藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制培訓(xùn)課件

藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所葉信予deb_ye@126.com藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所藥敏試驗(yàn)質(zhì)量控制的目的保證細(xì)菌的鑒定和藥敏結(jié)果在臨床診斷和治療中的準(zhǔn)確性和可靠性滿(mǎn)足疾病診斷和治療的要求，實(shí)事求是地反映檢驗(yàn)標(biāo)本的客觀存在與國(guó)際資料具有可比性藥敏試驗(yàn)質(zhì)量控制的目的保證細(xì)菌的鑒定和藥敏結(jié)果在臨床診斷和治室間質(zhì)控

（externalqualitycontrol）是由外部機(jī)構(gòu)控制實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的客觀過(guò)程。內(nèi)容：病原菌鑒定、藥物敏感試驗(yàn)?zāi)康模罕容^差異、改進(jìn)措施、確定培訓(xùn)需求、客觀 證據(jù)、支持實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可、增加實(shí)驗(yàn)室信心、 監(jiān)督工具國(guó)內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)：國(guó)內(nèi)：衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心、上海臨床檢驗(yàn)中心 等國(guó)際：WHO/CDC─抗菌藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控 英國(guó)─環(huán)球微生物學(xué)質(zhì)控 美國(guó)─CAP質(zhì)控室間質(zhì)控

（externalqualitycontrol室內(nèi)質(zhì)控

（internalqualitycontrol)保證檢驗(yàn)質(zhì)量的高水平實(shí)驗(yàn)室工作人員的素質(zhì)微生物檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作（細(xì)菌鑒定、藥敏試驗(yàn)）標(biāo)本取材、登記、采集檢測(cè)儀器的性能培養(yǎng)基、試劑質(zhì)量、保質(zhì)期標(biāo)準(zhǔn)菌株室內(nèi)質(zhì)控

（internalqualitycontrol藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無(wú)抑制作用的方法世界衛(wèi)生組織推薦：常規(guī)的藥敏方法為紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法）科研方面主要為稀釋法，包括液體稀釋法（試管法、微量法）和瓊脂稀釋法分子生物學(xué)方法、酶試驗(yàn)藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無(wú)抑制作用的方K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法是一種定性試驗(yàn)：S、I、R操作簡(jiǎn)便，常規(guī)工作中最常應(yīng)用影響因素多存在一定局限性K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法是一種定性試驗(yàn)：S、I、R稀釋法肉湯稀釋法常量（大量）肉湯稀釋法（試管法）微量肉湯稀釋法瓊脂稀釋法是一種定量方法，結(jié)果精確操作繁瑣，要求嚴(yán)格稀釋法肉湯稀釋法E-test法定量方法操作簡(jiǎn)便，容易觀察價(jià)格昂貴E-test法定量方法分子生物學(xué)法測(cè)遺傳耐藥機(jī)制如PCR檢測(cè)葡萄球菌mecA基因等其他還有核酸雜交等方法分子生物學(xué)法測(cè)遺傳耐藥機(jī)制酶試驗(yàn)測(cè)生化耐藥機(jī)制。如碘量法、酸量法、Nitrocefin法等測(cè)β-內(nèi)酰胺酶。ESBLs、AmpC酶檢測(cè)等。β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)陽(yáng)性：可快速預(yù)報(bào)嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉氏菌對(duì)青霉素、氨芐青和羥氨芐青霉素耐藥。葡萄球菌對(duì)青霉素及氨基、羧基和酰脲基青霉素類(lèi)藥物的耐藥性。酶試驗(yàn)測(cè)生化耐藥機(jī)制。紙片瓊脂擴(kuò)散法如果僅僅基于抑菌環(huán)的有無(wú)，而不考慮抑菌環(huán)的大小，則無(wú)法檢測(cè)抗菌藥物的敏感性。只有將檢測(cè)方法和抑菌環(huán)直徑測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)化的方法相結(jié)合進(jìn)行試驗(yàn)，才能獲得可信的結(jié)果。必須采用CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行試驗(yàn)，才能獲得可重復(fù)的結(jié)果。紙片瓊脂擴(kuò)散法如果僅僅基于抑菌環(huán)的有無(wú)，而不考慮抑菌環(huán)的大小紙片瓊脂擴(kuò)散法的影響因素技術(shù)人員的操作培養(yǎng)基藥敏紙片接種物制備試驗(yàn)操作孵育條件、溫度和時(shí)間藥敏結(jié)果讀取質(zhì)控菌株紙片瓊脂擴(kuò)散法的影響因素技術(shù)人員的操作技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)訓(xùn)練能進(jìn)行檢驗(yàn)?zāi)苁炀毷褂脙x器有評(píng)價(jià)檢驗(yàn)結(jié)果有效性的能力細(xì)心、用心、責(zé)任心技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)訓(xùn)練培養(yǎng)基水解酪蛋白瓊脂（M-H瓊脂）：最適用于常規(guī)藥敏測(cè)試非苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)基。原因：藥敏試驗(yàn)顯示了可接受的批間重復(fù)性。其含有影響磺胺、甲氧芐啶和四環(huán)素敏感性試驗(yàn)結(jié)果的抑制劑濃度低。能使絕大多數(shù)非苛養(yǎng)菌生長(zhǎng)良好。已積累了用此培養(yǎng)基進(jìn)行的敏感性測(cè)試的大量數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。培養(yǎng)基水解酪蛋白瓊脂（M-H瓊脂）：最適用于常規(guī)藥敏測(cè)試非苛培養(yǎng)基苛養(yǎng)菌：需加入營(yíng)養(yǎng)添加劑5%脫纖維羊血MH瓊脂含SR158生長(zhǎng)因子的HTM培養(yǎng)基GC瓊脂基質(zhì)+1%規(guī)定的生長(zhǎng)添加劑培養(yǎng)基苛養(yǎng)菌：需加入營(yíng)養(yǎng)添加劑培養(yǎng)基pH值：室溫條件下7.2-7.4之間。