在大腸桿菌中表達(dá)的外源蛋白往往不夠穩(wěn)定，常被細(xì)菌的蛋白酶45五．表達(dá)產(chǎn)物的檢測：

1、特異性鑒定：熒光抗體法免疫沉淀法2、生物學(xué)活性鑒定

五．表達(dá)產(chǎn)物的檢測：46六.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的問題（1）原核細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)后，缺乏真核細(xì)胞特有的加工后處理，如糖基化修飾。（2）原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的外源蛋白，常以不溶性的包涵體形式存在，表達(dá)的蛋白質(zhì)純化時，必須經(jīng)過變性、復(fù)性處理，才能恢復(fù)其生物活性，而復(fù)性的處理，對分子量大的尤其是分子內(nèi)二硫鍵比較多的蛋白質(zhì)，其效率非常低。六.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的問題47（3）利用大腸桿菌分泌信號，可以將外源蛋白分泌到周質(zhì)或分泌到培養(yǎng)基中，但是很難大量表達(dá)分泌性蛋白，產(chǎn)量不高，信號肽不被切割或者不在特異位置上進(jìn)行切割。（4）表達(dá)的真核蛋白在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶破壞。（5）表達(dá)的真核基因，必須是mRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即cDNA，不能表達(dá)基因組DNA，因為真核基因一般有內(nèi)含子，而原核細(xì)胞又缺乏真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后加工體系，轉(zhuǎn)錄的mRNA中的內(nèi)含子不能被切除，形成不了成熟的mRNA，因此，不能表達(dá)真核蛋白質(zhì)。（6）培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生的內(nèi)毒素難以除盡，影響產(chǎn)品的純度。

（3）利用大腸桿菌分泌信號，可以將外源蛋白分泌到周質(zhì)或分泌到48謝謝謝謝49外源基因的表達(dá)08課件50外源基因表達(dá)系統(tǒng)由基因表達(dá)載體和相應(yīng)的受體細(xì)胞兩部分組成。

基因表達(dá)系統(tǒng)有原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)和真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)。第一節(jié)外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)由基因表達(dá)載體和相應(yīng)的受體細(xì)51據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：1．原核表達(dá)系統(tǒng)：將外源基因引入原核細(xì)胞，并使其在原核細(xì)胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達(dá)、合成基因產(chǎn)物的體系。2．真核表達(dá)系統(tǒng)：使外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的體系。據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：52（1）大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。

（2）基因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作和分析。（3）多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。（4）生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機制比較清楚。（5）不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象。（6）內(nèi)源蛋白酶會降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞具有如下特點：

（1）大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅53外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個環(huán)節(jié)，它是在一系列酶蛋白和調(diào)控序列的共同作用下完成的。

一、啟動子

啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。

第二節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控元件

外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個環(huán)節(jié)，它是541.原核生物的啟動子

原核生物的啟動子一般由四個部分構(gòu)成：轉(zhuǎn)錄起始位點、兩個六聯(lián)體保守序列區(qū)和間隔區(qū)。

識別區(qū)Pribnow框轉(zhuǎn)錄起點16～19bp5～9bp5’TTGACATATAATA（G）3’3’AACTGTATATTAT（C）5’-35序列-10序列

圖示：原核生物啟動子結(jié)構(gòu)模式1.原核生物的啟動子原核生物的啟動子一般55

（1）轉(zhuǎn)錄起始位點:大多數(shù)細(xì)菌啟動子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的序列為CAT，轉(zhuǎn)錄從第二個堿基開始，該堿基為嘌呤堿基（A/G）。

（2）Pribnow框:

在距轉(zhuǎn)錄起始位點上游存在一個6bp保守序列：TATAAT，由于富含A、T，又稱為TATAbox，中間的堿基位于轉(zhuǎn)錄起始點上游的10bp處，又稱為–10序列區(qū)。少數(shù)Pribnow框中間堿基的位置在–9～-18之間變化。（1）轉(zhuǎn)錄起始位點:大多數(shù)細(xì)菌啟動子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的序56（3）Sextama框:在轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的另一個六聯(lián)體保守序列位于距轉(zhuǎn)錄起始位點上游35bp處，通常稱為-35區(qū)，該保守序列為TTGACA，其中前三個堿基具有較強的保守性，它是RNA聚合酶的識別位點。

（4）間隔區(qū):原核生物啟動子在轉(zhuǎn)錄起始位點與Pribnow框之間、Pribnow框與Sextama框之間存在長度不等的間隔序列。間隔序列內(nèi)部無明顯的保守性，其序列的堿基組成對啟動子的功能并不十分重要,但間隔序列的長度卻是影響啟動子功能的重要因素。啟動子強弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列

