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FISH實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)驗(yàn)儀器:熒光顯微鏡:高速離心機(jī):可達(dá)12000r/min高壓滅菌鍋:160°C以上殺菌恒溫箱:為雜交提供恒定溫度恒溫水浴鍋照相機(jī)(與熒光顯微鏡配套):熒光捕捉圖片二、試劑的配制:1、 0.2mol/L(pH7.4)磷酸緩沖溶液(PB)試劑為NaHP0?2H0和NaHP0?12H0。TOC\o"1-5"\h\z2 4 2 2 4 2 0.2M的NaHP0溶液:31.2gNaHP0?2H0,加蒸餾水1000mL溶解2 4 2 4 2 0.2M的NaHP0溶液:71.632gNaHP0?12H0加蒸餾水至1000ml溶解2 4 2 4 2——0.2M(pH7.4)磷酸緩沖溶液(PB):19ml的NaHP0溶液和81ml的NaHP0溶液充分2 4 2 4混合高壓滅菌,常溫保存。2、 0.03mol/L磷酸鹽緩沖溶液((PBS)試劑為NaCl和磷酸緩沖溶液PB 0.03MPBS溶液:22.8gNaCl,150ml磷酸緩沖溶液(PB),加蒸餾水至1000ml,混勻 0.02MPBS溶液:取100ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中,加蒸餾水稀釋至150ml 0.01MPBS溶液:取50ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中,加蒸餾水稀釋至150ml高壓滅菌,常溫保存。3、 4%多聚甲醛溶液(1000ml)(在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行操作) 將略小于2/3體積的水(660ml)加熱到50C, 40g多聚甲醛PFA,邊攪拌邊加入到水中,繼續(xù)保持60C 1滴2mol/LNa0H溶液,立即澄清,但仍有小顆粒。 1/3體積的PBS溶液, 用Hcl將pH調(diào)至7.2,定容, 用孔徑為0.22um的濾膜過(guò)濾,——4C保存最多保存兩天,或者取少量保存在-20C。(加熱時(shí)溫度不宜過(guò)高,為60C-65C,否則PFA容易降解,配置好后應(yīng)盡快使用,否則固定效果較差)。4、 1mol/L(pH8.0)Tris-HCl緩沖液的配置―-121.1gTris(三羥基氨基甲烷),加800mL蒸餾水溶解,加入大約42mL的濃HCl―-用1M的HCl或lM的NaOH將pH調(diào)至&0,最后加蒸餾水至1000Ml高壓滅菌,4C冰箱保存。5、 10%SDS―-10gSDS(十二烷基硫酸鈉)于50ml滅菌水中,加水至100ml,分裝后室溫保存。滅菌,或用濾膜過(guò)濾稱(chēng)取SDS時(shí)需戴口罩!6、 0.5MEDTA(pH8.0)溶液的配置——186.1g乙二胺四乙酸二鈉加800mL蒸餾水溶解,劇烈攪拌(最好使用磁力攪拌機(jī)) 用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至&0,然后定容至1000mL。7、 雜交緩沖液配置2ml雜交緩沖液于2ml離心管中,各試劑的加入順序:360uL5MNaCl;40uL1MTris—HClxuL100%甲酰胺(見(jiàn)下表)yuL無(wú)菌水(見(jiàn)下表)2uL10%SDS0.22um孔徑的濾膜過(guò)濾,4°C保存。