因此必須在凝固之后檢測(cè)檢測(cè)方法：浸漬足夠多的瓊脂完全掩蓋pH機(jī)電極的尖端少量的瓊脂在燒杯中凝固在pH機(jī)電極的尖端的周?chē)褂帽砻骐姌O培養(yǎng)基pH值：室溫條件下7.2-7.4之間。因此必須在凝固之培養(yǎng)基pH值小于7.2，變化會(huì)顯著改變一些藥物的抑菌環(huán)大小氨基糖苷類(lèi)、克林霉素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)及喹諾酮類(lèi)抑菌環(huán)變小青霉素、四環(huán)素抑菌環(huán)變大pH值大于7.4，會(huì)出現(xiàn)相反的結(jié)果培養(yǎng)基pH值小于7.2，變化會(huì)顯著改變一些藥物的抑菌環(huán)大小培養(yǎng)基胸苷或胸腺嘧啶：過(guò)量可以逆轉(zhuǎn)磺胺類(lèi)和甲氧芐啶的抑制作用，從而產(chǎn)生更小、更不清楚的抑菌環(huán)，甚至沒(méi)有抑菌環(huán)的出現(xiàn)，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的耐藥報(bào)告糞腸球菌ATCC29212，用復(fù)方新諾明紙片測(cè)試，滿(mǎn)意結(jié)果為清晰、鮮明的抑菌環(huán)，直徑≥20mm培養(yǎng)基胸苷或胸腺嘧啶：培養(yǎng)基二價(jià)陽(yáng)離子：鈣和鎂離子：影響氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素對(duì)銅綠假單胞菌的藥敏結(jié)果。含量過(guò)高，抑菌環(huán)變小含量過(guò)低，抑菌環(huán)變大鈣離子含量的變化也會(huì)影響達(dá)托霉素的藥敏結(jié)果含量過(guò)低，抑菌環(huán)變小含量過(guò)高，抑菌環(huán)變大過(guò)量的鋅離子可使碳青霉烯類(lèi)抑菌環(huán)變小培養(yǎng)基二價(jià)陽(yáng)離子：培養(yǎng)基平板厚度一定要標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到4mm厚度9cm平板傾注瓊脂量25-30ml；15cm平板需60ml左右同一平板內(nèi)的瓊脂要均一厚度濕度：使用時(shí)，瓊脂的表面應(yīng)是潮濕的，但不能有液滴出現(xiàn)在培養(yǎng)基的表面或平板蓋子上有效期：7天儲(chǔ)存溫度：2-8℃培養(yǎng)基平板厚度一定要標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到4mm厚度藥敏紙片可靠的供應(yīng)商：OXOID、BD紙片應(yīng)當(dāng)同時(shí)至少有一個(gè)分析說(shuō)明的紙片批號(hào)和濃度的證書(shū)，并能提供用推薦的質(zhì)控細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)控的數(shù)據(jù)藥物含量必須符合CLSI規(guī)定的濃度藥敏紙片可靠的供應(yīng)商：OXOID、BD藥敏紙片紙片的儲(chǔ)存：藥敏紙片的外包裝可以確保適當(dāng)?shù)臒o(wú)水條件紙片應(yīng)冷凍在-20℃或以下的冰箱內(nèi)，密封保存。除了因工作需要而少量冷藏外（最多冷藏一個(gè)星期），尤其是含β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物、不穩(wěn)定藥物（如亞胺培南、頭孢克洛、克拉維酸復(fù)合劑）一旦藥敏紙片從密封的包裝中取出，必須放置在一個(gè)完全密封干燥的容器中儲(chǔ)存藥敏紙片紙片的儲(chǔ)存：藥敏紙片藥敏紙片的使用使用前從冰箱內(nèi)取出并除去密封包裝，平衡至室溫。這樣可以最大限度地減少熱空氣接觸冷的紙片時(shí)產(chǎn)生冷凝水只使用沒(méi)有超過(guò)制造商表明的有效期的紙片，丟棄過(guò)期的紙片藥敏紙片藥敏紙片的使用藥敏紙片藥敏紙片接種物制備濁度標(biāo)準(zhǔn)：0.5麥?zhǔn)蠞舛葮?biāo)準(zhǔn)，相當(dāng)(1-2)×108個(gè)菌落形成單位(CFU)/ml。接種物濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致某些β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥校準(zhǔn)方法肉眼觀察比濁：應(yīng)在足夠的光線下貼靠著有白色背景和對(duì)比黑線的比色卡比較接種管和0.5麥?zhǔn)蠞舛葮?biāo)準(zhǔn)管BaSO4濁度標(biāo)準(zhǔn)管：625nm處的吸光度值為0.08-0.10，每次使用需要充分震蕩，每個(gè)月更換商品化的乳膠懸浮液：每次使用之前上下顛倒混勻，有效期內(nèi)使用光學(xué)濁度儀接種物制備濁度標(biāo)準(zhǔn)：接種物制備細(xì)菌生長(zhǎng)曲線遲緩期：菌體增大，代謝活躍，為細(xì)菌的分裂增值合成、儲(chǔ)備足夠的酶、能量及中間代謝產(chǎn)物，1-4h對(duì)數(shù)期：此期細(xì)菌形態(tài)、染色、生物活性都很典型，對(duì)外界環(huán)境因素的作用敏感，抗菌素作用對(duì)該時(shí)期的細(xì)菌效果最佳,8-18h穩(wěn)定期：此期細(xì)菌形態(tài)、染色、生物活性可出現(xiàn)改變，并產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物衰亡期：生理代謝活動(dòng)趨于停滯接種物制備細(xì)菌生長(zhǎng)曲線接種物制備制備方法直接菌落懸浮法：最方便的方法?？捎糜诖蠖鄶?shù)細(xì)菌。從16-18h培養(yǎng)的瓊脂平板（應(yīng)選用非選擇性培養(yǎng)基，如血平板）上挑取數(shù)個(gè)單個(gè)菌落直接接種到肉湯或生理鹽水制成菌懸液，調(diào)整菌懸液至0.5麥?zhǔn)稀＝臃N物制備制備方法接種物制備制備方法生長(zhǎng)法：無(wú)法用上述方法制備菌懸液的情況下選用。從瓊脂平板上選擇3-5個(gè)形態(tài)相同的單個(gè)菌落，用接種環(huán)或無(wú)菌拭子將菌落轉(zhuǎn)移至含有4-5ml合適的肉湯培養(yǎng)基的試管中，如胰蛋白酶大豆肉湯。在35℃孵育培養(yǎng)，直到達(dá)到或超過(guò)0.5麥?zhǔn)蠞舛龋ㄍǔ?-6h）濁度。用無(wú)菌生理鹽水或肉湯調(diào)整新鮮生長(zhǎng)的肉湯懸液的濁度到0.5麥?zhǔn)蠞舛取＝臃N物制備制備方法試驗(yàn)操作接種平板：調(diào)整好濁度的菌懸液最好在15min內(nèi)將無(wú)菌棉簽浸取，同時(shí)在管壁上出去棉簽上多余的液體用拭子劃線整個(gè)瓊脂表面，接種于表面干燥的MHA平板上，每次旋轉(zhuǎn)平板約60°，以確保每次接種均勻分布，最后在瓊脂平板的邊緣涂抹一圈蓋子可半開(kāi)3-5min，但不可超過(guò)15min，以便放置藥敏紙片前，使瓊脂吸收表面多余的水分試驗(yàn)操作接種平板：試驗(yàn)操作放置紙片：將預(yù)先設(shè)定好并已經(jīng)平衡至溫度的藥敏紙片分置在已接種細(xì)菌的瓊脂表面每個(gè)紙片必須壓下以確保與瓊脂表面完全接觸。無(wú)論是單獨(dú)放置或使用紙片分配設(shè)備，紙片必須分布均勻，兩紙片圓心的距離不少于24mm最好在預(yù)期的產(chǎn)生小的抑菌環(huán)的紙片旁邊放置產(chǎn)生大的抑菌環(huán)的紙片，以避免重疊區(qū)紙片距離瓊脂邊緣的距離同樣重要，如果太靠近邊緣，抑菌環(huán)可能不完整，建議距離平板邊緣15mm。藥敏紙片一旦與瓊脂表面接觸，就不可再移動(dòng)放置紙片后15min內(nèi)倒置平板進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)操作放置紙片：試驗(yàn)操作孵育溫度：（35