（3）Sextama框:在轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的另一個六聯(lián)57原核RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用可調(diào)控的強啟動子有Lac、Trp、PL、Tac等。

一般認(rèn)為，大腸桿菌RNA聚合酶識別并結(jié)合啟動子-35區(qū)和RNA聚合酶亞基結(jié)合，-10區(qū)和RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄起始位點附近，DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使第1和第2核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后RNA聚合酶向前推進(jìn)，形成新的RNA鏈。

原核RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。58

59根據(jù)真核基因編碼的產(chǎn)物和RNA聚合酶的種類可把真核生物的啟動子分為三類：

Ⅰ型啟動子:rRNA基因啟動子。Ⅱ型啟動子:mRNA基因啟動子。Ⅲ型啟動子:tRNA啟動子。

2．真核生物的啟動子根據(jù)真核基因編碼的產(chǎn)物和RNA聚合酶的種類可把真核生物的啟60

所屬的基因絕大多數(shù)為編碼蛋白質(zhì)。Ⅱ型啟動子也具有兩個高度保守的共有序列。其一是在－25附近的一段AT富集序列，其共有序列是TATAA，稱為TATA盒。TATA盒與原核的Pribonow盒相似，是與DNA雙鏈的解鏈有關(guān)，決定轉(zhuǎn)錄的起始。其二是在多數(shù)啟動子中，-70附近共有序列CAAT區(qū)，稱為CAAT盒，與RNA酶的結(jié)合有關(guān)。除以上兩個區(qū)域外，有些啟動子上游中含有GC盒，是轉(zhuǎn)錄因子與DNA分子此它們可影響轉(zhuǎn)錄起始的頻率。啟動子決定了被轉(zhuǎn)錄基因的啟動頻率與精確性，同時啟動子在DNA序列中的位置和方向是嚴(yán)格固定的，是由5′到3′方向。Ⅱ型啟動子：

所屬的基因絕大多數(shù)為編碼蛋白質(zhì)。Ⅱ型啟動子也具有61

轉(zhuǎn)錄終止過程包括：

（1）RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進(jìn)，RNA的延伸也停止在終止信號上；

（2）完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來；（3）RNA聚合酶從模板上釋放出來。二終止子（terminator，T）:位于基因3’端,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止過程包括：二終止子（termin62

對RNA聚合酶起強終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點，有1段富含A/T的區(qū)域和1段富含G/C的區(qū)域，G/C富含區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)，這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。并且有與A/T富含區(qū)對應(yīng)的一串U。

G/C富含區(qū)2G/C富含區(qū)1A/T富含區(qū)

DNA…NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCTTTTTTNNN……NNTTCGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN…

RNA…NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH對RNA聚合酶起強終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有63NNN

NC

GCCGCGRNA結(jié)構(gòu)GCCGGCAUAU……NNNNUUUU-OH3圖：強終止子模式圖N64

mRNA的翻譯起始效率主要由其5’端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS），它包括下列四個特征要素：

（1）位于翻譯起始密碼子上游的6至8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno(SD)序列，富含嘌呤核苷酸，通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端的富含嘧啶區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將RNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯。

三、SD序列:SD序列是核糖體RNA的識別和結(jié)合位點

。

mRNA的翻譯起始效率主要由其5’端的結(jié)構(gòu)65（2）翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子

。

（3）SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成。

（4）基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列。（2）翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱66

在組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，只有甲硫氨酸和色氨酸僅對應(yīng)唯一的密碼子，另外18種氨基酸均擁有2至6種不同的密碼子，這些編碼相同氨基酸的不同密碼子稱為簡并密碼子。

在E.coli中，并非每一種密碼子都擁有自己的tRNA，同一種tRNA分子往往可以識別多種簡并密碼子。

四、密碼子：

在組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，只有甲硫氨酸和色氨67

采用外源基因全合成的方法，按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡并密碼子。

原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有不同程度的差異性，因此，外源基因尤其是哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。

采用外源基因全合成的方法，按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)68

增強子（enhancer）是能夠增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列。

增強子的結(jié)構(gòu)類似啟動子，由多個元件組成，每個元件可以與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)通常含有多個自主的增強子，每個長50～1500bp不等。每個增強子都有一種特定的功能。

五、增強子:增強子（enhancer）是能夠增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的D69

六、翻譯終止子如果用UAAU來終止翻譯，效率會增加。

70第三節(jié)表達(dá)載體1.表達(dá)載體：

適用于在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。主要元件：強啟動子轉(zhuǎn)錄終止子SD順序增強子翻譯終止子其它調(diào)控基因

