3 檳榔花中酚類物質(zhì)對紫外損傷HSF細(xì)胞的保護(hù)作用

3檳榔花中酚類物質(zhì)對紫外損傷HSF細(xì)胞的保護(hù)作用3.1材料與方法3.1.1材料與試劑表兒茶素、沒食子酸、蘆丁和香豆酸，美國sigma公司；人皮膚成纖維細(xì)胞HSF，中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供；MTT、二甲基亞楓(DMSO)，美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶(Trypsin)，美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司；煙酰胺腺嘌吟二核苷酸(NADH)，乙酰輔酶A(acetyl-CoA)，美國Gibco公司，其他均為AR級試劑。3.1.2主要儀器熒光測讀儀(ThermoscientificvarioskanascentFL)；CO2培養(yǎng)箱(WJ-185I)；倒置顯微鏡(leica)；離心機(TDZ4-WS)；超凈工作臺(ZHJH-1109B)等。3.1.3實驗方法(1)紫外損傷模型的建立HSF細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2,溫度37°C，飽和濕度。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，用0.25%胰酶消化后用吸管吹打成單細(xì)胞懸液，以2x105個/mL的密度接種于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)。實驗分為正常對照組、紫外照射組(照射時間分別為1h，2h，3h)。首先吸除各細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，PBS沖洗一次后加入700pLPBS覆蓋底面避免干燥，紫外照射組放入20W短波紫外燈下照，照射距離為20cm，正常對照組不經(jīng)過紫外照射。紫外照射結(jié)束后，采用MTT法測定各組細(xì)胞存活率。⑵酚類物質(zhì)對HSF細(xì)胞紫外損傷的保護(hù)作用實驗分為正常對照組、紫外照射組、酚類保護(hù)組。實驗分組后，吸除各細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，PBS沖洗一次后加入700pLPBS覆蓋底面避免干燥，紫外照射組和酚類保護(hù)組放入20W短波紫外燈下照射3.5h，照射距離為20cm，正常對照組不經(jīng)過紫外照射。紫外照射結(jié)束后，采用MTT法測定各組細(xì)胞存活率。采用的酚類物質(zhì)包括：表兒茶素，沒食子酸，香豆酸、蘆丁。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，表兒茶素的作用濃度確定為1、2.5pg/mL，沒食子酸作用濃度1、5ug/ml,香豆酸的作用濃度為1、10pg/mL，蘆丁的作用濃度1、10ug/ml。線粒體膜腫脹度檢測收集分組處理后的細(xì)胞，8000rpm離心5min，放入冰箱中反復(fù)凍融三次。考馬斯亮藍(lán)染色法測定線粒體蛋白濃度，取50pg蛋白加入到總體積為200pL的反應(yīng)緩沖液中(250mmol/L蔗糖、5mmol/LKH2P04>3mmol/L琥珀酸鈉，pH7.2)，混勻后記錄520nm處吸光度值，測定過程保持25。。恒溫［21-22］。線粒體標(biāo)志性酶LDH和CS活性測定［28-29］啻匕酸脫氫酶(LDH)的活性測定開啟預(yù)熱分光光度計，取435ul緩沖液(80mMTris、200MmNaCl,pH7.5),加入50ul0.20MmNADH,以及收集分組處理后的細(xì)胞10ul，再加入5ul丙酮酸，迅速混勻，并快速置入分光光度計中，在A340nm處每隔30s記錄一個數(shù)值，連續(xù)記錄10min。以對照組的酶活為100%計，紫外組和酚類保護(hù)組酶活與對照組相比較，計算其相對酶活。②寧檬酸合酶(CS)的活性測定開啟預(yù)熱分光光度計，將波長設(shè)置為412nm，在1ml比色杯中加入435ul緩沖液(100mMTris-HCl,PH8.0),加入20ul5mMDTNB、5uLTriton、20ul乙酰輔酶A，以及10ul收集分組處理后的細(xì)胞，混勻后置于分光光度計中。以此為本底，調(diào)零，然后再在比色杯中加入10ul草酰乙酸，抽吸混勻，每隔10s記錄一個數(shù)據(jù)，共記錄2分鐘。