±2）℃孵育條件：除嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌和鏈球菌外，孵育不需要CO2CO2濃度變化會(huì)顯著改變一些藥物的抑菌環(huán)大小孵育時(shí)間：16-18h測(cè)試苯唑西林或萬(wàn)古霉素對(duì)葡萄球菌屬，或萬(wàn)古霉素對(duì)腸球菌屬的敏感性，孵育時(shí)間必須達(dá)到24h試驗(yàn)操作孵育溫度：（35±2）℃細(xì)菌接種物準(zhǔn)備方法接種培養(yǎng)基紙片數(shù)量培養(yǎng)溫度(℃)5%CO2培養(yǎng)時(shí)間（小時(shí)）100mm150mm一般需氧菌直接菌落懸浮法，生長(zhǎng)法MHA51235±2不需要16-18肺炎鏈球菌和其他鏈球菌直接菌落懸浮法5%羊血MHA4935±2，不超過(guò)37需要20-24流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌直接菌落懸浮法含SR158因子的HTM4935±2需要16-18腦膜炎奈瑟菌直接菌落懸浮法5%羊血MHA2535±2，不超過(guò)37需要20-24淋病奈瑟菌直接菌落懸浮法GC瓊脂基質(zhì)+1%規(guī)定的生長(zhǎng)添加物4936±1，不超過(guò)37需要16-18細(xì)菌接種物準(zhǔn)備方法接種培養(yǎng)基紙片數(shù)量培養(yǎng)溫度(℃)5%CO2平板結(jié)果判讀培養(yǎng)后的平板觀察細(xì)菌的涂布是否滿(mǎn)意接種是否正確產(chǎn)生的抑菌環(huán)是否均勻?yàn)閳A形菌苔是否融合生長(zhǎng)如果可見(jiàn)單個(gè)菌落，說(shuō)明接種量過(guò)稀，必須重復(fù)試驗(yàn)平板結(jié)果判讀培養(yǎng)后的平板觀察平板結(jié)果判讀測(cè)量方法：用肉眼判讀，測(cè)量完全抑制區(qū)的直徑，包括紙片的直徑采用游標(biāo)卡或尺子在培養(yǎng)基的背面測(cè)量將培養(yǎng)基放在一個(gè)黑色不反光的背景上，并用反射光觀察如使用血平板，應(yīng)除去蓋子并用反射光照射，在瓊脂的上方測(cè)量抑菌環(huán)平板結(jié)果判讀測(cè)量方法：抑菌圈直徑閱讀—游標(biāo)卡尺抑菌圈直徑閱讀—游標(biāo)卡尺抑菌圈直徑閱讀—直尺抑菌圈直徑閱讀—直尺平板結(jié)果判讀測(cè)量直徑?jīng)]有肉眼可見(jiàn)的明顯的生長(zhǎng)區(qū)即可認(rèn)為抑菌圈邊緣。只能在放大鏡下觀察到的細(xì)小菌落忽略不計(jì)。在一個(gè)明顯抑菌環(huán)內(nèi)有分散的菌落生長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)該從原始菌落移種后重新測(cè)試。如分散的菌落依然在抑菌環(huán)內(nèi)生長(zhǎng)，則應(yīng)測(cè)量無(wú)菌落的抑菌環(huán)內(nèi)徑。變形桿菌屬細(xì)菌可遷徙生長(zhǎng)到某種抗菌藥物抑菌環(huán)內(nèi)，忽略明顯的抑菌環(huán)內(nèi)薄紗樣遷徙生長(zhǎng)。測(cè)量血平板上的抑菌環(huán)時(shí)，測(cè)量的是生長(zhǎng)抑菌圈，而不是溶血抑制圈。測(cè)量含甲氧芐啶和磺胺類(lèi)藥物的抑菌圈時(shí)，忽略少量生長(zhǎng)，測(cè)量比較明顯的邊緣，以確定抑菌環(huán)的直徑。平板結(jié)果判讀測(cè)量直徑細(xì)菌藥敏紙片孵育時(shí)間觀察結(jié)果金黃色葡萄球菌苯唑西林和萬(wàn)古霉素24h用透射光（平板舉向光源）來(lái)檢查明顯抑菌環(huán)內(nèi)有無(wú)耐藥菌落的少量生長(zhǎng)，抑菌環(huán)內(nèi)任何區(qū)域出現(xiàn)可辨別的生長(zhǎng)都判為苯唑西林或萬(wàn)古霉素耐藥頭孢西丁16-18h讀取時(shí)使用反射光葡萄球菌屬利奈唑胺16-18h讀取直徑是用透射光，抑菌環(huán)內(nèi)任何區(qū)域出現(xiàn)可辨別的生長(zhǎng)都判為耐藥腸球菌屬萬(wàn)古霉素24h用透射光仔細(xì)檢查抑菌環(huán)內(nèi)是否有菌落生長(zhǎng)，出現(xiàn)任何菌落意味著耐藥細(xì)菌藥敏紙片孵育時(shí)間觀察結(jié)果金黃色葡萄球菌苯唑西林和萬(wàn)古霉素藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制培訓(xùn)課件藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制培訓(xùn)課件結(jié)果解釋根據(jù)CLSI推薦的判斷標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性有判斷標(biāo)準(zhǔn)：敏感、中介、耐藥只有敏感的折點(diǎn)：敏感同屬細(xì)菌不同種判斷標(biāo)準(zhǔn)可能不同結(jié)果解釋根據(jù)CLSI推薦的判斷標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感不可能出現(xiàn)的藥敏現(xiàn)象金葡菌：青霉素S,苯唑西林R，萬(wàn)古霉素R腸桿菌科細(xì)菌：第三代頭孢菌素R，第一、第二代頭孢菌素S嗜麥芽窄食單胞菌：出現(xiàn)碳青霉烯類(lèi)S不可能出現(xiàn)的藥敏現(xiàn)象金葡菌：青霉素S,苯唑西林R，萬(wàn)古藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制培訓(xùn)課件藥敏質(zhì)控目的藥敏試驗(yàn)過(guò)程的精密度（可重復(fù)性）和準(zhǔn)確度在試驗(yàn)中所作用的試劑的性能。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和結(jié)果判定操作者的工作情況。