植物組織培養(yǎng)綜合實驗1課件

植物組織培養(yǎng)綜合實驗1花卉離體快繁與工廠化育苗技術

楊明摯Tel：實驗目的意義

通過滿天星等的莖尖培養(yǎng)獲得完整的幼苗，學會莖尖組培快繁的基本原理和操作技術。

實驗原理

植物的莖尖和腋芽在適宜的培養(yǎng)基上，在合適的激素條件下，其生長點分化形成大量芽并能形成良好的苗。苗經誘導可長出根而形成完整的植株，這就是莖尖組培快繁。此技術已廣泛用來繁育那些不能形成種子進行繁殖或難以繁育的花卉雜交品種或其它具有重要經濟價值的植物，由于病毒一般不侵入生長點細胞，因此，這種方法也廣泛用來脫病毒獲取脫毒苗。

離體快繁的應用優(yōu)良品種脫毒種苗和無病毒苗；特殊育種材料；制種材料；突變體；基因工程植株；離體保存種質；瀕危植物。組織培養(yǎng)室高質量的高科技農業(yè)植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基組成1、無機營養(yǎng)包括大量元素和微量元素。2、有機營養(yǎng)包括維生素類、氨基酸類、能源及滲透壓調節(jié)劑等。這些物質一方面做氮源，一方面有利于生長。3、激素及植物生長調節(jié)劑促進細胞脫分化和再分化4、附加物類：固化劑（一般用瓊脂和卡拉膠）、有機添加物（如椰乳、香蕉泥、馬鈴薯、酵母提取液等）、活性炭等。氮源

硝態(tài)氮氨態(tài)氮作為唯一氮源時，硝酸鹽的作用要比氨鹽好得多，但會發(fā)生PH偏移。同時使用可減少PH變化。

硝態(tài)氮和氨態(tài)氮水平的平衡對細胞分裂和分化有促進作用：硝態(tài)氮水平高，有利于細胞增殖和胚性愈傷組織的誘導；氨態(tài)氮水平高，促進細胞和組織器官的分化。維生素硫胺素(VB1):一般認為是一種必需的成分.其他維生素如:吡哆醇(VB6),煙酸(VB3)、泛酸鈣（VB5）和肌醇等能改善培養(yǎng)組織的生長狀況。配制方法：葉酸(先用少量稀氨水溶解）有機營養(yǎng)氨基酸：甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、天冬酰氨。蛋白水解物：水解酪蛋白、水解乳蛋白。天然有機營養(yǎng)：椰子汁、玉米胚乳、麥芽浸出物、番茄汁、酵母浸出物。植物生長調節(jié)物

細胞分裂素和生長素少數(shù)：赤霉素和ABA生長素：

1）吲哚類：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）

2）萘酸類：NAA（萘乙酸）

3）苯氧羧酸類：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。

NAA、IBA：廣泛用于生根，并能與細胞分裂素互作促進試管苗的增殖。

2,4-D和2,4,5-T：對愈傷組織的誘導和生長非常有效。

配制方法：95%乙醇或0.1M的NaOH生長素的生理作用

1、促進細胞生長和細胞分裂

2、誘導受傷組織表面細胞恢復分裂能力

3、形成愈傷組織，促進生根

4、與一定量的細胞分裂素配合共同誘導不定芽的分化、側芽的萌發(fā)與生長、胚狀體的誘導。

細胞分裂素是一類腺嘌呤衍生物。主要有激動素（6-糠基氨基嘌呤KT）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—芐基氨基嘌呤。功能：1、促進細胞的分裂和分化2、誘導芽的分化3、促進側芽的萌發(fā)和生長4、抑制衰老

配制方法：0.5M的Hcl或0.1M的NaOHABA：BA(0mg/L)，芽（減少），根（增多）愈傷組織（一定量）

B：BA(0.1mg/L)，芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量）

培養(yǎng)基類型高鹽成分培養(yǎng)基：

MS、LS、BL、BM、ER中等無機鹽含量的培養(yǎng)基：H、Nitsch、Miller低無機鹽含量的培養(yǎng)基：White、WS、Knop、HB硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基：B5、N6、SH三、培養(yǎng)基的配制母液配制和保存為什么要配制母液？哪些藥品能配制在一起，而哪些必須單獨配制。為什么？培養(yǎng)基配制程序pH值的調整培養(yǎng)基的分裝和滅菌２、微量元素母液的配制

MS培養(yǎng)基的微量元素無機鹽由7種化合物（除Fe）組成。微量元素用量較少，特別是

CuSO4·5H2O、

CoCl2·6H2O

，因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2，表3配方，用感量為0.0001g的分析天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時，每配制1L培養(yǎng)基，取微量Ⅰ10ml，微量Ⅱ１ml