以對照組的酶活為100%計，紫外組和酚類保護(hù)組酶活與對照組相比較，計算其相對酶活。⑸線粒體超氧自由基的測定用IsolationBufferB稀釋線粒體蛋白至3.2ug/ml的濃度，混勻。加樣步驟("-"為緩沖液補足)：對照1對照2處理后的細(xì)胞液緩沖液(150ul)+++線粒體蛋白(25ul)--+NBT(25ul)-++將其放在振搖床上15-60分鐘，然后在A570nm處測吸光度，每隔15分測一次。3.2結(jié)果與分析3.2.1紫外線對細(xì)胞的紫外損傷作用紫外輻射是電磁波譜中介于電離輻射和可見光輻射之間的部分，其波長介于100-400nm之間。它對細(xì)胞有一定的殺傷作用，尤其會引起DNA損傷，還可引起細(xì)胞DNA斷裂和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)以及染色體畸變［3。。為了建立紫外線對HSF細(xì)胞的氧化損傷模型，采用不同照射時間（終時間為0h、1h、2h、3h）處理HSF細(xì)胞，細(xì)胞存活率的結(jié)果見圖3。隨著照射時間增長，細(xì)胞存活率逐漸減低，且呈時間依賴性。紫外照射細(xì)胞2h后，HSF細(xì)胞死亡率達(dá)到（65.02±0.56）%，故選擇此照射時長建立模型。圖3不同紫外照射時長對HSF細(xì)胞存活率的影響3.2.2酚類物質(zhì)對紫外損傷的HSF細(xì)胞的保護(hù)作用在檳榔花中4種主要酚類物質(zhì)（表兒茶素、沒食子酸、香豆酸、蘆?。┑谋Ｗo(hù)下，HSF細(xì)胞在紫外損傷2h后，細(xì)胞存活率的結(jié)果見圖4。如圖4所示，表兒茶素濃度為1?2.5四g/mL時，可將細(xì)胞存活率提高2.83?34.56%，沒食子酸濃度為1?5四g/mL時，可將細(xì)胞存活率提高7.89?52.31%，香豆酸濃度為1?10四g/mL時，對HSF細(xì)胞沒有明顯的保護(hù)作用。蘆丁濃度為1?10四g/mL時，對HSF細(xì)胞沒有明顯的保護(hù)作用，而且高濃度的香豆酸會引起細(xì)胞死亡率的升高。綜上所述，檳榔花中主要的酚類物質(zhì)表兒茶素和沒食子酸對紫外損傷HSF細(xì)胞圖4檳榔花中四種酚類物質(zhì)對紫外損傷HSF細(xì)胞存活率的影響3.2.3細(xì)胞形態(tài)觀察細(xì)胞結(jié)束培養(yǎng)后，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。HSF一空白對照組HSF一紫外損傷組HSF-保護(hù)組，表兒茶素1ug/mlHSF-保護(hù)組，表兒茶素2.5ug/mlHSF-保護(hù)組，沒食子酸5ug/mlHSF-保護(hù)組，沒食子酸1ug/ml相差倒置顯微鏡下觀察到，正常的人皮膚成纖維細(xì)胞為梭狀，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、飽滿。紫外損傷后，細(xì)胞增殖速度變慢，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，逐漸皺縮，而經(jīng)表兒茶素和沒食子酸保護(hù)后，損傷的形態(tài)逐漸變得正常，表兒茶素2.5ug/ml和沒食子酸5ug/ml保護(hù)組細(xì)胞形態(tài)時已接近正常細(xì)胞的形態(tài)。3.2.4酚類物質(zhì)對細(xì)胞線粒體膜腫脹度的影響由圖5可知，紫外照射2h后，可損傷HSF細(xì)胞的線粒體膜，表現(xiàn)為A520nmmu值(即線粒體腫脹)降低，表兒茶素和沒食子酸可抑制線粒體膜的腫脹度的降低，表明線粒體膜受到了保護(hù)。圖5表兒茶素和沒食子酸對HSF細(xì)胞線粒體膜腫脹度的影響3.2.5酚類物質(zhì)對細(xì)胞中乳酸脫氫酶(LDH)圖5表兒茶素和沒食子酸對HSF細(xì)胞線粒體膜腫脹度的影響為了明確表兒茶素和沒食子酸對紫外照射引起的HSF細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，檢測細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶和檸檬酸合酶的活性。通過對標(biāo)志酶LDH/CS活性的測定，表明HSF細(xì)胞中線粒體的功能完好性。在340nm處測吸光值，其中根據(jù)吸光值的下降，便可測得反應(yīng)速率，表征LDH的活性。由圖6可知，紫外照射2h