責(zé)任制造商：確保制造出合適的產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室：確保試驗(yàn)很好地維護(hù)和執(zhí)行方法標(biāo)準(zhǔn)菌株藥敏質(zhì)控目的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株使用精心挑選的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株實(shí)驗(yàn)在可接受的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)操作進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果可靠每個(gè)質(zhì)控菌應(yīng)從認(rèn)可的來(lái)源處獲得（美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)，ATCC）適用于抗菌藥物和標(biāo)準(zhǔn)方法（CLSI推薦）質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株使用精心挑選的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株分類(lèi)：日常檢測(cè)質(zhì)控菌株：確保檢測(cè)系統(tǒng)正常運(yùn)行，并且檢測(cè)結(jié)果在制定的范圍內(nèi)大腸埃希菌ATCC25922金黃色葡萄球菌ATCC25923等補(bǔ)充的質(zhì)控菌株：用于評(píng)價(jià)某一特定情況下實(shí)驗(yàn)或者檢測(cè)系統(tǒng)的特性，或稱(chēng)為備用質(zhì)控菌株嗜血桿菌ATCC10211肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705等質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株分類(lèi)：質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)和儲(chǔ)存使用和檢測(cè)臨床分離株相同的材料和方法，按照標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法，來(lái)檢測(cè)質(zhì)控菌株合理儲(chǔ)存和維護(hù)，確保質(zhì)控菌具有可接受的性能儲(chǔ)存菌株：長(zhǎng)期貯存，可用Microbank,40%甘油肉湯、脫纖維羊血或脫脂牛奶，于-70℃低溫度保存。半儲(chǔ)存菌株：使用中的質(zhì)控菌應(yīng)貯存在胰大豆瓊脂（非苛養(yǎng)菌）或營(yíng)養(yǎng)豐富的巧克力瓊脂斜面（苛養(yǎng)菌），4-8℃保存，每周傳代一次。應(yīng)用菌株：每次使用前應(yīng)把半儲(chǔ)存菌株傳代到相應(yīng)的平皿上使其獲得單個(gè)菌落。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)和儲(chǔ)存質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株防止質(zhì)控菌株的變異保存菌株應(yīng)加保護(hù)液（脫脂奶粉或甘油）盡量減少轉(zhuǎn)種次數(shù)，一般不要超過(guò)6次孵育時(shí)間不要超過(guò)對(duì)數(shù)期避免菌種被污染不要從藥敏試驗(yàn)的瓊脂平板上取細(xì)菌使用如果出現(xiàn)無(wú)法解釋的結(jié)果表明細(xì)菌的天然敏感性已經(jīng)改變，需要制備新的原代培養(yǎng)物質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株防止質(zhì)控菌株的變異質(zhì)控菌株生物特性紙片瓊脂擴(kuò)散法其他大腸埃希菌ATCC25922β-內(nèi)酰胺酶陰性非苛養(yǎng)革蘭陰性菌腦膜炎奈瑟菌大腸埃希菌ATCC35218含質(zhì)粒編碼的TEM-1β–內(nèi)酰胺酶（非ESBL）β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物流感嗜血桿菌ATCC49247β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥菌株嗜血桿菌嗜血桿菌ATCC49766氨芐西林敏感嗜血桿菌（對(duì)某些β-內(nèi)酰胺類(lèi)更有代表性）肺炎克雷伯菌ATCC700603含SHV-18型ESBLESBL篩選和確證實(shí)驗(yàn)銅綠假單胞菌ATCC27853含誘導(dǎo)的AmpC非苛養(yǎng)革蘭陰性菌評(píng)價(jià)每批MH培養(yǎng)基中陽(yáng)離子含量適合性金黃色葡萄球菌ATCC25923β-內(nèi)酰胺酶陰性mecA陰性非苛養(yǎng)革蘭陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌ATCC43300苯唑西林耐藥，mecA陰性頭孢西丁紙片肺炎鏈球菌ATCC49619青霉素結(jié)合蛋白改變導(dǎo)致青霉素中介肺炎鏈球菌其他鏈球菌腦膜炎奈瑟菌常用質(zhì)控菌株質(zhì)控菌株生物特性紙片瓊脂擴(kuò)散法其他大腸埃希菌ATCC25Q：沙門(mén)菌屬細(xì)菌在進(jìn)行紙片法藥敏試驗(yàn)時(shí)應(yīng)該選擇哪種ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株？A：1.銅綠假單胞菌 ATCC278532.金黃色葡萄球菌ATCC259233.肺炎克雷伯菌ATCC7006034.大腸埃希菌 ATCC352185.大腸埃希菌 ATCC25922（√）Q：沙門(mén)菌屬細(xì)菌在進(jìn)行紙片法藥敏試驗(yàn)時(shí)應(yīng)該選擇哪種ATCC標(biāo)Q：為什么大腸埃希菌ATCC35218會(huì)出現(xiàn)氨芐西林耐藥，氨芐西林/舒巴坦敏感？A：

因?yàn)榇竽c埃希菌ATCC35218會(huì)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，所以氨芐西林對(duì)其沒(méi)有抗菌作用而表現(xiàn)為耐藥，但舒巴坦為β-內(nèi)酰胺酶的酶抑制劑，可抑制大腸埃希菌ATCC35218產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶，因此又恢復(fù)抗菌活性，因此氨芐西林/舒巴坦表現(xiàn)為敏感。Q：為什么大腸埃希菌ATCC35218會(huì)出現(xiàn)氨芐西林耐藥，質(zhì)控菌株的傳代及使用新儲(chǔ)存物或凍存物用合適的培養(yǎng)基與適宜的孵育條件進(jìn)行傳代培養(yǎng)（首次傳代）正確傳代培養(yǎng)、孵育和保存質(zhì)控菌株。用分離的單個(gè)菌落作為第1天道第7天的試驗(yàn)用質(zhì)控菌。每天準(zhǔn)備新的傳代培養(yǎng)物（從第1天試驗(yàn)用培養(yǎng)物分離）。相應(yīng)的菌株類(lèi)型保存在適宜的溫度下。每天測(cè)試工作日使用新鮮的試驗(yàn)用培養(yǎng)物。重復(fù)試驗(yàn)至第3周和第4周。第4周后，丟棄傳代培養(yǎng)物并重新溶解新儲(chǔ)存物或凍存物中以獲取質(zhì)控菌株。備注：1.冷凍或凍干培養(yǎng)物傳代兩次后使用。2.進(jìn)行質(zhì)控試驗(yàn)，選擇從試驗(yàn)用培養(yǎng)物中分離的單個(gè)菌落。3.如果污染或疑有問(wèn)題，準(zhǔn)備新的首次傳代物、測(cè)試用培養(yǎng)物，或者獲取新的凍存物。4.某些菌株有必要每?jī)芍苤匦聹?zhǔn)備新的傳代物（如銅綠ATCC27853，肺鏈ATCC49619）質(zhì)控菌株的傳代及使用新儲(chǔ)存物或凍存物用合適的培養(yǎng)基與適宜的孵藥敏質(zhì)控頻率每日測(cè)試：連續(xù)檢測(cè)每種抗菌藥物/細(xì)菌組合所獲得的30個(gè)結(jié)果中，只要3個(gè)以下超出CLSI所提供的可接受結(jié)果范圍，每天質(zhì)控的結(jié)果是滿(mǎn)意的。