DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義

第三節(jié)DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院張薇薇Email:solozww@163..QQ:363002530

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!

分型技術(shù)有那些?-血清學(xué)分型

-生物化學(xué)分型-噬菌體分型………….傳統(tǒng)的分型技術(shù)分子生物學(xué)分型技術(shù)?-

PFGE-限制性酶切圖譜分析-

PCR技術(shù)-質(zhì)粒圖譜DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!脈沖場凝膠電泳

pulsed-fieldgelelectrophoresisPFGE原理瓊脂糖凝膠依靠不同的分子篩效應(yīng)對大小不同的DNA分子進(jìn)行分離。超過一定大小的線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。

大于該極限長度（40kb）后DNA的遷移速率幾乎與分子大小無關(guān)，而主要決定于電場強(qiáng)度。但PEGE

解決了這一問題DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!PFGE優(yōu)勢重復(fù)性好,分辨力強(qiáng),被譽(yù)為細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”PFGE的局限性無法分辨點(diǎn)突變、微小突變內(nèi)切酶選擇很關(guān)鍵，否則無法找到圖譜費(fèi)時，儀器要求高，技術(shù)要求高，成本較高PFGE的優(yōu)勢和局限性DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!自然界的生物的個體差異我是獨(dú)一無二滴!DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!不同or差異?

多態(tài)性（polymorphism）定義:是指在一個生物群體中，同時和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因，亦稱遺傳多態(tài)性或基因多態(tài)性(geneticpolymorphism).從本質(zhì)上來講，多態(tài)性的產(chǎn)生在于基因水平上的變異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域和沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!在疾病預(yù)防控制中的應(yīng)用同源性追蹤細(xì)菌分型傳染控制DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!DNA多態(tài)性分析常用的方法

限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(RFLP)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(AFLP)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析技術(shù)(RAPD)細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)(rep-PCR)脈沖場凝膠電泳(PFGE)。。。。。。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!因此，RFLP即是基于限制性核酸內(nèi)切酶酶切消化核酸及標(biāo)記的DNA探針能與任何序列相似的片段雜交，通過片段長度變異性來檢測生物體多態(tài)性基本原理每種生物基因型具有其獨(dú)特的特征，及獨(dú)特的限制酶識別序列分布，其基因組DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等片段，這些片段經(jīng)電泳以后幾乎是連續(xù)排列的，如用放射性同位素標(biāo)記的DNA作探針，將與被標(biāo)記的DNA相關(guān)的片段檢測出來，即可構(gòu)建出多態(tài)性圖譜。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!RFLP操作流程圖DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!轉(zhuǎn)移電泳槽

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)

PCR-RFLP基本原理

結(jié)合PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，其基本原理是對目的基因片段PCR擴(kuò)增后，利用多種限制性內(nèi)切酶，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，不同基因序列，不同限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，在電泳后可產(chǎn)生不同電泳圖譜，通過對電泳圖譜的分析，得出基因多態(tài)性結(jié)果。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!基本程序1.提取DNA2.設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行目的基因PCR反應(yīng)3.將DNA擴(kuò)增產(chǎn)物選用合適限制性內(nèi)切酶酶切4.將酶切出來的具各種長度的DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離5.對顯示出來的帶譜進(jìn)行分析。

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!我的肥胖課題PPAR-γ2及UCP2基因多態(tài)性與成都地區(qū)單純性肥胖相關(guān)性初探PPAR-γ2

調(diào)節(jié)脂肪組織分化，脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮關(guān)鍵作用其基因突變發(fā)生于染色體3p25外顯子2的第12位密碼子CCA-GCA突變造成脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，即PA多態(tài)性

UCP2

調(diào)節(jié)機(jī)體的基礎(chǔ)代謝率(BMR)來控制體重其定位于人類11號染色體(11q13)外顯子2，第55位密碼子GCA-GTA突變造成丙氨酸轉(zhuǎn)變纈氨酸，即AV多態(tài)性DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!

