宏基因組測序在臨床中的應(yīng)用mNGS

宏基因組測序mNGS在臨床中的應(yīng)用2022年3月1日mNGS基本概念1mNGS臨床病原菌檢測背景2mNGS在臨床上的應(yīng)用3報告解讀4目錄CONTENTS第一節(jié)mNGS基本概念宏基因組宏基因組（Metagenome）:廣義宏基因組是指特定環(huán)境下所有生物遺傳物質(zhì)的總和。狹義宏基因組是指特定環(huán)境樣品中細菌和真菌的基因組總和。宏基因組測序mNGSNGS：也稱高通量測序，是一種可以同時對數(shù)十萬到數(shù)百萬條DNA分子序列進行讀取的測序技術(shù)。mNGS：m指宏基因組，也稱元基因組，是標(biāo)本中全部生物（人、微生物）基因組的總稱。mNGS指宏基因組二代測序，以特定環(huán)境中整個微生物群落作為研究對象，利用高通量測序平臺進行基因組DNA和RNA測序，分析所有微生物組成、種類和活性等。宏基因組測序檢測范圍宏基因組檢測原理mNGS是利用宏基因組學(xué)原理，提取感染部位樣本中的核酸，采用常規(guī)文庫構(gòu)建流程，利用二代高通量測序平臺進行核酸測序，與微生物專用數(shù)據(jù)庫進行比對分析，獲得疑似致病微生物的種屬信息，并提供全面深入的報告參數(shù)。樣本采集：根據(jù)不同采樣方法收集感染部位的樣本核酸提?。豪迷噭┖袑Σ杉臉颖具M行核酸提取高通量測序：構(gòu)建好常規(guī)文庫后，利用高通量測序平臺進行測序生物信息分析：下機數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理質(zhì)檢合格后，與微生物專用數(shù)據(jù)庫進行比對分析出具檢測結(jié)果：獲得疑似致病微生物的種屬信息mNGS檢測步驟傳統(tǒng)方法VS宏基因組目前可培養(yǎng)的微生物極少未培養(yǎng)細菌達93.5%未培養(yǎng)古菌達98.3%傳統(tǒng)病原檢測方法宏基因組檢測方法細菌/真菌以培養(yǎng)為主，陽性率僅有15-20%，需要3-5天報告時間無偏性病原體廣覆蓋（細菌、真菌、病毒、寄生蟲），靈敏度高病毒以PCR檢測與血清檢測為主，檢測目標(biāo)狹窄，靶標(biāo)固定深入提供病原鑒定，分型難以檢測新發(fā)/罕見病原，難以檢測疑難混合感染以序列為基礎(chǔ)，可檢測新發(fā)病原體，并進行溯源分類診斷方法陽性率耗時通量收費涂片鏡檢＜10%1小時1種微生物15細菌培養(yǎng)后質(zhì)譜鑒定＜10%3-14天幾十種微生物＞240抗原抗體檢測＜10%3-5天1種微生物20-60PCR檢測10%-30%2小時-3天1種微生物60-80多重PCR檢測10%-30%2小時-5天6-33種微生物1000-2400mNGS50%-80%1-3天1萬-2萬種微生物4000-6000其他檢測方法VS宏基因組靶標(biāo)單一經(jīng)驗猜測培養(yǎng)率低釣魚式傳統(tǒng)檢測VS全面覆蓋無需預(yù)設(shè)無需培養(yǎng)一網(wǎng)打盡mNGS是不是？是什么？傳統(tǒng)方法VS宏基因組第二節(jié)mNGS臨床病原菌檢測背景感染性疾病威脅人類健康WHO全球每年約有1500萬人死于感染，占全球總死亡人數(shù)25%中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染膿毒血癥下呼吸道感染發(fā)病人數(shù)＞500萬/年患者人數(shù)＞568萬/年發(fā)病人數(shù)＞1000萬/年死亡率17-70%死亡率28-50%死亡率30%50-60%病因不明40-50%病因不明15-62%病因不明病因不明導(dǎo)致抗生素濫用病原微生物（病原體）是指可以侵犯人體，引起感染甚至傳染病的微生物，其中以細菌和病毒的危害性最大。近年來，抗菌藥物濫用致使細菌耐藥，病原微生物感染已成為全球關(guān)注的焦點。全球每年約70萬人死于抗生素耐藥中國住院患者使用抗生素比例約80%-90%兒童發(fā)生感染性疾病居多，也是應(yīng)用抗菌藥物最多的群體。我國兒科抗菌藥物使用與國外比較：1.抗菌藥物使用強度高2.用藥種類多3.藥物抗菌譜廣4.注射用藥比例高5.新型、昂貴、光譜的第三代頭孢菌素、β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑類藥物使用逐年增加。技術(shù)背景樣本培養(yǎng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)血清抗原檢測耗時長操作復(fù)雜檢測單一陽性率低存在不可培養(yǎng)病原體傳統(tǒng)檢測方法病原檢測范圍廣標(biāo)本檢測類型多可檢測混合感染可檢測罕見特殊感染可檢測低濃度感染病原技術(shù)背景病原學(xué)診斷是感染性疾病診治中的重要環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷是臨床醫(yī)師根據(jù)患者臨床表現(xiàn)做出鑒別診斷，并進行針對性檢測，通常一項檢測只能對應(yīng)一種病原體；宏基因組學(xué)第二代測序技術(shù)（metagenomicsnextgenerationsequencing，mNGS；以下簡稱二代測序）因其覆蓋度廣、時效性強等特點越來越多地被應(yīng)用于臨床感染性疾病的精準(zhǔn)診斷。第三節(jié)mNGS在臨床上的應(yīng)用mNGS在感染性疾病領(lǐng)域中的實際應(yīng)用1)病情危重需要盡快明確病原體；2)特殊病人如免疫抑制宿主，合并基礎(chǔ)疾病，反復(fù)住院的重癥感染患者需要盡快明確病原體；3)傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)反復(fù)陰性且治療效果不佳；4)疑似新發(fā)病原體，臨床上提示可能有一定的傳染性；5)疑似特殊病原體感染；6)長期發(fā)熱和／或伴有其他臨床癥狀，病因不明的感染。mNGS在感染性疾病領(lǐng)域中的研究進展-里程碑論文