如果超出3個(gè)，需要采取糾正措施。每周測(cè)試連續(xù)20-30天質(zhì)控結(jié)果均在范圍內(nèi)可改為一周一次連續(xù)30天質(zhì)控 超出范圍次數(shù)小于3次連續(xù)20天質(zhì)控 超出范圍次數(shù)小于1次若出現(xiàn)結(jié)果不在可接受范圍內(nèi)，需要采取糾正措施。藥敏質(zhì)控頻率糾正措施明顯原因QC菌株：使用不正確、不合理儲(chǔ)存、污染、菌株發(fā)生突變、接種濃度不正確藥敏平板：污染、過(guò)厚或過(guò)薄、平板損壞藥物紙片：使用錯(cuò)誤、過(guò)期、放置不當(dāng)培養(yǎng)條件：錯(cuò)誤的培養(yǎng)溫度或環(huán)境結(jié)果判讀或解釋不正確、抄寫(xiě)錯(cuò)誤解決方式：當(dāng)天重復(fù)相同試驗(yàn)，如在質(zhì)控范圍內(nèi)仍繼續(xù)一周一次質(zhì)控，如果是質(zhì)控菌問(wèn)題，盡快重新傳代重新測(cè)試。糾正措施明顯原因糾正措施不明原因解決方式：當(dāng)天重復(fù)試驗(yàn)并連續(xù)5天檢測(cè)，同時(shí)恢復(fù)每日質(zhì)控持續(xù)到解決問(wèn)題如5次結(jié)果都在范圍內(nèi)，繼續(xù)一周一次質(zhì)控如仍有超出質(zhì)控范圍，盡可能獲得新的質(zhì)控菌和新的材料，尋找問(wèn)題所在（制造商、試驗(yàn)方法），20-30天連續(xù)質(zhì)控糾正措施不明原因改變條件對(duì)質(zhì)控頻率改變的要求要求質(zhì)控的連續(xù)天數(shù)測(cè)定改變1520或30藥敏紙片使用新購(gòu)產(chǎn)品或新批號(hào)☆使用新的制造商產(chǎn)品☆增加新的品種☆培養(yǎng)基（配置藥敏平板）使用新購(gòu)產(chǎn)品或新批號(hào)☆使用新的制造商產(chǎn)品☆改變條件對(duì)質(zhì)控頻率改變的要求要求質(zhì)控的連續(xù)天數(shù)測(cè)定改變152改變條件對(duì)質(zhì)控頻率的要求要求質(zhì)控的連續(xù)天數(shù)測(cè)定改變1520或30接種物制備變更接種物制備方法/使用有自身QC方案的設(shè)備來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化制備接種物☆校準(zhǔn)操作者技術(shù)☆測(cè)量抑菌圈變更抑菌圈直徑測(cè)量方法☆儀器/軟件軟件的更新☆儀器的修理☆改變條件對(duì)質(zhì)控頻率的要求要求質(zhì)控的連續(xù)天數(shù)測(cè)定改變1520或質(zhì)量控制是藥敏試驗(yàn)結(jié)果正確的重要保證

質(zhì)量控制是藥敏試驗(yàn)結(jié)果正確的謝謝!謝謝!藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所葉信予deb_ye@126.com藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所藥敏試驗(yàn)質(zhì)量控制的目的保證細(xì)菌的鑒定和藥敏結(jié)果在臨床診斷和治療中的準(zhǔn)確性和可靠性滿(mǎn)足疾病診斷和治療的要求，實(shí)事求是地反映檢驗(yàn)標(biāo)本的客觀存在與國(guó)際資料具有可比性藥敏試驗(yàn)質(zhì)量控制的目的保證細(xì)菌的鑒定和藥敏結(jié)果在臨床診斷和治室間質(zhì)控

（externalqualitycontrol）是由外部機(jī)構(gòu)控制實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的客觀過(guò)程。內(nèi)容：病原菌鑒定、藥物敏感試驗(yàn)?zāi)康模罕容^差異、改進(jìn)措施、確定培訓(xùn)需求、客觀 證據(jù)、支持實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可、增加實(shí)驗(yàn)室信心、 監(jiān)督工具國(guó)內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)：國(guó)內(nèi)：衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心、上海臨床檢驗(yàn)中心 等國(guó)際：WHO/CDC─抗菌藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控 英國(guó)─環(huán)球微生物學(xué)質(zhì)控 美國(guó)─CAP質(zhì)控室間質(zhì)控

（externalqualitycontrol室內(nèi)質(zhì)控

（internalqualitycontrol)保證檢驗(yàn)質(zhì)量的高水平實(shí)驗(yàn)室工作人員的素質(zhì)微生物檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作（細(xì)菌鑒定、藥敏試驗(yàn)）標(biāo)本取材、登記、采集檢測(cè)儀器的性能培養(yǎng)基、試劑質(zhì)量、保質(zhì)期標(biāo)準(zhǔn)菌株室內(nèi)質(zhì)控

（internalqualitycontrol藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無(wú)抑制作用的方法世界衛(wèi)生組織推薦：常規(guī)的藥敏方法為紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法）科研方面主要為稀釋法，包括液體稀釋法（試管法、微量法）和瓊脂稀釋法分子生物學(xué)方法、酶試驗(yàn)藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無(wú)抑制作用的方K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法是一種定性試驗(yàn)：S、I、R操作簡(jiǎn)便，常規(guī)工作中最常應(yīng)用影響因素多存在一定局限性K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法是一種定性試驗(yàn)：S、I、R稀釋法肉湯稀釋法常量（大量）肉湯稀釋法（試管法）微量肉湯稀釋法瓊脂稀釋法是一種定量方法，結(jié)果精確操作繁瑣，要求嚴(yán)格稀釋法肉湯稀釋法E-test法定量方法操作簡(jiǎn)便，容易觀察價(jià)格昂貴E-test法定量方法分子生物學(xué)法測(cè)遺傳耐藥機(jī)制如PCR檢測(cè)葡萄球菌mecA基因等其他還有核酸雜交等方法分子生物學(xué)法測(cè)遺傳耐藥機(jī)制酶試驗(yàn)測(cè)生化耐藥機(jī)制。如碘量法、酸量法、Nitrocefin法等測(cè)β-內(nèi)酰胺酶。ESBLs、AmpC酶檢測(cè)等。β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)陽(yáng)性：可快速預(yù)報(bào)嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉氏菌對(duì)青霉素、氨芐青和羥氨芐青霉素耐藥。