第三節(jié)表達(dá)載體1.表達(dá)載體：

適用于在受體細(xì)胞中71啟動子：建立表達(dá)載體時，選擇強啟動子。常見原核強啟動子：Plac：受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)，受IPTG的誘導(dǎo)Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。Ptac:Lac啟動子和Trp啟動子的雜合啟動子。PL和PR啟動子：噬菌體早期左/右向啟動子，受λ噬菌體cI基因負(fù)調(diào)控。溫度誘導(dǎo)。

啟動子：建立表達(dá)載體時，選擇強啟動子。常見原核強啟動子：72

（1）融合型表達(dá)載體:融合蛋白例如:pGEX系統(tǒng)

（2）非融合型表達(dá)蛋白載體:天然完整蛋白

例如:pKK223-3

（3）分泌型克隆表達(dá)載體:產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙

例如:pIN-III系統(tǒng)2.常見的表達(dá)載體（1）融合型表達(dá)載體:融合蛋白2.常見的表達(dá)載體73（1）融合型表達(dá)載體

PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因（1）融合型表達(dá)載體PSDForeignDNA融合型表達(dá)74位相載體----含有3種讀碼框的系列載體Ptac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：pGEX-1TpGEX-2TpGEX-3T位相載體位相載體----含有3種讀碼框的系列載體Ptac：IPTG誘75（2）非融合型表達(dá)載體

PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因（2）非融合型表達(dá)載體PSDForeignDNA非融合型76非融合型表達(dá)載體----pPL-LamdaPL啟動子---溫度誘導(dǎo)插入位點--HpaI非融合型表達(dá)載體----pPL-LamdaPL啟動子---溫77外源基因的表達(dá)08課件78（3）分泌型表達(dá)載體：1、主要元件：啟動子和SD序列信號肽序列：SD下游，編碼信號肽，可引導(dǎo)蛋白跨膜2、優(yōu)點：分泌表達(dá)，避免降解。

（3）分泌型表達(dá)載體：79分泌型表達(dá)載體----pINIII-ompA1分泌型表達(dá)載體----pINIII-ompA180分泌型融合表達(dá)載體----pEZZ18分泌型融合表達(dá)載體----pEZZ1881第四節(jié)真核生物基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)一、外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的必要條件：刪除內(nèi)含子和5’非編碼區(qū)外源基因置于強啟動子和SD順序控制下維持正確開放閱讀框架（ORF）mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解調(diào)控外原基因的表達(dá)，防止表達(dá)產(chǎn)物對寄主菌的毒害。

第四節(jié)真核生物基因在原核表達(dá)82二、外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式表達(dá)產(chǎn)物可能存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞外培養(yǎng)基中,其表達(dá)形式有:（1）包涵體蛋白（2）融合蛋白（3）整合型外源蛋白（4）分泌型外源蛋白。二、外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式83

外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚集在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，稱為包涵體。

包涵體主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在某些條件下也能在細(xì)胞周質(zhì)中形成。包涵體主要由蛋白質(zhì)組成，并且大部分蛋白質(zhì)為外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，它們具有正確的氨基酸序列，但空間構(gòu)象卻是錯誤的，因而一般沒有生物學(xué)活性。在包涵體中還含有受體細(xì)胞本身的一些表達(dá)產(chǎn)物，如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表達(dá)載體編碼的蛋白等。此外還包括DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。

（1）包涵體蛋白：

外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚84

以包涵體形式表達(dá)的外源蛋白最突出的優(yōu)點是易于分離純化，因為包涵體的水難溶性和密度遠(yuǎn)大于其他蛋白，通過高速離心即可與其他蛋白區(qū)分開來。包涵體對蛋白酶也表現(xiàn)出較好的抗性。

外源基因的表達(dá)08課件85

將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因閱讀框，以這種方式表達(dá)的蛋白成為融合蛋白。

受體菌蛋白位于N’端，外源蛋白位于C’端。外源蛋白與菌體自身蛋白以融合蛋白的方式表達(dá)后:穩(wěn)定性大大增加。具有較高的水溶性和一定的生物學(xué)活性。表達(dá)能以較高的效率進(jìn)行并且易于分離純化。

（2）融合蛋白將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩86在融合蛋白被表達(dá)之后，必須從融合蛋白中將原核多肽去掉。常用的有化學(xué)降解法及酶解法，一般而言，化學(xué)降解法缺乏選擇特異性，且反應(yīng)條件劇烈（如溴化氰）；而酶解法特異性較高，但切割效率不高。在融合蛋白被表達(dá)之后，必須從融合蛋白中將原核多肽去掉。常用的87

將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的特定位置上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)。

為了獲得含有整合基因的重組體，被選擇的載體一般是那些不能在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制的質(zhì)粒。

（3）整合型外源蛋白：

將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的特定位置上，88

分泌型蛋白是指外源基因的表達(dá)產(chǎn)物通過運輸或分泌的方式穿過細(xì)胞的外膜進(jìn)入培養(yǎng)基