[影響因子]70.67[發(fā)表時間]2014.062014年，一名患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的14歲男童在4個月的時間里三次到醫(yī)療機構(gòu)就診，發(fā)燒和頭痛發(fā)展為腦積水和癲癇持續(xù)狀態(tài)，導(dǎo)致昏迷。通過多種抗菌藥物仍然無法改善腦積水和癲癇狀態(tài)，腦活檢在內(nèi)的診斷無法找到病因。研究者通過腦脊液（CSF）宏基因組測序檢出圣地羅西鉤端螺旋體序列，隨后通過更換使用青霉素進行治療，男童32天后痊愈出院。NGS檢測病原體：鉤端螺旋體，占比0.016%；驗證：靶向PCR和Sanger測序治療調(diào)整：改用青霉素G治療，32天出院mNGS在感染性疾病領(lǐng)域中的研究進展

[影響因子]16.494[發(fā)表時間]2017.07選取22名因急性呼吸道疾病而住院的造血細胞移植患者，進行支氣管鏡檢和支氣管肺泡灌洗，對灌洗樣品進行微生物分析。利用臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)方法在7個患者的支氣管肺泡灌洗樣品中檢測出微生物，其中6個患者的微生物被認為是病原體，這些微生物均可利用宏基因組下一代測序方法（mNGS）檢測到。mNGS可檢測出人冠狀病毒（HCOV）229E及人輪狀病毒A（HRV-A），這些病毒是社區(qū)獲得性肺炎的主要誘因，臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)方法無法檢測出。[影響因子]9.055[發(fā)表時間]2018.11研究納入了2511份標(biāo)本（包括傳染病、非傳染病和未確診病例），在宏基因組測序和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法之間比較診斷性能宏基因組測序診斷傳染病的敏感性和特異性分別是50.7%和85.7%，都顯著優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，特別是病原為結(jié)核分枝桿菌、病毒、厭氧菌和真菌的感染；重要的是，傳統(tǒng)方法無法確定病原的可由宏基因組測序確定，有43例因此改變了診斷結(jié)果；為了實現(xiàn)該方法分別構(gòu)造了病毒、細菌、真菌和寄生蟲的參考序列數(shù)據(jù)庫。mNGS在感染性疾病領(lǐng)域中的研究進展