葡萄球菌對(duì)青霉素及氨基、羧基和酰脲基青霉素類(lèi)藥物的耐藥性。酶試驗(yàn)測(cè)生化耐藥機(jī)制。紙片瓊脂擴(kuò)散法如果僅僅基于抑菌環(huán)的有無(wú)，而不考慮抑菌環(huán)的大小，則無(wú)法檢測(cè)抗菌藥物的敏感性。只有將檢測(cè)方法和抑菌環(huán)直徑測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)化的方法相結(jié)合進(jìn)行試驗(yàn)，才能獲得可信的結(jié)果。必須采用CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行試驗(yàn)，才能獲得可重復(fù)的結(jié)果。紙片瓊脂擴(kuò)散法如果僅僅基于抑菌環(huán)的有無(wú)，而不考慮抑菌環(huán)的大小紙片瓊脂擴(kuò)散法的影響因素技術(shù)人員的操作培養(yǎng)基藥敏紙片接種物制備試驗(yàn)操作孵育條件、溫度和時(shí)間藥敏結(jié)果讀取質(zhì)控菌株紙片瓊脂擴(kuò)散法的影響因素技術(shù)人員的操作技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)訓(xùn)練能進(jìn)行檢驗(yàn)?zāi)苁炀毷褂脙x器有評(píng)價(jià)檢驗(yàn)結(jié)果有效性的能力細(xì)心、用心、責(zé)任心技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)訓(xùn)練培養(yǎng)基水解酪蛋白瓊脂（M-H瓊脂）：最適用于常規(guī)藥敏測(cè)試非苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)基。原因：藥敏試驗(yàn)顯示了可接受的批間重復(fù)性。其含有影響磺胺、甲氧芐啶和四環(huán)素敏感性試驗(yàn)結(jié)果的抑制劑濃度低。能使絕大多數(shù)非苛養(yǎng)菌生長(zhǎng)良好。已積累了用此培養(yǎng)基進(jìn)行的敏感性測(cè)試的大量數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。培養(yǎng)基水解酪蛋白瓊脂（M-H瓊脂）：最適用于常規(guī)藥敏測(cè)試非苛培養(yǎng)基苛養(yǎng)菌：需加入營(yíng)養(yǎng)添加劑5%脫纖維羊血MH瓊脂含SR158生長(zhǎng)因子的HTM培養(yǎng)基GC瓊脂基質(zhì)+1%規(guī)定的生長(zhǎng)添加劑培養(yǎng)基苛養(yǎng)菌：需加入營(yíng)養(yǎng)添加劑培養(yǎng)基pH值：室溫條件下7.2-7.4之間。因此必須在凝固之后檢測(cè)檢測(cè)方法：浸漬足夠多的瓊脂完全掩蓋pH機(jī)電極的尖端少量的瓊脂在燒杯中凝固在pH機(jī)電極的尖端的周?chē)褂帽砻骐姌O培養(yǎng)基pH值：室溫條件下7.2-7.4之間。因此必須在凝固之培養(yǎng)基pH值小于7.2，變化會(huì)顯著改變一些藥物的抑菌環(huán)大小氨基糖苷類(lèi)、克林霉素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)及喹諾酮類(lèi)抑菌環(huán)變小青霉素、四環(huán)素抑菌環(huán)變大pH值大于7.4，會(huì)出現(xiàn)相反的結(jié)果培養(yǎng)基pH值小于7.2，變化會(huì)顯著改變一些藥物的抑菌環(huán)大小培養(yǎng)基胸苷或胸腺嘧啶：過(guò)量可以逆轉(zhuǎn)磺胺類(lèi)和甲氧芐啶的抑制作用，從而產(chǎn)生更小、更不清楚的抑菌環(huán)，甚至沒(méi)有抑菌環(huán)的出現(xiàn)，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的耐藥報(bào)告糞腸球菌ATCC29212，用復(fù)方新諾明紙片測(cè)試，滿(mǎn)意結(jié)果為清晰、鮮明的抑菌環(huán)，直徑≥20mm培養(yǎng)基胸苷或胸腺嘧啶：培養(yǎng)基二價(jià)陽(yáng)離子：鈣和鎂離子：影響氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素對(duì)銅綠假單胞菌的藥敏結(jié)果。含量過(guò)高，抑菌環(huán)變小含量過(guò)低，抑菌環(huán)變大鈣離子含量的變化也會(huì)影響達(dá)托霉素的藥敏結(jié)果含量過(guò)低，抑菌環(huán)變小含量過(guò)高，抑菌環(huán)變大過(guò)量的鋅離子可使碳青霉烯類(lèi)抑菌環(huán)變小培養(yǎng)基二價(jià)陽(yáng)離子：培養(yǎng)基平板厚度一定要標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到4mm厚度9cm平板傾注瓊脂量25-30ml；15cm平板需60ml左右同一平板內(nèi)的瓊脂要均一厚度濕度：使用時(shí)，瓊脂的表面應(yīng)是潮濕的，但不能有液滴出現(xiàn)在培養(yǎng)基的表面或平板蓋子上有效期：7天儲(chǔ)存溫度：2-8℃培養(yǎng)基平板厚度一定要標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到4mm厚度藥敏紙片可靠的供應(yīng)商：OXOID、BD紙片應(yīng)當(dāng)同時(shí)至少有一個(gè)分析說(shuō)明的紙片批號(hào)和濃度的證書(shū)，并能提供用推薦的質(zhì)控細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)控的數(shù)據(jù)藥物含量必須符合CLSI規(guī)定的濃度藥敏紙片可靠的供應(yīng)商：OXOID、BD藥敏紙片紙片的儲(chǔ)存：藥敏紙片的外包裝可以確保適當(dāng)?shù)臒o(wú)水條件紙片應(yīng)冷凍在-20℃或以下的冰箱內(nèi)，密封保存。除了因工作需要而少量冷藏外（最多冷藏一個(gè)星期），尤其是含β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物、不穩(wěn)定藥物（如亞胺培南、頭孢克洛、克拉維酸復(fù)合劑）一旦藥敏紙片從密封的包裝中取出，必須放置在一個(gè)完全密封干燥的容器中儲(chǔ)存藥敏紙片紙片的儲(chǔ)存：藥敏紙片藥敏紙片的使用使用前從冰箱內(nèi)取出并除去密封包裝，平衡至室溫。這樣可以最大限度地減少熱空氣接觸冷的紙片時(shí)產(chǎn)生冷凝水只使用沒(méi)有超過(guò)制造商表明的有效期的紙片，丟棄過(guò)期的紙片藥敏紙片藥敏紙片的使用藥敏紙片藥敏紙片接種物制備濁度標(biāo)準(zhǔn)：0.5麥?zhǔn)蠞舛葮?biāo)準(zhǔn)，相當(dāng)(1-2)×108個(gè)菌落形成單位(CFU)/ml。