表1配置不同甲酰胺雜交液中甲酰胺和無(wú)菌水的體積甲酰胺濃度(%) 甲酰胺體積x(uL) 無(wú)菌水體積y(uL)TOC\o"1-5"\h\z0 0 15985 100 149810 200 139815 300 129820 400 119825 500 109830600998357008984080079845 900 698501000598551100498甲酰胺有劇毒,操作時(shí)需戴手套,在通風(fēng)處內(nèi)進(jìn)行,廢液需要回收)不同甲酰胺雜交液的配制甲酰胺濃度(%)5MNaCl溶液(mL)1MTris-HCl(mL)10%SDS(mL)甲酰胺體積x(mL)無(wú)菌水體積y(mL)207280.480239.6357280.4140179.6407280.4160159.6557280.422099.68、雜交后洗滌液的配置配制50mL雜交洗滌液于50mL離心管中,各試劑加入的順序如下:ZuL5MNaCl1mL1MTris-HCl(pH7.6)無(wú)菌水加至50mL50uL10%SDS500卩LEDTA表2 根據(jù)雜交緩沖液中甲酰胺濃度而定的探針清洗液液中NaCl體積數(shù)甲酰胺濃度% NaCl體積z(uL) NaCl最終濃度(mM)TOC\o"1-5"\h\z0 9000 9005 6400 64010 4600 46015 3280 32820 2250 22525 1590 15945 400 4050280285520020不同甲酰胺對(duì)應(yīng)的洗滌液的配制甲酰胺濃度(%)1MTris-HCl(mL)10%SDS(mL)0.5MEDTA(mL)5MNaCl溶液(mL)尢菌水體積(mL)2080.4418369.63580.446.4381.24080.444.48383.125580.441.63869、4',6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid(DAPI)常備:1mgM-i需要稀釋為:1AgM-i滅菌儲(chǔ)存在-20°C(用鋁箔覆蓋管子)DAPI可誘變致癌,所以在使用時(shí)要戴手套并且收集廢液,包括早使用移液管時(shí)。為了避免使用時(shí)對(duì)溶液造成污染,所有的溶液應(yīng)取出置于50ml管中,夠每天使用的量。三、實(shí)驗(yàn)步驟:1、玻片的預(yù)處理:玻片預(yù)處理1)玻片清洗:載玻片與蓋玻片用熱肥皂水刷洗干凈,在實(shí)驗(yàn)室可用超聲清洗代替刷洗(4~5次每次10min),然后用清水浸泡過(guò)夜;2)硅化處理:第二天換用1%的鹽酸浸泡24小時(shí),然后用蒸餾水清洗干凈后放入高壓滅菌鍋滅菌,60°C烘干。蓋玻片用錫紙包好4°C保存?zhèn)溆?。(蓋玻片干凈即可,不用處理)(2)黏附劑涂片制備載玻片放入APES與丙酮的1:50溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)中約lmin,取出用高壓滅菌處理過(guò)的蒸餾水清洗后于室溫下干燥(也可放入烘箱里25°C烘干),然后置4°C保存?zhèn)溆?、 熒光探針的選擇和標(biāo)記(見(jiàn)fish探針的選擇表)3、 樣品的制備與固定(1) 用已滅菌的聚乙烯取樣管取反應(yīng)器內(nèi)泥水混合液1mL,加適量滅菌蒸餾水振蕩混勻,并用超聲波處理使細(xì)菌分散。取處理后的懸濁液約0.5ml進(jìn)行后續(xù)處理。(2) 將懸濁液混合均勻后,按1:1加入4%多聚甲醛,于4C固定24小時(shí),(3) 然后置于12000r/min離心5min去除固定劑,將固定樣本加入1ml0.0lmol/LPBS以10000r/min的速度離心漂洗兩次,棄去上清液。(4) 采用PBS與乙醇的1:1溶液稀釋定容至1ml于20C保存?zhèn)溆?、 樣品的預(yù)處理(1) 用微型振蕩器將樣品混合均勻,取10ul樣品在載玻片上涂抹20mmX20mm大?。ú灰螅?,37C的烘箱熱固定2h,最高溫度不超過(guò)60C(2) 風(fēng)干后于50%、80%、95%的乙醇中各脫水3min,自然風(fēng)干。(脫水:準(zhǔn)備三個(gè)瓷盤(pán),然后將載玻片取出依次放入瓷盤(pán)中,50用%乙醇淹沒(méi)載玻片,脫水3min,取岀放入第二、三個(gè)瓷盤(pán),然后用0%乙醇脫水,96%乙醇脫水。