新型冠狀病毒的鑒定使用mNGS方法從支氣管肺泡灌洗液（BALF）中提取RNA。迅速鑒定出一種新的冠狀病毒（根據(jù)世界衛(wèi)生組織的公告命名為2019nCoV），它是樣本中唯一的高豐度病原體（占總RNA序列的1.5%和0.62%）基于RNA的mNGS方法快速鑒定和鑒定一種潛在的病原體，這對疾病控制和預(yù)防具有重要意義?；诤昊蚪M新一代測序技術(shù)(mNGS)不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，直接對臨床樣本中的核酸進行高通量測序，然后與數(shù)據(jù)庫進行比對分析，根據(jù)比對到的序列信息來判斷樣本包含的病原微生物種類，能夠快速、客觀的檢測臨床樣本中的較多病原微生物（包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲），且無需特異性擴增，尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷。國內(nèi)首篇mNGS檢測應(yīng)用專家共識mNGS相關(guān)共識/指南2021年國家衛(wèi)健委最新發(fā)布指導(dǎo)意見進一步明確：基因測序技術(shù)被列入常用病原學(xué)檢測方法范圍。該技術(shù)具有速度快、通量高、敏感性高、病原覆蓋范圍廣等優(yōu)勢。在罕見、未知病原體鑒定方面發(fā)揮著重要作用。關(guān)于mNGS衛(wèi)健委發(fā)文檢測樣本要求第四節(jié)mNGS檢測結(jié)果解讀mNGS檢測結(jié)果解讀1）解讀報告考慮如下參數(shù)：測序質(zhì)量（是否去除低復(fù)雜度、低質(zhì)量序列，Q20、Q30等）、讀長、特異性讀長、覆蓋率、深度、豐度、微生物序列的數(shù)據(jù)量、閾值等2）mNGS檢測報告中，建議結(jié)合不同標(biāo)本類型與檢出病原微生物的種類進行解讀，區(qū)分無菌部位（血、無菌體液、組織、骨髓等）與正常有菌部位（如呼吸道、尿液、開放性傷口）。確認致病微生物時，應(yīng)考慮檢出微生物是否為感染部位的潛在病原。如腦脊液檢出新型隱球菌，呼吸道標(biāo)本檢出結(jié)核分枝桿菌、腺病毒、流感病毒，關(guān)節(jié)液或血液標(biāo)本檢出布魯菌屬，均可認為是致病微生物。注意排除常見定植菌、污染菌與工程菌的影響。3）血漿樣本對cfDNA進行mNGS檢測時，建議從臨床的角度鑒別檢出序列屬于致病微生物、樣本污染、死亡微生物裂解，還是定植菌群所致的一過性菌血癥mNGS檢測結(jié)果解讀4）mNGS報告中常規(guī)容易培養(yǎng)的病原菌，建議臨床醫(yī)師結(jié)合傳統(tǒng)方法，綜合判斷其臨床價值。5）建議對于在核酸提取過程中破壁困難的微生物，如分枝桿菌屬、諾卡菌屬、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隱球菌屬與雙相真菌）等，即使在檢測報告中讀長數(shù)較低，也要考慮其為致病微生物的可能，并采用其他方法驗證，如特異引物的PCR或一代測序等分子生物學(xué)檢測，G試驗，GM試驗，曲霉菌IgG抗體或隱球菌莢膜多糖抗原等血清學(xué)試驗。6）采用mNGS進行病原微生物鑒定的同時，可以考慮檢測耐藥基因，但需要將耐藥基因準(zhǔn)確定位到具體的病原體上以明確其臨床價值。即通過對mNGS測得序列進行具體病原體基因組組裝之后，確定耐藥基因位于哪個病原體上，位于質(zhì)粒上還是位于染色體上mNGS檢測結(jié)果解讀

7）mNGS對于新發(fā)或少見病原微生物的檢出具有重要價值。建議解讀報告單前應(yīng)了解比對數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容，明確其是否涵蓋少見病原或新發(fā)病原。檢出高致病性病原微生物，應(yīng)及時與臨床聯(lián)系。8）mNGS結(jié)果為陰性，對于排除感染常具有較好的陰性預(yù)測值。但對于某些病原微生物，如結(jié)核分枝桿菌等，原始樣本中含量較少，或核酸提取困難的病原微生物，應(yīng)考慮mNGS檢測靈敏度較低，陰性預(yù)測性差，并不一定優(yōu)于PCR等常規(guī)檢測方案9）建立mNGS病原診斷的閾值影響因素較多，包括測序平臺、測序流程、標(biāo)本類型、病原種類、患者狀況，目前尚無統(tǒng)一公認的閾值，建議各實驗室建立自已的閾值，并在臨床工作中加以驗證。mNGS檢測結(jié)果解讀10）不同病原微生物讀長對結(jié)果判斷的影響：同等條件下（相同微生物，相同標(biāo)本），如某一微生物檢出的讀長數(shù)量多，為致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因組大小不同（寄生蟲>真