600bp500bp400bp300bp250bp200bp

150bp126bp

100bp98bp

Maker123圖9UCP2PCR產(chǎn)物經(jīng)BbvⅠ內(nèi)切酶酶切后3.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果注：基因型為AA型:被酶解為98bp,1條帶(第3泳道);

基因型為AV型:被酶解為126bp、98bp，2條帶(第1泳道)

基因型為VV型:被酶解，仍為126bpl條帶(第2泳道)A

VV

VAADNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!二、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析技術(shù)Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP

——

結(jié)合了限制性酶切消化的可靠性和嚴(yán)格的PCR退火條件，有高度特異性，既克服了RFLP技術(shù)中Southen雜交繁瑣和耗時的缺點(diǎn)，又解決了RAPD等技術(shù)中非特異PCR擴(kuò)增引起的可信度問題。

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!基本原理AFLP指紋圖譜是通過PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性酶切片段，然后在高分辨率聚丙烯酰胺凝膠或毛細(xì)管凝膠中電泳而獲得。AFLP技術(shù)檢測的是酶切位點(diǎn)單核苷酸改變或其臨近的用于AFLP引物退火的核苷酸改變所致的序列多態(tài)性。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!基因組DNA提取酶切與接頭連接PCR擴(kuò)增電泳分析基本程序DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!2.限制性酶切與連接反應(yīng)

限制性酶切與連接反應(yīng)體系包括基因組DNA、接頭AFLP-LG1（5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3’）、接頭AFLP-LG2（5’-TGTACGCAGTCTAC-3’）、PstⅠ酶、T4連接酶、1×酶連接緩沖液，37℃反應(yīng)3h。與接頭連接好的標(biāo)記DNA片段用2.5mol/L醋酸胺、純乙醇沉淀。室溫孵育5min后，4℃12000×g離心10min，70%乙醇洗一次，沉淀物干燥后加入100μlTE緩沖液配成懸液，-20℃保存。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!4.凝膠電泳1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓3.45V/cm，電泳4h。需在每一個樣品電泳帶旁加一個分子量標(biāo)記條帶。每塊膠的個樣品孔加入來源于EWGLI標(biāo)準(zhǔn)化分型的DresdenAFLP015型AFLP產(chǎn)物（EULNo.137）。凝膠經(jīng)EB染色30min，紫外光下照相或數(shù)字記錄。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!補(bǔ)充原理圖AFLP原理和操作流程圖DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!2.接頭

接頭是人工合成的一段短核苷酸雙鏈，一般長度是11~17個核苷酸，由中心序列和限制酶切特異序列兩部分組成。注意接頭5’端為非磷酸化，以防接頭間的連接并保證其只能在3’端與限制性片段連接。ApaⅠ(GGGCC/C)接頭的結(jié)構(gòu)

5’-TCGTAGACTGCGTACAGGCC-3’3’-CATCTGACGCATGT-5’中心序列酶切位點(diǎn)DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!3.引物設(shè)計(jì)引物由三部分組成：與接頭序列匹配的中心序列，相應(yīng)的酶切位點(diǎn)和3’端的選擇性堿基。如ApaⅠ引物：

5’-GACTGCGTACAGGCCCNNN-3’

中心序列ApaⅠ切點(diǎn)選擇性堿基重要特征是所有引物5’端是G堿基,可有效防止雙鏈的形成引物。

設(shè)計(jì)主要在選擇性堿基數(shù)目及組合上。選擇性堿基通常為1～3個，對基因組較復(fù)雜的生物體在兩個引物的3’端至少有3個選擇性核苷酸才能獲得合適指紋圖，而細(xì)菌基因組小，一般1個選擇性核苷酸即足夠了。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!GGDNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!

應(yīng)用1.細(xì)菌分型軍團(tuán)菌、大腸桿菌、根瘤土壤桿菌、表皮葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、黃桿菌屬、氣單胞菌屬、梭狀桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬和弧菌屬等。2.細(xì)菌鑒定芽孢桿菌屬、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌、耶爾森菌、金黃色葡萄球菌、幽門螺桿菌等。3.流行病學(xué)調(diào)查

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!三、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析技術(shù)RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD

——以PCR技術(shù)為背景，以人工合成的堿基順序隨機(jī)排列的寡核苷酸單鏈為引物，對所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳分離后產(chǎn)生DNA指紋圖譜。

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!基本原理RAPD所用的一系列DNA引物序列各不相同，但對于任意特定引物，它同基因組DNA序列有其特定結(jié)合位點(diǎn)，如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)變化，而使PCR產(chǎn)物增加、減少或發(fā)生分子量改變，產(chǎn)生多態(tài)性圖譜。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!DNA多態(tài)性分析常用的方法

限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(AFLP)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析技術(shù)(RAPD)