脫水后的80%、96%乙醇回收。)脫水后的玻片可以在室溫下保存幾個(gè)月,可在-20C的條件下保存幾個(gè)月5、 原位雜交探針濃度為50ng/uL,在密閉的雜交盒內(nèi)鋪滿吸水紙(經(jīng)高壓滅菌烘干),用雜交液濕潤(rùn),使雜交環(huán)境保持一定的濕度。用移液槍分別取24uL的雜交液和1UL探針滴入帶有樣品的載玻片上(均勻覆蓋涂片面積),(加蓋硅化蓋玻片,不用)放入雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交溫度與雜交時(shí)間如下。所有有關(guān)探針的操作在處理時(shí)都應(yīng)避光處理!探針?lè)N類(lèi)溫度(C)時(shí)間(h)甲酰胺濃度%備注EUBMIX46520同步染色法AOBMIX46355重復(fù)染色法NOBMIX46540重復(fù)染色法GAOMIX462.530同步染色法HGC69a462.530同步染色法PAO651462.530同步染色法6、 雜交后洗滌從恒溫箱中取出玻片之前將盛有清洗液的容器放入到48C的水浴中預(yù)熱20分鐘。雜交完成后取出玻片,立即放入到預(yù)熱好的容器中。注意不能讓玻片干燥,不然將很難洗去非特異性結(jié)合的信號(hào),增加背景染色。清洗液的量應(yīng)當(dāng)淹沒(méi)玻片,清洗15?20分鐘后取出,用清水洗去剩余的清洗液,然后室溫下晾干。7、 DAPI染色

每個(gè)玻片用lO^LDAPI(用甲醇稀釋至l^g/UL)滴加到載玻片樣品上,在冰上染色lOmin,用水沖洗多次,室溫下自然晾干,鏡檢前加蓋蓋玻片。8、熒光顯微鏡觀察經(jīng)過(guò)以上處理的樣品,用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。探針目標(biāo)菌群探針序列甲酰胺濃度修飾EUB338DomainBacteriaGCTGCCTCCCGTAGGAGT20%HEXNSO190Ammonia-oxidizingbacteriaCGATCCCCTGCTTTTCTCC55%HEXNIT3CCTGTGCTCCATGCTCCGFITCNitrite-oxidizingbacteria40%cNIT3bCCTGTGCTCCAGGCTCCGGA0Q989CompetibacterTTCCCCGGATGTCAAGGC35%Cy5TMHGC69aActinobacteriaTATAGTTACCACCGCCGT25%FITCPA0651AccumulibacterCCCTCTGCCAAACTCCAG35%Cy3TMDenitrifierCGGGAGGCAGCAGT35%FAM注:a探針濃度均為50ng/uL;bcNIT3為硝酸菌探針NIT3的競(jìng)爭(zhēng)探針。AbbreviationmaximumabsorptionMaximumemissionFiltersetFITC(綠色)492nm528nm10(Zeiss)DAPI(藍(lán)色)365nm418nm02(Zeiss)CY3(橙色/紅色)554nm570nm15(Zeiss)CY5(紅外線檢測(cè))650nm667nm26(Zeiss)HEX探針的選用選用EUBMIX(EUB338、EUB338II、EUB338III)來(lái)檢測(cè)活性污泥中的全部的細(xì)菌。選用PAOMIX來(lái)檢測(cè)活性污泥中的聚磷菌,選用AOBMIXNOBMIX來(lái)檢測(cè)活性污泥中的硝化菌。選用GAOMIX探針來(lái)檢測(cè)活性污泥中的聚糖菌,選用HGC69a探針來(lái)檢測(cè)反硝化聚磷菌的優(yōu)勢(shì)菌種Actinobacteria,用PAO651來(lái)檢測(cè)優(yōu)勢(shì)菌種Rhodocyclus,雜交后用4?,6-diamidino

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