液相色譜的方法開發(fā)-分離機理及色譜柱課件

液相色譜的方法開發(fā)分離機理及色譜柱選HPLC參數(shù)時的基本考慮溶解度-選擇流動相的條件分子量-在樣品預(yù)處理或GPC分析時有用官能團-有否離子化基團?保留特性如何?樣品的基質(zhì)-考慮如何前處理樣品在基質(zhì)中的含量-分析、制備都需考慮檢測特性-有否紫外吸收?熒光?找出樣品中不同組份之間的差異摸索條件的重要線索極性問題吸附色譜的分離機理隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小在色譜柱上的保留由長到短吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。洗脫次序∶一般為正相，即：極性低的先被洗脫常用的流動相∶非極性有機溶劑，如己烷乙酸等為添加劑常用固定相∶硅膠、氧化鋁、羥基磷灰石等。分配色譜的分離機理分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即：極性高的先被洗脫常用的流動相：水和有機溶劑如甲醇、乙腈應(yīng)用添加劑，成為離子對、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、氨基等基團反相色譜固定相多為鍵合相體積排除色譜的分離機理GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分離離子交換色譜概述適用于離子型化合物的分離分離基于離子的帶電特性洗脫次序受多種因素的影響填料（離子交換樹脂）的種類∶陰/陽，強/弱，交換基團樣品分子特性鹽的種類、濃度溫度及pH值有機溶劑離子交換樹脂的交換容量液相色譜柱與分離機理的關(guān)系從色譜方法上分正相/反相離子交換分子體積排除親合疏水回受從柱子類型上分分配/吸附離子交換凝膠親合色譜柱化學(xué)及外形結(jié)構(gòu)的關(guān)系色譜柱的規(guī)格內(nèi)徑檢測的靈敏度樣品的容量長度分離度，理論塔板數(shù)速度樣品的容量檢測的靈敏度對HPLC柱的了解（二）平均孔徑/孔體積孔徑/孔體積分布大的孔徑可分析高分子量的分子對HPLC柱的了解（三）鍵合相化學(xué)影響化合物的分離度：a

不同鍵合相對不同種類的化合物分離不同可能導(dǎo)致色譜的分離機理不同如：C18、C8、CN不同色譜柱的含碳量

色譜柱 C% k'苊(50/50的乙腈/水)SymmetryC18 19 17ZorbaxODS 17 15.7LiChrosorbRP-18 15 10.3SymmetryC8 12 12.5ResolveC-18 12 12.4UltrasphereODS 11 11.3PartisilODS-3 11 12.0mBondpakC-18 10 7.9Nova-PakC-18 7 5.5對HPLC柱的了解(五)填料的端基封口封口殘余硅羥基減少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）對HPLC柱的了解（六）硅膠的活性主要影響堿性化合物的保留行為：k'生產(chǎn)硅膠時處理溫度不同，硅膠活性也不同是選擇性差異的主要來源硅膠的雜質(zhì)含量重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小是色譜柱質(zhì)量好壞的重要標志對HPLC柱的了解（七）填料的穩(wěn)定性硅膠填料pH：2-8聚合物填料pH：2-12pH值小于2時

鍵合相水解Waters各種硅膠基質(zhì)的色譜柱新一代硅膠基質(zhì)的色譜柱Symmetry高純度硅膠：Fe,Al,Mg等均<10ppm孔徑100?，5m球形顆粒，端基封口超高含碳量：C18/19%，C8/12%表面積：300m2/g孔體積：1mL/g特點對稱峰形，好重現(xiàn)性，不同的選擇性，使用壽命長Waters聚合物基質(zhì)的反相柱特殊設(shè)計的多孔聚合物膠有很寬的pH適應(yīng)范圍（2-12）可用離子抑制方法分析堿性化合物有非常不同的選擇性柱效及韌性比相應(yīng)的硅膠柱低色譜機理不太清楚文獻背景低，用戶少超越極限：全新Xterra色譜柱—集硅膠與聚合物基質(zhì)填料的優(yōu)點為一體，突破常規(guī)高效色譜柱的極限高效、高速分離不僅能夠使用極小粒徑的填料以進行高分辨及快速分析，而且允許在高溫下進行分離峰形優(yōu)異--對堿性化合物尤其如此pH范圍可與聚合物基質(zhì)色譜柱相比

pH范圍1-12極佳的穩(wěn)定性即使在高溫或極端pH條件下仍可維持長壽命峰形比較：XTerra?MSC18與普通C184.AcenaphthenePeakID:1.Propranolol2.Butylparaben3.Naphthalene5.AmitriptylineUsingSymmetryQCconditions:3.9x150mm,1.0mL/min,MeOH/20mMK2HPO4/KH2PO4,pH7.0,(65/35),23.4°CTime(min)0102030C18-Silica1234512345XTerra?MSC18USPT=2.28USPT=1.35Alden,Iraneta寬pH范圍在pH1-12范圍內(nèi)保持穩(wěn)定使pH成為改變選擇性的有力工具使可在非離子狀態(tài)下進行分析堿性物質(zhì)的穩(wěn)定保留加速色譜柱壽命試驗：

(pH10