接種物濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致某些β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥校準(zhǔn)方法肉眼觀察比濁：應(yīng)在足夠的光線下貼靠著有白色背景和對(duì)比黑線的比色卡比較接種管和0.5麥?zhǔn)蠞舛葮?biāo)準(zhǔn)管BaSO4濁度標(biāo)準(zhǔn)管：625nm處的吸光度值為0.08-0.10，每次使用需要充分震蕩，每個(gè)月更換商品化的乳膠懸浮液：每次使用之前上下顛倒混勻，有效期內(nèi)使用光學(xué)濁度儀接種物制備濁度標(biāo)準(zhǔn)：接種物制備細(xì)菌生長(zhǎng)曲線遲緩期：菌體增大，代謝活躍，為細(xì)菌的分裂增值合成、儲(chǔ)備足夠的酶、能量及中間代謝產(chǎn)物，1-4h對(duì)數(shù)期：此期細(xì)菌形態(tài)、染色、生物活性都很典型，對(duì)外界環(huán)境因素的作用敏感，抗菌素作用對(duì)該時(shí)期的細(xì)菌效果最佳,8-18h穩(wěn)定期：此期細(xì)菌形態(tài)、染色、生物活性可出現(xiàn)改變，并產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物衰亡期：生理代謝活動(dòng)趨于停滯接種物制備細(xì)菌生長(zhǎng)曲線接種物制備制備方法直接菌落懸浮法：最方便的方法?？捎糜诖蠖鄶?shù)細(xì)菌。從16-18h培養(yǎng)的瓊脂平板（應(yīng)選用非選擇性培養(yǎng)基，如血平板）上挑取數(shù)個(gè)單個(gè)菌落直接接種到肉湯或生理鹽水制成菌懸液，調(diào)整菌懸液至0.5麥?zhǔn)稀＝臃N物制備制備方法接種物制備制備方法生長(zhǎng)法：無(wú)法用上述方法制備菌懸液的情況下選用。從瓊脂平板上選擇3-5個(gè)形態(tài)相同的單個(gè)菌落，用接種環(huán)或無(wú)菌拭子將菌落轉(zhuǎn)移至含有4-5ml合適的肉湯培養(yǎng)基的試管中，如胰蛋白酶大豆肉湯。在35℃孵育培養(yǎng)，直到達(dá)到或超過(guò)0.5麥?zhǔn)蠞舛龋ㄍǔ?-6h）濁度。用無(wú)菌生理鹽水或肉湯調(diào)整新鮮生長(zhǎng)的肉湯懸液的濁度到0.5麥?zhǔn)蠞舛取＝臃N物制備制備方法試驗(yàn)操作接種平板：調(diào)整好濁度的菌懸液最好在15min內(nèi)將無(wú)菌棉簽浸取，同時(shí)在管壁上出去棉簽上多余的液體用拭子劃線整個(gè)瓊脂表面，接種于表面干燥的MHA平板上，每次旋轉(zhuǎn)平板約60°，以確保每次接種均勻分布，最后在瓊脂平板的邊緣涂抹一圈蓋子可半開(kāi)3-5min，但不可超過(guò)15min，以便放置藥敏紙片前，使瓊脂吸收表面多余的水分試驗(yàn)操作接種平板：試驗(yàn)操作放置紙片：將預(yù)先設(shè)定好并已經(jīng)平衡至溫度的藥敏紙片分置在已接種細(xì)菌的瓊脂表面每個(gè)紙片必須壓下以確保與瓊脂表面完全接觸。無(wú)論是單獨(dú)放置或使用紙片分配設(shè)備，紙片必須分布均勻，兩紙片圓心的距離不少于24mm最好在預(yù)期的產(chǎn)生小的抑菌環(huán)的紙片旁邊放置產(chǎn)生大的抑菌環(huán)的紙片，以避免重疊區(qū)紙片距離瓊脂邊緣的距離同樣重要，如果太靠近邊緣，抑菌環(huán)可能不完整，建議距離平板邊緣15mm。藥敏紙片一旦與瓊脂表面接觸，就不可再移動(dòng)放置紙片后15min內(nèi)倒置平板進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)操作放置紙片：試驗(yàn)操作孵育溫度：（35

±2）℃孵育條件：除嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌和鏈球菌外，孵育不需要CO2CO2濃度變化會(huì)顯著改變一些藥物的抑菌環(huán)大小孵育時(shí)間：16-18h測(cè)試苯唑西林或萬(wàn)古霉素對(duì)葡萄球菌屬，或萬(wàn)古霉素對(duì)腸球菌屬的敏感性，孵育時(shí)間必須達(dá)到24h試驗(yàn)操作孵育溫度：（35±2）℃細(xì)菌接種物準(zhǔn)備方法接種培養(yǎng)基紙片數(shù)量培養(yǎng)溫度(℃)5%CO2培養(yǎng)時(shí)間（小時(shí)）100mm150mm一般需氧菌直接菌落懸浮法，生長(zhǎng)法MHA51235±2不需要16-18肺炎鏈球菌和其他鏈球菌直接菌落懸浮法5%羊血MHA4935±2，不超過(guò)37需要20-24流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌直接菌落懸浮法含SR158因子的HTM4935±2需要16-18腦膜炎奈瑟菌直接菌落懸浮法5%羊血MHA2535±2，不超過(guò)37需要20-24淋病奈瑟菌直接菌落懸浮法GC瓊脂基質(zhì)+1%規(guī)定的生長(zhǎng)添加物4936±1，不超過(guò)37需要16-18細(xì)菌接種物準(zhǔn)備方法接種培養(yǎng)基紙片數(shù)量培養(yǎng)溫度(℃)5%CO2平板結(jié)果判讀培養(yǎng)后的平板觀察細(xì)菌的涂布是否滿(mǎn)意接種是否正確產(chǎn)生的抑菌環(huán)是否均勻?yàn)閳A形菌苔是否融合生長(zhǎng)如果可見(jiàn)單個(gè)菌落，說(shuō)明接種量過(guò)稀，必須重復(fù)試驗(yàn)平板結(jié)果判讀培養(yǎng)后的平板觀察平板結(jié)果判讀測(cè)量方法：用肉眼判讀，測(cè)量完全抑制區(qū)的直徑，包括紙片的直徑采用游標(biāo)卡或尺子在培養(yǎng)基的背面測(cè)量將培養(yǎng)基放在一個(gè)黑色不反光的背景上，并用反射光觀察如使用血平板，應(yīng)除去蓋子并用反射光照射，在瓊脂的上方測(cè)量抑菌環(huán)平板結(jié)果判讀測(cè)量方法：抑菌圈直徑閱讀—游標(biāo)卡尺抑菌圈直徑閱讀—游標(biāo)卡尺抑菌圈直徑閱讀—直尺抑菌圈直徑閱讀—直尺平板結(jié)果判讀測(cè)量直徑?jīng)]有肉眼可見(jiàn)的明顯的生長(zhǎng)區(qū)即可認(rèn)為抑菌圈邊緣。只能在放大鏡下觀察到的細(xì)小菌落忽略不計(jì)。在一個(gè)明顯抑菌環(huán)內(nèi)有分散的菌落生長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)該從原始菌落移種后重新測(cè)試。如分散的菌落依然在抑菌環(huán)內(nèi)生長(zhǎng)，則應(yīng)測(cè)量無(wú)菌落的抑菌環(huán)內(nèi)徑。變形桿菌屬細(xì)菌可遷徙生長(zhǎng)到某種抗菌藥物抑菌環(huán)內(nèi)，忽略明顯的抑菌環(huán)內(nèi)薄紗樣遷徙生長(zhǎng)。測(cè)量血平板上的抑菌環(huán)時(shí)，測(cè)量的是生長(zhǎng)抑菌圈，而不是溶血抑制圈。測(cè)量含甲氧芐啶和磺胺類(lèi)藥物的抑菌圈時(shí)，忽略少量生長(zhǎng)，測(cè)量比較明顯的邊緣，以確定抑菌環(huán)的直徑。