細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)(rep-PCR)脈沖場凝膠電泳(PFGE)。。。。。。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!rep-PCR-原理rep-PCR技術(shù)是利用基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列（repetitivesequences)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行比較，來分析菌株間基因組存在的差異。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!rep-PCR-短重復(fù)序列

兩者的共同特征是它們在細(xì)菌基因組中存在著菌株、種、屬水平上的分布和拷貝數(shù)量的差異，而序列本身在進(jìn)化過程中又具有較強(qiáng)的保守性?；谶@兩種短重復(fù)序列的PCR就成為rep-PCR的2個重要的技術(shù)

REP-PCR

ERIC-PCRDNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!REP序列的功能：轉(zhuǎn)錄終止作用；穩(wěn)定mRNA；在體內(nèi)染色體區(qū)段的組織作用DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!ERIC序列

腸細(xì)菌基因間共有重復(fù)序列（ERIC）長約126bp，其中包含幾個反向重復(fù)序列，具有非常保守的中央倒置重復(fù)區(qū)，轉(zhuǎn)錄后的mRNA形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)莖環(huán)結(jié)構(gòu)中位于莖部位的一個堿基發(fā)生改變時，與其相對應(yīng)的堿基也要發(fā)生相應(yīng)的改變，從而保證二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!

依據(jù)ERIC重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，對細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，可產(chǎn)生DNA指紋圖譜。在一定范圍內(nèi)，DNA遷延帶的大小和多少代表著此重復(fù)序列間的距離和重復(fù)次數(shù)，因此，基因組DNA的差異可清晰地顯示在指紋圖譜上。這就叫rep-PCR技術(shù)的ERIC-PCR技術(shù)。rep-PCR-ERIC-PCR技術(shù)DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!rep-PCR-應(yīng)用在李斯特菌種、株鑒定中的應(yīng)用在腸桿菌科細(xì)菌鑒定、分類中的應(yīng)用在其他菌株分類和鑒定中的應(yīng)用DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!

Thanks！DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!原理PFGE利用定時改變電場方向的交流電源，每次電流方向改變持續(xù)ls到5min左右，然后改變電流方向反復(fù)循環(huán)，故稱為脈沖式交變電場。隨著電場方向的交替變化，DNA分子呈“Z”形向前運(yùn)動。每改變一次電場方向，大的伸展的DNA分子就必須重新定向，在新的方向上通過凝膠。重新定向所需的時間與DNA分子的長度成正比。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!（1）細(xì)菌培養(yǎng)（2）制備膠塊（3）菌體裂解（4）膠塊洗滌（5）酶切（6）電泳（7）結(jié)果處理

PFGE圖譜獲得過程最大限度的保證全基因組的完整性脈沖式交變電場DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!任何一種技術(shù)都不是完美的！

還有沒有其他技術(shù)作為補(bǔ)充？DNA多態(tài)性?分型技術(shù)?Yes!DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!

DNA多態(tài)性在微生物中的實(shí)際意義？將導(dǎo)致

——不同的細(xì)菌亞型

——耐藥菌株出現(xiàn)

——毒力變異株出現(xiàn)

——抗原漂移與抗原變異。。。。。。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!DNA多態(tài)性分析常用的方法

限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(RFLP)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(AFLP)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析技術(shù)(RAPD)細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)(rep-PCR)脈沖場凝膠電泳(PFGE)。。。。。。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!——

1974年首創(chuàng)，以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)的代遺傳標(biāo)記，是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡技術(shù)、探針-雜交技術(shù)的綜合應(yīng)用一、限制性片段長度多態(tài)性分析Restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!核酸分子雜交技術(shù)原理核酸經(jīng)加熱變性后，在低于變性溫度20℃~

30℃時，反應(yīng)系統(tǒng)中加入的核酸探針與待測核酸樣品中具有互補(bǔ)序列的單鏈DNA或RNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)，通過檢測標(biāo)記信號即可檢測特定的核苷酸片段。

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!基本方法

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁!DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁!2022/12/10四川大學(xué)華西公衛(wèi)裴曉方52KaryMullis1993年因此榮獲諾貝爾化學(xué)獎

聚合酶鏈反應(yīng)是在體外酶促擴(kuò)增特定DNA或RNA片段的技術(shù)。

由變性、退火

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延伸三個基本步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)五要素的優(yōu)化1、多聚核苷酸引物2、TaqDNA聚合酶3、dNTP（三磷酸脫氧核苷酸）4、模板核酸5、緩沖液DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁!RFLP與PCR-RFLP的應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌IS6110-RFLP分析厭氧菌16SrRNA基因PCR-RFLP分析其他DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁!DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁!DNA多態(tài)性分析常用的方法