后，可影響HSF細(xì)胞的乳酸脫氫酶的活性，表現(xiàn)為A340nm值（乳酸脫氫酶活性）降低，紫外模型組僅為對照組的12.81%，表兒茶素和沒食子酸可抑制乳酸脫氫酶的活性的降低。表兒茶素作用后，較紫外模型組有明顯升高，酶活性提高了38.74%-45.36%，沒食子酸作用后，較紫外模型組升高，酶活性提高了30.05%-79.02%。在412nm處吸光值的增加可用以確定反應(yīng)速率，以表示檸檬酸合酶的活性。由圖7可知，紫外照射2h后，可影響HSF細(xì)胞中檸檬酸合酶的活性，表現(xiàn)為A412nm值（檸檬酸合酶活性）降低，紫外模型組僅為對照組的7.06%，表兒茶素和沒食子酸可抑制檸檬酸合酶的活性的降低。表兒茶素作用后，較紫外模型組有明顯升高，酶活性為26.64%-43.25%；沒食子酸作用后，較紫外模型組也有明顯升高，酶活性為10.95%-35.07%。根據(jù)圖6、7，表明表兒茶素和沒食子酸對HSF細(xì)胞內(nèi)線粒體的功能完好性都有保護(hù)作用，也就是說對紫外損傷HSF細(xì)胞有保護(hù)作用。0.0050.00450.0040.00350.0030.00250.0020.00150.0010.0005圖6表兒茶素和沒食子酸對圖6表兒茶素和沒食子酸對HSF細(xì)胞中LDH活性的影響0.010.0090.0080.0070.0060.0050.0040.0030.0020.001luc/al表兒拳親0.010.0090.0080.0070.0060.0050.0040.0030.0020.001luc/al表兒拳親I.□ue/oI表JL拳玄InE/0.1

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沒食亍敏3.2.6酚類物質(zhì)對細(xì)胞中線粒體超氧自由基含量的影響細(xì)胞中的超氧自由基其可引發(fā)DNA損傷、脂質(zhì)的過氧化以及蛋白質(zhì)的氧化等。線粒體的電子傳遞鏈在呼吸底物存在條件下，生成的未成對電子與氧氣結(jié)合生成超氧陰離子。其與四唑鹽NBT反應(yīng)，生成的甲臌類顯色物在570nm處有特征吸收。通過測定顯色物的吸光值，可以確定線粒體生成的超氧化物的含量［31。如圖8,紫外照射2h后，紫外模型組的吸光值明顯升高，而加入表兒茶素和沒食子酸進(jìn)行保護(hù)后，A570nm處吸光值較紫外模型組要降低，說明表兒茶素和沒食子酸能降低紫外損傷引起的細(xì)胞內(nèi)超氧自由基的升高。圖8表兒茶素和沒食子酸對HSF細(xì)胞中線粒體超氧自由基含量的影響3.3討論圖8表兒茶素和沒食子酸對HSF細(xì)胞中線粒體超氧自由基含量的影響本實驗通過構(gòu)建紫外照射對HSF細(xì)胞的損傷模型，探討檳榔花中主要的酚類物質(zhì)對HSF細(xì)胞的紫外損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明表兒茶素和沒食子酸對HSF細(xì)胞具有保護(hù)作用，而香豆、蘆丁對HSF細(xì)胞沒有保護(hù)作用。實驗結(jié)果進(jìn)一步明確了檳榔花多酚的抗紫外損傷作用，進(jìn)而為檳榔花多酚類物質(zhì)的利用提供新思路。細(xì)胞內(nèi)線粒體的各項表征能夠間接表明HSF細(xì)胞受損傷和被保護(hù)的程度，線粒體掌控著細(xì)胞的死亡過程。近十多年的研究指出，線粒體是調(diào)控細(xì)胞的程序性死亡?！暗蛲?(apoptosis)過程的關(guān)鍵因素。在凋亡信號的刺激下，線粒體mPTP開放、發(fā)生線粒體腫脹，膜電位降低，外膜破裂后釋放出內(nèi)外膜間隙中的諸多凋亡效應(yīng)因子，起到了凋亡過程的“主開關(guān)”作用［32］，破壞細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)與功能，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡El。實驗發(fā)現(xiàn)紫外照射可導(dǎo)致HSF細(xì)胞線粒體膜腫脹度下降，使線粒體功能受到損傷，而表兒茶素和沒食子酸均能降低紫外照射引起的這種損傷。實驗還發(fā)現(xiàn)紫外照射會使線粒體標(biāo)示性酶一乳酸脫氫酶(LDH)和檸檬酸合酶(CS)的活性下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體的功能完整性受損，而表兒茶素和沒食子酸均能降低這種損傷。線粒體是細(xì)胞內(nèi)主要的活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)來源和細(xì)