3、鐵鹽母液的配制

鐵鹽不是都需要單獨配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時，配制1L取此液10ml。4、有機母液的配制

MS培養(yǎng)基的有機成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機成分原則上應分別單獨配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時用電子分析天平。并貯存在棕色無菌瓶中。

配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。植物組織培養(yǎng)設備及無菌操作技術一、設備滅菌設備，接種室，超凈工作臺，接種工具，培養(yǎng)室及培養(yǎng)設備，練苗室，次生代謝產物分離、純化、提取設備。二、無菌操作技術1、各種滅菌方法及其使用范圍干熱滅菌玻璃器皿、器械濕熱滅菌培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞、包頭紙熏蒸滅菌接種室、培養(yǎng)室過濾滅菌液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌培養(yǎng)材料燒灼滅菌器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌

接種室。培養(yǎng)間常用消毒劑及其特點

對消毒劑的要求是：既有良好消毒作用，又易沖洗或自行分解，不損傷材料，不影響生長。

消毒劑使用濃度（%）去除難易消毒時間（分）效果次氯酸鈣9～10易5～30很好次氯酸鈉2易5～30很好漂白粉飽和溶液易5～30很好溴水1～2易2～10很好過氧化氫10～12最易5～15好升汞0.1～1較難2～10最好酒精70～75易0.2～2好抗菌素4～5（mg/L）中30～60較好硝酸銀1較難5～30好（1）清洗

玻璃器皿實驗材料（2）滅菌培養(yǎng)材料滅菌培養(yǎng)基滅菌接種間和培養(yǎng)間的滅菌（3）接種：技術人員的無菌操作2．無菌操作人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿：洗→熱壓玻璃器皿：洗→干熱（干熱箱）或晾干接種用具：用CCL4布擦→濕布擦→泡75%~95%酒精→燒培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)材料外部細菌：用水沖洗→化學藥劑處理內部細菌莖尖培養(yǎng)加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺用化學試劑薰蒸污染來源無菌操作技術實驗過程整個實驗分為三個相互銜接的階段：1、初代培養(yǎng)——建立莖尖無菌培養(yǎng)系統(tǒng)2、繼代培養(yǎng)——莖尖離體快繁3、根的誘導及移栽——形成完整植株本周實驗內容植物離體快繁——初代培養(yǎng)1培養(yǎng)基的配制2外植體的采集及滅菌處理3接種與無菌操作4培養(yǎng)物觀察初代培養(yǎng)實驗材料：滿天星或非洲菊帶莖尖的苗75%乙醇溶液和0.1%升汞溶液需滅菌物品：誘導培養(yǎng)基:MS＋6-BA1.0mg/L（Ph5.8）培養(yǎng)皿、吸水紙、解剖刀、長柄鑷子等實驗操作1、培養(yǎng)基的配制及實驗器材準備培養(yǎng)基：

MS＋6-BA1.0mg/L+3%蔗糖（Ph5.8）實驗器材：吸水紙，操作盤（飯盒或培養(yǎng)皿）；鑷子；剪刀；酒精棉球等。超凈工作臺準備：

2、植物無菌培養(yǎng)物的獲得從田間獲得的滿天星枝條或幼苗，切取莖頂或帶腋芽的莖段，用水反復沖洗，切取莖尖（2cm）或帶腋芽的莖段，用70%乙醇溶液浸15秒，再用0.1%升汞溶液滅菌8～10分鐘，用無菌水清洗幾次，在無菌操作臺上或接種箱中，逐層剝去外面的大葉，切取只有2～3個小葉的莖尖（0.5cm大?。?，接種于誘導培養(yǎng)基上，置于25℃的恒溫下照光培養(yǎng)。選材：材料類型、大小，年齡與發(fā)育狀況等修剪：去除較老和臟的葉片，盡量減小體積，減少污染清洗：自來水沖洗，2％洗滌劑浸泡20分鐘，清水沖洗（注意材料損傷）滅菌：75％乙醇30-60s；0.1%升汞8-10分鐘;無菌水沖洗3-5次。無菌修剪：用無菌鑷子和剪刀進一步去除多余的葉片，依據(jù)需要切割成相應大小的莖段（帶2-3個葉片）。接種：無菌操作將處理好的材料接種于培養(yǎng)基上，2-3個材料/瓶培養(yǎng)：25℃，光照培養(yǎng)觀察記錄：污染，生長狀況，分枝實驗室無菌間，超凈工作臺培養(yǎng)室接種時在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中

正

確

錯

誤整個接種操作應在近火焰處進行，且動作要迅速正

確

錯

誤接種過程中盡可能達到懸空要求防止操作帶來的污染正

確

錯

誤接種時不得用手接觸瓶蓋內壁或瓶口正

確

錯

誤瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正

確

錯

誤接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產生

接種莖段：注意形態(tài)學下端插入培養(yǎng)基