限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(AFLP)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析技術(shù)(RAPD)細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)(rep-PCR)脈沖場凝膠電泳(PFGE)。。。。。。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁!AFLP技術(shù)的發(fā)明DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁!補(bǔ)充原理圖AFLP原理和操作流程圖DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁!例子：EWGLI制定的軍團(tuán)菌AFLP分型標(biāo)準(zhǔn)方法1.細(xì)菌培養(yǎng)和模板制備初次分離的軍團(tuán)菌單個菌株在BCYE-α瓊脂平板上二次傳代，35~37℃培養(yǎng)2~3d，確定為純培養(yǎng)。挑取次代純培養(yǎng)菌落用NucleonBACC2配套DNA提取液，RNaseA酶消化后提取基因組DNA。在260nm吸光度測定基因組DNA濃度。

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第58頁!3.PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用處理過的固化Taq酶珠，反應(yīng)體系包括模板DNA，選擇性引物（AFLP-PstⅠ-G：5’-GACTGCGTACATGCAGG-3’），dNTP，2.5mmol/LMgCl2。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃1min，60℃1min，72℃2.5min，循環(huán)33次。

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第59頁!5.數(shù)據(jù)分析將未知型在EWGLI建立的軍團(tuán)菌AFLP型數(shù)據(jù)庫中分析，聚類分析以條帶的選擇為基礎(chǔ)，分群分析通過DICE系數(shù)和應(yīng)用平均數(shù)的非加權(quán)成組配對法（UDGMA）。條帶位置容許誤差=2%，最優(yōu)化位置=0.5%?？煞治?00bp~2500bp的DNA擴(kuò)增片段。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第60頁!影響因素1.限制性內(nèi)切酶（1）一般采用雙酶切（2）由一個高頻內(nèi)切酶和一個低頻內(nèi)切酶組成（3）一般高（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)的基因組選擇識別位點(diǎn)富含（G+C）的內(nèi)切酶組合；低（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)的基因組選擇識別位點(diǎn)富含AT的內(nèi)切酶組合（4）酶切反應(yīng)對模板質(zhì)量要求很高（5）酶切時間1～3h（6）DNA含量一般0.5μg左右，DNA含量不應(yīng)太高

DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第61頁!補(bǔ)充原理圖AFLP原理和操作流程圖DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第62頁!補(bǔ)充原理圖AFLP原理和操作流程圖DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第63頁!4.擴(kuò)增條件AFLP反應(yīng)條件與常規(guī)PCR主要不同之處是采用溫度梯度PCR，即PCR始于高溫復(fù)性（一般采用65℃，比常規(guī)PCR退火溫度高10℃左右）以期獲得最佳選擇性，以后退火溫度逐步降低（每循環(huán)降低0.7℃），一直降到最適退火溫度，然后在這個溫度下完成其余PCR循環(huán)。對于復(fù)雜基因，一般采用兩步法擴(kuò)增。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第64頁!AFLPATESR:TOWARDSANINTERNATIONALSTANDARDA.butzleriC.coliC.jejuniDNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第65頁!DNA多態(tài)性分析常用的方法

限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(AFLP)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析技術(shù)(RAPD)細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)(rep-PCR)脈沖場凝膠電泳(PFGE)。。。。。。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第66頁!基本原理模板DNA經(jīng)92～94℃變性解鏈后，在較低溫度下退火，此時，有許多位點(diǎn)能與隨機(jī)合成的短引物互補(bǔ)而形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果某兩位點(diǎn)間在可擴(kuò)增范圍之內(nèi)，且分別位于互補(bǔ)的兩條單鏈上，并且與引物的3’端相對應(yīng)，就可以通過PCR得到一個擴(kuò)增產(chǎn)物。DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第67頁!總DNA提取隨機(jī)引物合成PCR擴(kuò)增隨機(jī)引物篩選電泳檢測圖譜分析基本程序DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第68頁!細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)repetitive-elementPCR,rep-PCR——一種基于PCR的DNA標(biāo)記技術(shù)DNA多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義共78頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第69頁!rep-PCR-短重復(fù)序列

目前研究最多、最常用的細(xì)菌基因組短重復(fù)序列有：基因外重復(fù)回文序列（RepetitiveIntergenicPalindr