平板結(jié)果判讀測(cè)量直徑細(xì)菌藥敏紙片孵育時(shí)間觀察結(jié)果金黃色葡萄球菌苯唑西林和萬(wàn)古霉素24h用透射光（平板舉向光源）來(lái)檢查明顯抑菌環(huán)內(nèi)有無(wú)耐藥菌落的少量生長(zhǎng)，抑菌環(huán)內(nèi)任何區(qū)域出現(xiàn)可辨別的生長(zhǎng)都判為苯唑西林或萬(wàn)古霉素耐藥頭孢西丁16-18h讀取時(shí)使用反射光葡萄球菌屬利奈唑胺16-18h讀取直徑是用透射光，抑菌環(huán)內(nèi)任何區(qū)域出現(xiàn)可辨別的生長(zhǎng)都判為耐藥腸球菌屬萬(wàn)古霉素24h用透射光仔細(xì)檢查抑菌環(huán)內(nèi)是否有菌落生長(zhǎng)，出現(xiàn)任何菌落意味著耐藥細(xì)菌藥敏紙片孵育時(shí)間觀察結(jié)果金黃色葡萄球菌苯唑西林和萬(wàn)古霉素藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制培訓(xùn)課件藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制培訓(xùn)課件結(jié)果解釋根據(jù)CLSI推薦的判斷標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性有判斷標(biāo)準(zhǔn)：敏感、中介、耐藥只有敏感的折點(diǎn)：敏感同屬細(xì)菌不同種判斷標(biāo)準(zhǔn)可能不同結(jié)果解釋根據(jù)CLSI推薦的判斷標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感不可能出現(xiàn)的藥敏現(xiàn)象金葡菌：青霉素S,苯唑西林R，萬(wàn)古霉素R腸桿菌科細(xì)菌：第三代頭孢菌素R，第一、第二代頭孢菌素S嗜麥芽窄食單胞菌：出現(xiàn)碳青霉烯類(lèi)S不可能出現(xiàn)的藥敏現(xiàn)象金葡菌：青霉素S,苯唑西林R，萬(wàn)古藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制培訓(xùn)課件藥敏質(zhì)控目的藥敏試驗(yàn)過(guò)程的精密度（可重復(fù)性）和準(zhǔn)確度在試驗(yàn)中所作用的試劑的性能。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和結(jié)果判定操作者的工作情況。責(zé)任制造商：確保制造出合適的產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室：確保試驗(yàn)很好地維護(hù)和執(zhí)行方法標(biāo)準(zhǔn)菌株藥敏質(zhì)控目的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株使用精心挑選的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株實(shí)驗(yàn)在可接受的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)操作進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果可靠每個(gè)質(zhì)控菌應(yīng)從認(rèn)可的來(lái)源處獲得（美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)，ATCC）適用于抗菌藥物和標(biāo)準(zhǔn)方法（CLSI推薦）質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株使用精心挑選的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株分類(lèi)：日常檢測(cè)質(zhì)控菌株：確保檢測(cè)系統(tǒng)正常運(yùn)行，并且檢測(cè)結(jié)果在制定的范圍內(nèi)大腸埃希菌ATCC25922金黃色葡萄球菌ATCC25923等補(bǔ)充的質(zhì)控菌株：用于評(píng)價(jià)某一特定情況下實(shí)驗(yàn)或者檢測(cè)系統(tǒng)的特性，或稱(chēng)為備用質(zhì)控菌株嗜血桿菌ATCC10211肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705等質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株分類(lèi)：質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)和儲(chǔ)存使用和檢測(cè)臨床分離株相同的材料和方法，按照標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法，來(lái)檢測(cè)質(zhì)控菌株合理儲(chǔ)存和維護(hù)，確保質(zhì)控菌具有可接受的性能儲(chǔ)存菌株：長(zhǎng)期貯存，可用Microbank,40%甘油肉湯、脫纖維羊血或脫脂牛奶，于-70℃低溫度保存。半儲(chǔ)存菌株：使用中的質(zhì)控菌應(yīng)貯存在胰大豆瓊脂（非苛養(yǎng)菌）或營(yíng)養(yǎng)豐富的巧克力瓊脂斜面（苛養(yǎng)菌），4-8℃保存，每周傳代一次。應(yīng)用菌株：每次使用前應(yīng)把半儲(chǔ)存菌株傳代到相應(yīng)的平皿上使其獲得單個(gè)菌落。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)和儲(chǔ)存質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株防止質(zhì)控菌株的變異保存菌株應(yīng)加保護(hù)液（脫脂奶粉或甘油）盡量減少轉(zhuǎn)種次數(shù)，一般不要超過(guò)6次孵育時(shí)間不要超過(guò)對(duì)數(shù)期避免菌種被污染不要從藥敏試驗(yàn)的瓊脂平板上取細(xì)菌使用如果出現(xiàn)無(wú)法解釋的結(jié)果表明細(xì)菌的天然敏感性已經(jīng)改變，需要制備新的原代培養(yǎng)物質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株防止質(zhì)控菌株的變異質(zhì)控菌株生物特性紙片瓊脂擴(kuò)散法其他大腸埃希菌ATCC25922β-內(nèi)酰胺酶陰性非苛養(yǎng)革蘭陰性菌腦膜炎奈瑟菌大腸埃希菌ATCC35218含質(zhì)粒編碼的TEM-1β–內(nèi)酰胺酶（非ESBL）β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物流感嗜血桿菌ATCC49247β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥菌株嗜血桿菌嗜血桿菌ATCC49766氨芐西林敏感嗜血桿菌（對(duì)某些β-內(nèi)酰胺類(lèi)更有代表性）肺炎克雷伯菌ATCC700603含SHV-18型ESBLESBL篩選和確證實(shí)驗(yàn)銅綠假單胞菌ATCC27853含誘導(dǎo)的AmpC非苛養(yǎng)革蘭陰性菌評(píng)價(jià)每批MH培養(yǎng)基中陽(yáng)離子含量適合性金黃色葡萄球菌ATCC25923β-內(nèi)酰胺酶陰性mecA陰性非苛養(yǎng)革蘭陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌ATCC43300苯唑西林耐藥，mecA陰性頭孢西丁紙片肺炎鏈球菌ATCC49619青霉素結(jié)合蛋白改變導(dǎo)致青霉素中介肺炎鏈球菌其他鏈球菌腦膜炎奈瑟菌常用質(zhì)控菌株質(zhì)控菌株生物特性紙片瓊脂擴(kuò)散法其他大腸埃希菌ATCC